郭春柳，黃曉曦

（中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院附屬海口醫(yī)院消化內(nèi)科，海南 ?？?570208）

肝硬化是由各種慢性肝損傷導(dǎo)致的終末階段，以假小葉形成、肝組織彌漫性纖維化和肝內(nèi)外血管增殖為病理特征。全世界每年約有100 萬人死于肝硬化并發(fā)癥，是全球第11 大最常見的死亡原因，嚴(yán)重威脅人類健康［1］。對于失代償期肝硬化，內(nèi)科治療效果欠佳，原位肝移植（orthotopic liver transplantation，OLT）被認(rèn)為是唯一有效的治療手段，但由于醫(yī)療費(fèi)用高昂、供肝來源短缺、術(shù)后并發(fā)癥多、終身免疫排斥等因素，極大地限制了OLT 在臨床中的廣泛應(yīng)用。因此，迫切需要尋找一種可以廣泛應(yīng)用且安全有效的替代方案。干細(xì)胞是一種具有自我更新和多向分化潛能的細(xì)胞，作為再生醫(yī)學(xué)的“種子”細(xì)胞，目前已經(jīng)在神經(jīng)［2］、血液［3］、心血管［4］、骨關(guān)節(jié)［5］等多個(gè)系統(tǒng)疾病中做了有益嘗試。干細(xì)胞在特定條件下可誘導(dǎo)分化為肝細(xì)胞，為肝硬化的治療提供了新的選擇，根據(jù)來源不同可分為肝源性肝干細(xì)胞和非肝源性肝干細(xì)胞。

1 肝源性肝干細(xì)胞

肝源性肝干細(xì)胞又稱為內(nèi)源性肝干細(xì)胞，主要包括小肝細(xì)胞（small hepatocyte-like progenitor cell，SHPC）、肝卵圓細(xì)胞（hepatic oval cell，HOC）、肝細(xì)胞（hepatocyte cell，HC）等，其 中 研 究 較 多 的 是HOC。

1.1 肝卵圓細(xì)胞（HOC）

HOC 又稱為肝祖細(xì)胞（hepatic progenitor cells，HPCs），是一種具有雙向分化潛能的干細(xì)胞，可在一定條件下誘導(dǎo)分化為肝細(xì)胞和膽管上皮細(xì)胞，因此，有可能成為肝細(xì)胞的再生來源。

研究表明，HPCs 對肝細(xì)胞再生有積極貢獻(xiàn)。Lu 等［6］通過定向刪除Mdm2 誘導(dǎo)肝細(xì)胞凋亡，然后將HPCs 移植到小鼠肝臟中，發(fā)現(xiàn)移植的HPCs 可通過分化為肝細(xì)胞和膽管細(xì)胞，從而使受損肝臟結(jié)構(gòu)和功能得到明顯改善。最近一項(xiàng)研究顯示，當(dāng)Lgr5+肝祖細(xì)胞的缺失時(shí)可增加CCl4誘導(dǎo)的肝纖維化，而當(dāng)肝細(xì)胞損傷或HGF 和Rspo1 聯(lián)合誘導(dǎo)產(chǎn)生更多的Lgr5+肝祖細(xì)胞時(shí)，可促進(jìn)肝功能障礙的恢復(fù)和減輕肝纖維化［7］。

HPCs 在肝臟中含量很低，且分離困難，近年來在體外分化HPCs 引起了人們的興趣。Katsuda等［8］利用Y-27632，a-83-01 和CHIR99021 的小分子混合物，在體外將大鼠的成熟肝細(xì)胞轉(zhuǎn)化為增殖性雙能細(xì)胞，稱為化學(xué)誘導(dǎo)肝祖細(xì)胞（CLiPs）。為了進(jìn)一步證實(shí)該技術(shù)在人肝細(xì)胞中的可行性，Kim等［9］從健康和病變的供肝中分離出人肝細(xì)胞，在EGF 和 HGF 的 作 用 下，利 用 A83-01 和CHIR99021（AC）兩種小分子聯(lián)合處理，成功將人肝細(xì)胞重編程為肝祖細(xì)胞，稱為人化學(xué)源肝祖細(xì)胞（hCdHs）。兩個(gè)研究均表明化學(xué)來源的HPCs 可在體內(nèi)外分化為成熟肝細(xì)胞和膽管上皮細(xì)胞，有效替換慢性損傷肝組織，并且可以穩(wěn)定培養(yǎng)。

HPCs 移植治療肝硬化的有效性在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中得到了初步證實(shí)。Awan 等［10］通過預(yù)處理將骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化為HPCs，并將其植入肝纖維化小鼠中，觀察到HPCs 可通過減少細(xì)胞凋亡和乳酸脫氫酶的釋放來改善肝功能。趙麗等［11］發(fā)現(xiàn)HPCs 移植可降低2.0%CCL4誘導(dǎo)的小鼠模型中ALT 和AST 活性及肝臟指數(shù)，提高生存率。但是移植后是否會出現(xiàn)副作用以及形成腫瘤目前仍不明確，有待進(jìn)一步研究。

2 非肝源性肝干細(xì)胞

非肝源性肝干細(xì)胞又稱為外源性肝干細(xì)胞，主要包括胚胎干細(xì)胞（embryonic stem cells，ESCs）、內(nèi)皮祖細(xì)胞（endothelial progenier cells，EPCs）、間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells，MSCs）、造血干細(xì)胞（hematopoietic stem cells，HSCs）和誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（induced pluripotent stem cells，iPSCs）等。

2.1 胚胎干細(xì)胞（ESCs）

ESCs 是早期胚胎或原始性腺中分離出來的一類細(xì)胞，具有無限增殖和分化形成各種組織細(xì)胞的潛力，在細(xì)胞替代治療方面具有廣闊的應(yīng)用前景。

利用ESCs 治療肝病也有相關(guān)研究，Tolosa等［12］將歐洲人類胚胎干細(xì)胞系（VAL9）移植到對乙酰氨基酚誘導(dǎo)的急性肝衰竭小鼠體內(nèi)，發(fā)現(xiàn)可以有效填充肝組織、恢復(fù)肝功能。最近的一項(xiàng)研究［13］利用納米材料建立了一個(gè)生長因子持續(xù)釋放系統(tǒng)，能夠持續(xù)促進(jìn)小鼠胚胎干細(xì)胞（mESCs）向肝細(xì)胞樣細(xì)胞（hepatocyte-like cells，HLCs）分化，并在體外培養(yǎng)中產(chǎn)生更多的功能性肝細(xì)胞，當(dāng)該系統(tǒng)處理的mESCs 移植到肝損傷小鼠后，可在體內(nèi)分化為HLCs，并對肝損傷有明顯的修復(fù)作用。

雖然ESCs 具有治療肝硬化的分子基礎(chǔ)，但由于免疫排斥、醫(yī)學(xué)倫理、致瘤性等因素的限制，目前尚未被批準(zhǔn)用于臨床治療。

2.2 內(nèi)皮祖細(xì)胞（EPCs）

EPCs 是未成熟的內(nèi)皮細(xì)胞，屬于多能干細(xì)胞，主要存在于骨髓、臍血和外周血中?？赏ㄟ^分化為成熟的內(nèi)皮細(xì)胞、釋放大量的營養(yǎng)因子和細(xì)胞保護(hù)因子，以及旁分泌效應(yīng)，促進(jìn)新血管生成和組織修復(fù)［14，15］。因此可能有益于肝硬化的治療。

基于EPCs 移植治療肝硬化在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中得到了廣 泛研究，Sakamoto 等［16］將骨髓源性EPCs 經(jīng)尾靜脈注射至大鼠肝硬化模型內(nèi)，每周1 次，連續(xù)4周，發(fā)現(xiàn)EPCs 移植可增加肝血流量，減輕肝纖維化及門靜脈壓力。另有研究顯示骨髓源性肝干細(xì)胞（BDHSCs）和骨髓源性內(nèi)皮祖細(xì)胞（BM-EPCs）聯(lián)合移植可顯著改善肝功能和肝纖維化，治療效果明顯優(yōu)于單一類型細(xì)胞移植，是一種很有前途的治療方法［17］。然而最近一項(xiàng)研究卻得出了相反的結(jié)論，該實(shí)驗(yàn)將肝硬化EPCs 移植至膽管結(jié)扎法制備的肝硬化大鼠體內(nèi)，結(jié)果顯示肝硬化EPCs 移植可促進(jìn)肝竇內(nèi)皮細(xì)胞（LSEC）分化和肝星狀細(xì)胞（HSC）激活，從而增加肝臟血管生成和肝纖維化，進(jìn)一步加重門靜脈高壓。造成這種結(jié)果的差異可能與肝硬化模型制備方法、EPCs 的來源不同有關(guān)。

為了進(jìn)一步評估EPCs 在臨床應(yīng)用中的可行性，D'avola 等［18］將EPCs 經(jīng)肝動(dòng)脈注射到11 例失代償期肝硬化患者體內(nèi)，隨訪12 個(gè)月，結(jié)果顯示終末期肝病評分模型顯著改善（P＝0.042），并且在90 d存活的9 例患者中，有5 例顯示肝靜脈氣壓梯度（HVPG）降低，隨訪期間無嚴(yán)重不良事件發(fā)生。目前正在進(jìn)行一項(xiàng)3 期隨機(jī)對照試驗(yàn)（clinicaltrials.gov 標(biāo)識符：NCT03109236），該試驗(yàn)可能提供關(guān)于基于EPCs 的治療終末期肝硬化患者的潛在臨床益處的確切數(shù)據(jù)。

2.3 間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）

MSCs 是一類來源于發(fā)育早期中胚層、具有自我復(fù)制和多向分化潛能的非造血干細(xì)胞，最常由骨髓中提取，也可以從脂肪組織、臍帶組織、肝臟、牙髓等多種組織中獲得。研究發(fā)現(xiàn)MSCs 能定向分化為HLCs，并對肝細(xì)胞發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)、抗炎、抗纖維化、抗氧化應(yīng)激和抗凋亡等作用［19］，是細(xì)胞替代法治療肝硬化最具有應(yīng)用價(jià)值的成體干細(xì)胞。

大量動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床研究顯示，MSCs 移植替代治療肝硬化具有顯著優(yōu)勢，鄭雪等［20］將骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）經(jīng)尾靜脈注射至肝纖維化大鼠體內(nèi)，觀察發(fā)現(xiàn)，移植組大鼠肝纖維間隔變窄、數(shù)量減少，肝小葉結(jié)構(gòu)恢復(fù)，肝臟內(nèi)Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白表達(dá)、ALT 和AST 水平低于對照組，且Alb 較之升高（P＜0.05），說明BMSCs 移植能有效改善肝纖維化和促進(jìn)肝功能恢復(fù)。Fang 等［21］將人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞（hUCMSCs）經(jīng)靜脈輸入至50 名乙肝肝硬化失代償期患者體內(nèi)，結(jié)果顯示移植組終末期肝病模型和Child-Pugh 評分的改善明顯優(yōu)于對照組，隨訪期間死亡率低于對照組。李靜等［22］對2017 年11 月前發(fā)表的MSC 移植治療肝硬化的RCT 進(jìn)行薈萃分析，共納入研究了394 例肝硬化患者，最后得出結(jié)論，MSCs 移植治療可顯著改善失代償期肝硬化患者的肝功能，降低病死率。

MSCs 可通過多種不同的途徑移植，而目前關(guān)于MSCs 移植治療肝纖維化的最佳途徑仍存在爭議。Idriss 等［23］認(rèn)為與脾內(nèi)移植相比，經(jīng)靜脈移植BMSCs 治 療 更 能 降 低IL-1β、IL-6 及INF-γ 等 基 因的表達(dá)，從而更有效的抑制炎癥反應(yīng)。Zheng 等［24］研究結(jié)果表明，通過尾靜脈和肝內(nèi)注射移植hUCMSCs 治療效果相當(dāng)。根據(jù)目前的研究，尚無統(tǒng)一的結(jié)論，仍需要進(jìn)一步研究。

MSCs 來源廣泛，BMSC 是目前研究最廣泛的間充質(zhì)干細(xì)胞，但存在對供體的潛在損傷以及可用數(shù)量少等問題，因此，尋找新的MSCs 來源成為近年來的研究熱點(diǎn)。

2.3.1 胎盤 Yu 等［25］通過尾靜脈將hPMSCs 移植至肝纖維化大鼠中，發(fā)現(xiàn)hPMSC 移植可通過降低TGF-β1 和α-SMA 表達(dá)，抑制肝星狀細(xì)胞的活化，從而修復(fù)肝纖維化，改善肝功能。

2.3.2 乳牙 Yamaza 等［26］將人乳牙干脫落干細(xì)胞（SHED）經(jīng)脾臟移植到CCL4 誘導(dǎo)的肝纖維化小鼠體內(nèi)，發(fā)現(xiàn)移植的SHED 可分化為肝細(xì)胞，并顯著降低致纖維化物質(zhì)和炎癥因子的水平，增強(qiáng)抗炎因子的表達(dá)，從而表現(xiàn)出抗纖維化和抗炎的作用。

2.3.3 月經(jīng)血 人的月經(jīng)血也是肝細(xì)胞的潛在來源，稱為月經(jīng)血來源干細(xì)胞（MenSCs）。與BMSCs相比，MenSCs 具有無創(chuàng)性收集過程、高增殖率、多能性和低免疫原性等優(yōu)點(diǎn)［27］，Chen 等［28］首次報(bào)道了MenSCs 移植治療小鼠肝纖維化的效果，結(jié)果表明，MenSCs 可以顯著改善肝功能，減少膠原蛋白沉積，并通過分泌單核細(xì)胞趨化蛋白-1、白介素-6、肝細(xì)胞生長因子和骨保護(hù)素等旁分泌細(xì)胞因子抑制LX-2細(xì)胞（肝星狀細(xì)胞）的增殖。

關(guān)于MSCs 移植治療的安全性一直是人們密切關(guān)注的問題，有研究表明，MSCs 移植后有可能分化成不需要的組織，包括骨和軟骨［29］，此外，還可能通過抑制抗腫瘤免疫應(yīng)答和促進(jìn)新生血管生成而促進(jìn)腫瘤生長和轉(zhuǎn)移［30］。因此，仍需要對MSCs 治療的動(dòng)物模型進(jìn)行持續(xù)監(jiān)測和長期隨訪，以確定其致癌作用和其他不利影響。

2.4 造血干細(xì)胞（HSCs）

HSCs 位于骨髓中，是血液系統(tǒng)中的成體干細(xì)胞，具有分化為血液和免疫系統(tǒng)所有細(xì)胞的能力［31］。骨髓中的HSCs 可在組織損傷或人工啟動(dòng)后動(dòng)員，離開骨髓并進(jìn)入血液，粒細(xì)胞集落刺激因子（G-CSF）是研究和使用最廣泛的動(dòng)員劑。與其他類型干細(xì)胞相比，HSCs 具有易于獲得、成本低、可來源于自體而無需使用免疫抑制劑等優(yōu)點(diǎn)。

近年來，基于HSCs 移植治療肝硬化的研究取得了顯著成果。King 等［32］將純化的HSCs 反復(fù)輸注于肝纖維化損傷的小鼠體內(nèi)，發(fā)現(xiàn)與對照組相比，HSCs 移植治療的小鼠肝臟瘢痕形成減少49.7%，并提示HSCs 通過促進(jìn)巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞募集來介導(dǎo)其抗纖維化作用，聯(lián)合應(yīng)用1-磷酸鞘氨醇受體激動(dòng)劑（FTY720）可增強(qiáng)這種作用。Guo 等［33］回顧性分析了282 例肝硬化患者接受自體HSCs 移植治療的遠(yuǎn)期臨床療效，發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組的存活時(shí)間明顯高于對照組，移植后1、2、3、5 年肝功能均有明顯改善。且兩組的肝癌總發(fā)生率無顯著性差異（21.1%vs20.4%）。另外有多項(xiàng)臨床研究也表明，HSCs 移植能有效地改善晚期肝硬化患者的肝功能、肝組織形態(tài)學(xué)以及提高患者的生命質(zhì)量［34-38］。然而近期英國一項(xiàng)多中心、隨機(jī)對照試驗(yàn)結(jié)果卻顯示，G-CSF或G-CSF 加HSCs 輸注并不能改善肝功能障礙或纖維化，此外還可能會增加患者發(fā)生不良事件的風(fēng)險(xiǎn)［42］。

整體而言，干細(xì)胞治療肝硬化是安全的，而導(dǎo)致治療效果不一致可能是由于研究人群、干細(xì)胞類型的差異所致。因此，HSCs 移植治療肝硬化患者的效果、遠(yuǎn)期安全性等仍有待進(jìn)一步探討及驗(yàn)證。

2.5 誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（iPSCs）

iPSCs 由研究者于2006 年首次發(fā)現(xiàn)［39］，是一種通過特定的介質(zhì)將成體細(xì)胞誘導(dǎo)并重新編程為未分化狀態(tài)的多能干細(xì)胞，具有與ESCs 相同的增殖和分化潛能，并同時(shí)避免了倫理問題［40］，是最有潛力的干細(xì)胞。

iPSCs 可在體外誘導(dǎo)分化為HLCs，是肝細(xì)胞的 潛 在 來 源，Takayama 等［41］將1 106 個(gè) 人 類iPS-HLCs 經(jīng)脾內(nèi)移植到急性和慢性肝衰竭模型小鼠體內(nèi)，觀察發(fā)現(xiàn)，移植小鼠的存活率和血清白蛋白水平顯著提高，并且提示人iPS-HLCs 的治療作用主要由肝細(xì)胞生長因子（HGF）的分泌來實(shí)現(xiàn)的。另外一項(xiàng)研究結(jié)果顯示人iPS-HLC 薄片移植可通過激活HGF/c-Met 信號，使肝細(xì)胞免于細(xì)胞死亡，從而改善肝損傷，并且對比發(fā)現(xiàn)人iPS-HLC 薄片移植的移植效率明顯高于脾內(nèi)移植［42］。

盡管iPSCs 避免了倫理問題和免疫排斥反應(yīng)，并在動(dòng)物試驗(yàn)中取得了一定成果，但仍面臨畸胎瘤形成的風(fēng)險(xiǎn)，限制了其在臨床中的應(yīng)用。

3 問題與展望

隨著近年來再生醫(yī)學(xué)的進(jìn)展，基于干細(xì)胞移植治療肝硬化展現(xiàn)了良好的應(yīng)用前景，并在基礎(chǔ)和臨床研究中取得了一定成果。但是在大規(guī)模應(yīng)用于臨床之前，仍有許多問題需要解決，比如干細(xì)胞移植治療肝硬化的具體機(jī)制尚未完全明確；能用于臨床治療的干細(xì)胞種類仍偏少；臨床試驗(yàn)中細(xì)胞制備、劑量、途徑、隨訪、療效等仍不統(tǒng)一；缺乏多中心、大樣本的隨機(jī)對照研究數(shù)據(jù)，證據(jù)等級有待提高。隨著技術(shù)和理論的逐步成熟，干細(xì)胞移植治療肝硬化將會更加安全、有效、便捷的展開。