張靜雯，李培杰

腎臟主要通過高腎血流量和耗氧量維持腎小球濾過率，是最容易受到缺血-再灌注損傷(IRI)影響的器官之一[1]，其中髓質(zhì)受影響程度較皮質(zhì)大[2]。腎缺血-再灌注損傷(RIRI)多繼發(fā)于腎移植、失血性休克、膿毒癥等疾病[3]，是急性腎損傷(acute renal injury， AKI)高發(fā)病率、高病死率的主要原因[4]。預計到2030年，腎臟疾病問題將成為全球第13大死亡原因[5]。RIRI如若不及時糾正，將會導致不可逆的腎損傷，隨之發(fā)展成為慢性腎臟病(chronic kidney disease， CKD)，嚴重時出現(xiàn)終末期腎病。缺血、缺氧導致線粒體代謝障礙，能量生成不足，在血流恢復后易于促進氧化應激、炎癥反應、細胞凋亡等，造成再灌注損傷[2, 6]。雖然RIRI的病理生理學尚未完全清楚，但總的來說始于原發(fā)性缺血性損傷，隨后是一系列壞死和凋亡。研究發(fā)現(xiàn)，在缺血性腎臟和隨后的再灌注過程中核因子-κB(NF-κB)通路的激活起到重要作用。為更好的了解和設計出更多的針對性治療方法，故本文將對NF-κB在RIRI中的主要機制及相關治療進展進行綜述。

1 NF-κB概述

1986年Sen等[7]從B淋巴細胞核提取物中發(fā)現(xiàn)一種蛋白，它是一種能與免疫球蛋白κ輕鏈基因的增強子κB序列(GGGACTTTCC)特異性結合的核蛋白因子，因而稱為NF-κB。NF-κB 是由RelA(p65)、RelB、c-Rel、p50、p52 五種蛋白質(zhì)組成的大家族。NF-κB 成員相互結合形成同源或異源二聚體，其中特殊的家族成員p50 和 p52分別是較大前體蛋白 p105 和 p100 的產(chǎn)物。NF-κB在靜息細胞胞質(zhì)中與κB抑制蛋白結合呈失活狀態(tài)，當多種信號刺激作用于細胞后，可引起NF-κB與κB抑制蛋白解離呈激活狀態(tài)，隨后NF-κB從胞質(zhì)中轉入到細胞核中發(fā)揮調(diào)控基因表達的作用[8]。NF-κB作為細胞中一種重要的轉錄調(diào)節(jié)因子, 是細胞內(nèi)信號轉導的中間樞紐, 可通過調(diào)控基因表達來參與機體炎癥反應、細胞凋亡、免疫反應、組織損傷與修復等多種生物進程[9]。就下游靶點而言，NF-κB家族成員的作用因環(huán)境和細胞類型的差異而不同[10]。NF-κB活性與AKI有關，有研究[11-12]發(fā)現(xiàn)，NF-κB抑制劑可降低AKI的嚴重程度。因此，更好地理解腎缺血-再灌注中啟動和調(diào)節(jié)NF-κB通路的潛在機制十分重要。

2 NF-κB在RIRI中的作用機制

2.1NF-κB與炎癥反應 NF-κB是一種重要的核轉錄因子，可作為細胞介素和趨化因子基因表達的調(diào)節(jié)者，在分子和基因水平上調(diào)節(jié)IRI過程中一些炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生及免疫反應，誘導多種炎性因子如腫瘤壞死因子α(TNF-α)、白細胞介素(IL)-1β的表達，進而引發(fā)炎癥級聯(lián)反應[13]。RIRI中的首要表現(xiàn)是缺氧，低氧可直接誘導腎臟系統(tǒng)中NF-κB活化，導致缺血期間炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生[14]。活性氧(ROS)是損傷細胞在再灌注過程中釋放的重要因子[15]，Toll樣受體(TLR)和IL-1R具有相同的細胞內(nèi)結構域，可以激活NF-κB系統(tǒng)，導致促炎細胞因子的表達，如IL-1家族成員(包括IL-1、IL-8和IL-36)[16-17]，從而啟動RIRI的炎癥反應。多項研究[18-19]發(fā)現(xiàn)，激活NF-κB/核因子-κB抑制蛋白(IκB)信號通路，增加促炎因子釋放，加劇炎癥反應；抑制NF-κB能明顯減輕炎癥反應。最近有證據(jù)表明，內(nèi)源性合成的微小RNA(miRNA)在缺血-再灌注后的炎癥反應中可能發(fā)揮作用，并被證明是通過調(diào)節(jié)NF-κB的激活來實現(xiàn)的。Chen等[20]結果表明，miR-21可以通過抑制TLR信號通路中的兩個關鍵因子髓樣細胞分化因子(MyD88)和IL-1受體相關激酶1(IRAK1)來抑制炎癥反應，從而減弱NF-κB信號。此外，NF-κB激活的miR-125b轉錄也可能參與缺血-再灌注的病理過程[21]。抑制NF-κB也被證明可以減少炎癥反應和纖維化，進一步證實了NF-κB作為腎臟炎癥介質(zhì)的重要性[10]。這些途徑可能是調(diào)節(jié)腎臟IRI的靶點，并可能成為RIRI新的診斷生物標志物[13]。因此以NF-κB為靶點研究的抗炎藥物和手段在治療多種疾病方面具有廣闊前景。

2.2NF-κB與氧化應激 腎缺血-再灌注過程中，觀察到許多分子和細胞的修飾，如組織損傷導致ROS、細胞因子、趨化因子和白細胞募集的產(chǎn)生，這些都可由NF-κB信號通路激活[22]。正常情況下，機體酶促反應、信號轉導、蛋白合成等過程中都需要呼吸鏈產(chǎn)生的ROS參與，然后在過氧化氫酶的作用下生成水和氧氣，同時維持體內(nèi)自由基和抗氧化酶的平衡。在缺血階段，因細胞缺氧可出現(xiàn)代謝底物能量障礙、細胞致敏；在再灌注階段，線粒體內(nèi)氧負荷增加，還原性單電子增多，超氧陰離子產(chǎn)生增加，多種氧化酶活化、自由基清除能力下降，導致其生成超過體內(nèi)清除能力，引起致敏細胞更易發(fā)生氧化應激損傷[23]。缺血損傷后不久，氧化酶活性升高，這可能來源于巨噬細胞或中性粒細胞[24]。有研究[25-26]表明，缺血-再灌注導致腎組織中性粒細胞浸潤，并刺激氧化應激過程產(chǎn)生ROS。通過活化NF-κB途徑，氧化應激可直接或間接影響腎臟損傷，導致細胞凋亡、壞死、纖維化、組織損傷進展和腎功能障礙[27]。此外，炎癥細胞還可以通過ROS誘導缺氧后的細胞損傷，進而通過觸發(fā)凋亡和壞死途徑導致腎小管上皮細胞損傷或凋亡[28]。因此，ROS被認為既是介質(zhì)又是信號分子[26]。據(jù)報道[29]，氧化應激還可增加NF-κB和促炎因子、黏附分子水平。同時研究[30-31]發(fā)現(xiàn)，循環(huán)中ROS和促炎因子水平的增加會導致遠處器官的氧化應激和炎癥。因此，抑制氧化應激或減少氧自由基生成也是RIRI期間保護腎臟損傷的重要策略。

2.3NF-κB與細胞凋亡 研究發(fā)現(xiàn)，活化的NF-κB參與多種凋亡相關基因的轉錄調(diào)節(jié)，具有抗凋亡和促凋亡兩種作用?？沟蛲龌?如B淋巴細胞瘤(Bcl-2)、大分子B淋巴細胞瘤(Bcl-xL)等均受NF-κB調(diào)節(jié)。NF-κB在腎缺血-再灌注中的抗凋亡作用能保護對腎小管上皮細胞的損傷，可能機制為: ①抗凋亡蛋白Bcl-xL基因啟動子中含有兩個NF-κB結合位點, 活化后的NF-κB轉入核內(nèi)與之結合，從而上調(diào)基因表達,激活Bcl-xL的抗凋亡作用[32-33]；②NF-κB活化后促進轉化生長因子(TGF)-β表達增加, 通過抑制細胞凋亡發(fā)揮保護作用；③NF-κB可源頭抑制細胞凋亡，即阻斷半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(caspase)-8。同時也有研究發(fā)現(xiàn)，NF-κB的促凋亡作用可表現(xiàn)在對不同病理狀態(tài)、不同組織細胞的反應中。體外循環(huán)引起的IRI中，由于NF-κB激活導致大量釋放TNF-α和IL-1, 進而加劇心肌細胞凋亡。相關實驗[34]顯示，姜黃素通過下調(diào)NF-κB信號傳導途徑, 從而誘導細胞凋亡, 這被認為是AKI的重要機制。研究發(fā)現(xiàn)，在RIRI大鼠模型中給予藥物干預后，明顯降低血清肌酐和血尿素氮水平，減弱腎細胞凋亡，減輕腎組織形態(tài)變化，減少IL-1β、TNF-α和caspase-3的釋放, NF-кB表達降低與IRI組相比差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05), 說明該藥物對大鼠腎損傷的改善作用可能與凋亡基因NF-кB表達有關[35]。在細胞凋亡中，NF-κB亞單位的種類及數(shù)量起著決定性作用, 當p65表達增加時, 發(fā)生抑制細胞凋亡作用；當c-Rel過表達時, 則發(fā)生促進細胞凋亡作用[36]。NF-κB還可以通過對其自我吞噬作用的抑制來發(fā)揮抗凋亡作用[37]。綜上，不同的刺激因素及細胞類型與激活的NF-κB亞單位的種類及數(shù)量決定了NF-κB在細胞凋亡中是起到抑制凋亡還是促進凋亡的作用, 其具體機制有待進一步研究加以論證。

2.4NF-κB與自噬 細胞自噬的本質(zhì)是溶酶體依賴的分解代謝過程，可通過降解受損細胞器和錯誤折疊蛋白質(zhì)在調(diào)節(jié)細胞穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要作用。TLR4/NF-кB信號通路促進炎性因子分泌,進而介導自噬的發(fā)生，是炎癥與自噬之間的主要激活途徑。研究[38]發(fā)現(xiàn)，自噬可因p53的上調(diào)表達激活了下游基因(DRAM)，這進一步說明NF-κB的激活上調(diào)自噬水平。近年來有研究[39]發(fā)現(xiàn)，激活NF-κB信號通路，從而激活自噬，導致IL-6等炎癥因子的表達降低。自噬可誘導內(nèi)皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase， eNOS)表達，減少人體中的氧化應激，減少內(nèi)皮損傷。因此，NF-κB不僅可以正向調(diào)節(jié)自噬水平，還可以通過自噬減輕炎癥反應、細胞內(nèi)皮損傷等。同時，自噬也可負向調(diào)節(jié)NF-κB，從而發(fā)揮減少炎癥、減輕細胞內(nèi)皮損傷的作用。雷帕霉素介導的自噬通過減少巨噬細胞中線粒體ROS和IL-1β的釋放，降低IL-1β—p38 MAP激酶(MAPK)—NF-κB 途徑的活性。相反，抑制自噬后，巨噬細胞中IL-1β和 IL-18 的產(chǎn)生增多，間接說明雷帕霉素通過抑制核苷酸結合寡聚化結構域樣受體蛋白3(NLRP3)的正反饋回路炎性體—p38 MAPK—NF-κB途徑，負向調(diào)節(jié)巨噬細胞活性[40]。總之，自噬活化在核再生過程的早期具有保護作用，而過度自噬則促進核再生后期的細胞凋亡。細胞自噬在細胞成活過程中發(fā)揮重要作用，通過激活細胞自噬來改善細胞成活，許多藥物通過激活細胞自噬來發(fā)揮保護作用，改善急性腎衰竭患者的腎功能。因此，明確細胞自噬的調(diào)控機制，可能為預防和治療RIRI提供新的有效方法[41]。

3 NF-κB為RIRI的治療靶點

對缺血-再灌注而言，由于持續(xù)缺血會進一步增加梗死面積，所以任何情況下的再灌注延遲都比較危險。到目前為止，從第一個信號到Rel蛋白合成的NF-κB通路，對于每個階段的拮抗劑都有研究，治療或預防主要有三種途徑，即缺血預處理、直接NF-κB級聯(lián)拮抗和間接免疫抑制。一方面可以促進NF-κB活性的細胞保護作用，另一方面可以通過拮抗天然免疫系統(tǒng)中NF-κB活性介導的炎癥過程[42]。

3.1預處理 預處理是指在組織水平發(fā)生的分子變化，使同一組織能夠適應和克服后來的不良事件[43]。雖然缺血預處理(IPC)的作用機制尚不明確，但有研究[44]發(fā)現(xiàn)，在預處理階段，NF-κB的誘導優(yōu)先轉移到細胞保護化合物的合成上，如Bcl-2、Bcl-xL、超氧化物合酶和血紅素氧合酶-1[45-46]。經(jīng)典文獻證明，IPC可以改善腎功能、維持代謝穩(wěn)態(tài)、保護細胞完整性和組織形態(tài)學。IPC減輕損傷的其中一種機制則是抑制NF-κB通路，減少炎癥反應。但在對激活的NF-κB級聯(lián)反應的循環(huán)次數(shù)和持續(xù)時間的8種變化進行研究時發(fā)現(xiàn)，一個缺血1分鐘再灌注1分鐘的循環(huán)產(chǎn)生的NF-κB誘導程度與缺血5分鐘再灌注10分鐘的4個循環(huán)大致相同，因此認為，級聯(lián)因素似乎在很大程度上并不重要[42]。研究發(fā)現(xiàn)，蛇床子素預處理可抑制NF-κB活化，下調(diào)炎癥因子表達，從而改善RIRI[47]。通過減少NF-κB p65活化, 可以下調(diào)各種促炎因子，如TNF-α、IL-1β和IL-6水平[48]。Kuwabara等[49]選用姜黃素及NF-κB抑制劑二硫代氨基甲酸吡咯烷 (PDTC) 對單側輸尿管梗阻大鼠進行干預, 結果表明, 姜黃素對梗阻性腎病所導致的炎性反應和纖維化有保護作用, 其保護機制與抑制NF-κB途徑有關。有研究[50]發(fā)現(xiàn)，硫化氫可通過抑制NF-κB 濃度的表達來預防RIRI。

3.2拮抗NF-κB途徑 NF-κB作為免疫應答、炎癥反應、氧化應激、細胞凋亡、細胞自噬過程中關鍵轉錄因子，可通過調(diào)節(jié)細胞免疫、自噬、抗凋亡等途徑發(fā)揮腎臟保護作用，也可因其過度活化產(chǎn)生的炎癥反應、促進細胞凋亡等作用導致AKI。因此，通過研究拮抗RIRI中NF-κB通路，可以為制定新的、有效的RIRI治療策略提供新思路。NF-κB的抑制是通過與κB類蛋白不同抑制劑結合，或通過羧基末端片段的自身抑制作用實現(xiàn)的[42]。不同IκB亞型與Rel蛋白二聚體的結合具有高度特異性，其中IκBα和IκBβ是IRI發(fā)生的關鍵亞型[51]。在缺血的早期階段，細胞內(nèi)氧分壓的下降會導致脯氨酰羥化酶(PHDs)失去活性[52]。在常氧條件下，這些酶反應減弱上游NF-κB效應因子IκB激酶β(IKKβ)[53]。因此，低水平PHD導致IKKβ活性的相對增加，從而導致NF-κB活性增加。IκB激酶(IKK)復合物是通過典型的級聯(lián)反應促進IκB降解和NF-κB去抑制關鍵效應分子。然而，在少數(shù)研究中，其應用僅被證明能改善IRI的嚴重程度，而且它作為阻斷NF-κB級聯(lián)反應的有效手段在臨床上的應用尚不清楚。蛋白酶體抑制劑通過抑制泛素化IκB蛋白的分解發(fā)揮抑制NF-κB激活的作用。2001年Itoh等[54]發(fā)現(xiàn)，在左腎動脈阻斷45分鐘之前，一次性注射20S/26S蛋白酶體抑制劑(lactacystin)，具有明顯的臨床保護作用。烏司他丁是從新鮮人尿中提取的一種能抑制多種蛋白水解酶活力的糖蛋白，通常用于治療急性炎癥性疾病(如胰腺炎和膿毒癥)，作為蛋白酶抑制劑發(fā)揮作用[55]。目前研究[56]發(fā)現(xiàn)，烏司他丁下調(diào)NF-κB表達，可能是由于抑制了蛋白酶，阻止IκB降解。有研究[57-59]發(fā)現(xiàn)，通過調(diào)節(jié)NF-κB/NLRP3軸、miRNA調(diào)節(jié)NF-κB信號通路，以特異性抑制NF-κB。小鼠腎移植模型中，通過siRNA局部動脈灌注供體腎臟阻斷RelB，通過減輕炎癥細胞因子和細胞凋亡用以減輕移植腎臟的IRI[60]。臨床上使用的鎮(zhèn)靜藥物右美托咪啶通過抑制TLR4/NF-κB通路，改善缺血-再灌注，減輕大鼠移植后的腎臟損傷[12]。

3.3其他 盡管人們對NF-κB通路已有30多年的了解，但對經(jīng)典和非經(jīng)典NF-κB通路之間的串擾、NF-κB通路與其他信號轉導通路的相互作用，以及在腎臟疾病基因調(diào)控中的作用仍有許多有待研究的問題。對于IRI的基因治療，有學者已經(jīng)在肺組織中進行了研究，通過氣管內(nèi)給藥，證明將編碼顯性陰性IκB亞型、IL-10基因轉染供體肺組織可產(chǎn)生保護作用。近年來，NF-κB抑制劑脫氫環(huán)氧甲基醌霉素(DHMEQ)被認為能夠阻斷NF-κB復合體的核轉位[61-62]，并且可以和p50、p65、c-Rel和Rel B上的半胱氨酸結合，導致NF-κB失活[63]。研究人員還選擇性干預特定NF-κB復合體的雙鏈寡核苷酸，通常為RelA-p50復合體。有體外研究[26]發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)arnesiferol B對巨噬細胞NF-κB途徑有調(diào)節(jié)作用。

綜上所述，RIRI的發(fā)生、發(fā)展是一個極其復雜的病理生理過程，目前已知NF-κB在腎缺血-再灌注中通過炎癥反應、氧化應激、細胞凋亡、自噬等途徑發(fā)揮作用，但NF-κB參與IRI的發(fā)生是自相矛盾的，如NF-κB通過激活促進一系列細胞保護性化合物合成的同時，產(chǎn)生一系列炎性細胞因子和細胞毒素(如TNF-α和IL-1)。然而，還需要更多的實驗證據(jù)來了解腎臟生理和分子保護機制。目前已經(jīng)有研究發(fā)現(xiàn)許多藥物都具有改善IRI的強大潛力，但在它們進入臨床試驗之前，還需要做大量工作。因此了解NF-κB在RIRI中的重要潛在機制及以之為靶點的治療研究，有望從根本上改善IRI，從而避免造成不可逆的腎損傷。