劉凱，王建寧

1山東大學(xué)齊魯醫(yī)學(xué)院，山東濟(jì)南 250033；2山東第一醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院（山東省千佛山醫(yī)院）泌尿外科，山東濟(jì)南 250033

肥胖、糖尿病等代謝性疾病的發(fā)病率隨著年齡的增長逐漸升高，給社會(huì)經(jīng)濟(jì)造成巨大負(fù)擔(dān)。代謝性疾病發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，線粒體功能紊亂是其發(fā)生發(fā)展的重要機(jī)制。CypD是線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔的重要元件，其表達(dá)量增加會(huì)導(dǎo)致線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔過度開放，導(dǎo)致線粒體水腫，影響線粒體功能，從而導(dǎo)致細(xì)胞整體氧化應(yīng)激增加［1］。研究顯示，CypD與代謝性疾病和衰老密切相關(guān)：CypD在代謝相關(guān)脂肪性肝病中表達(dá)升高［2］；CypD敲除會(huì)延長小鼠的壽命［3］；CypD敲除會(huì)改善衰老小鼠的阿爾茨海默病［4］。鐵死亡是新近發(fā)現(xiàn)的一種細(xì)胞死亡方式，其特征是鐵依賴性脂質(zhì)過氧化物累積到致死水平［5］。鐵死亡在衰老機(jī)體中增加，導(dǎo)致衰老細(xì)胞的高氧化應(yīng)激狀態(tài)從而促進(jìn)衰老［6］。并且，鐵死亡也參與并促進(jìn)了代謝性疾病的發(fā)生發(fā)展［7］。目前尚無研究報(bào)道CypD對(duì)衰老小鼠代謝狀態(tài)的影響以及CypD敲除是否會(huì)改變衰老小鼠的鐵死亡。為進(jìn)一步深入探討，2019年8月—2021年12月，本研究觀察了CypD敲除對(duì)衰老小鼠能量代謝和糖代謝的影響，同時(shí)觀察了CypD敲除對(duì)衰老小鼠代謝器官（肝臟和肌肉）鐵死亡水平的影響。

1 材料與方法

1.1 材料SPF級(jí)6周齡的雄性CypD全身敲除小鼠和同窩野生型對(duì)照（C57BL/6），均來自山東省千佛山醫(yī)院中心試驗(yàn)室動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心（SPF級(jí)）。飼料購自北京科澳協(xié)力飼料有限公司，基因型鑒定試劑購自天根生化科技有限公司，引物合成自北京六合華大基因科技有限公司，重組人胰島素注射液（40 U/mL）購自江蘇萬邦生化醫(yī)藥股份有限公司，丙酮酸鈉購自Sigma-Aldrich，普魯士藍(lán)染色試劑盒購自北京索萊寶科技公司，Gpx4抗體購自Abcam公司，Gapdh抗體及Western blotting二抗購自Proteintech公司。

1.2 動(dòng)物分組及處理方法將CypD敲除小鼠和同窩野生型對(duì)照分別命名為CypD KO組和對(duì)照組，各10只，兩組小鼠喂養(yǎng)前體質(zhì)量沒有差異，具有可比性。在SPF環(huán)境里普通飼料喂養(yǎng)14個(gè)月后，每組各有2只自然死亡，對(duì)存活的小鼠分別進(jìn)行各種代謝狀態(tài)觀察和鐵死亡指標(biāo)檢測。

1.3 小鼠代謝狀態(tài)觀察

1.3.1 體質(zhì)量和飲食喂養(yǎng)14個(gè)月后，記錄CypD KO組和對(duì)照組各8只小鼠最終體質(zhì)量和每周的進(jìn)食量。

1.3.2 呼吸交換率（RER）、產(chǎn)熱和活動(dòng)度隨機(jī)取CypD KO組和對(duì)照組各4只小鼠，將小鼠提前在代謝籠（一種特殊設(shè)計(jì)的為采集實(shí)驗(yàn)動(dòng)物各種排泄物質(zhì)的密封式飼養(yǎng)籠）適應(yīng)24 h后開始記錄數(shù)據(jù)，首先記錄小鼠的體質(zhì)量和去脂體質(zhì)量，輸入代謝籠分析系統(tǒng)以獲得體質(zhì)量校正后的數(shù)據(jù)。利用曲線圖和曲線下面積（AUC）分別展示整體和黑暗期、光照期的RER、產(chǎn)熱、活動(dòng)度數(shù)據(jù)。

1.3.3 糖代謝指標(biāo)

1.3.3.1 空腹血糖檢測CypD KO組和對(duì)照組各取8只小鼠，在干凈籠子里禁食18 h，在安靜狀態(tài)剪掉1～2 mm尾端后輕輕擠壓小鼠尾巴，擠出一滴血用血糖儀檢測基礎(chǔ)血糖值。

1.3.3.2 糖耐量試驗(yàn)CypD KO組和對(duì)照組各取8只小鼠，在干凈籠子里禁食18 h，稱量體質(zhì)量后按照2 g葡萄糖/kg體質(zhì)量的標(biāo)準(zhǔn)腹腔注射20%的葡萄糖溶液，記錄小鼠0、30、60、90、120 min的血糖值。

1.3.3.3 胰島素敏感性試驗(yàn)CypD KO組和對(duì)照組各取6只小鼠，在干凈籠子里禁食2 h，按照每20 g體質(zhì)量注射200 μL胰島素的量進(jìn)行腹腔注射，記錄小鼠0、15、30、60、90 min的血糖值。

1.3.3.4 丙酮酸耐量試驗(yàn)CypD KO組和對(duì)照組各取6只小鼠，在干凈籠子里禁食8 h，按照2 g葡萄糖/kg體質(zhì)量的標(biāo)準(zhǔn)腹腔注射20%的丙酮酸鈉溶液，記錄0、30、60、90 min的血糖值。

1.4 鐵死亡指標(biāo)檢測

1.4.1 普魯士藍(lán)染色CypD KO組和對(duì)照組小鼠麻醉后，眼球取血，隨后兩組各取3只小鼠的肝臟，4%多聚甲醛固定、脫水、石蠟包埋后制作肝臟的石蠟切片，按照說明書，切片脫蠟至水后放入Perls stain染色30 min，蒸餾水充分沖洗后，用伊紅染液淡染細(xì)胞核15 s，自來水沖洗5 s后脫水、透明、封固。油鏡（×100倍）下拍照觀察。

1.4.2 Gpx4蛋白檢測采用Western blotting法。CypD KO組和對(duì)照組小鼠麻醉后，眼球取血，隨后各取8只小鼠的肝臟、右側(cè)腓腸肌組織，置于-80℃冰箱凍存。提取小鼠肝臟、肌肉組織蛋白，BCA法測蛋白水平。配制12%的分離膠，電泳、轉(zhuǎn)膜后5%牛奶室溫封閉1 h，一抗Gpx4（1∶1 000）及內(nèi)參Gapdh（1∶7 500）搖床4℃孵育過夜；次日TBST洗膜后二抗室溫孵育1 h，化學(xué)發(fā)光法顯影分析。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以±s表示，組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)或重復(fù)測量方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組基本情況、體質(zhì)量和進(jìn)食量比較存活的兩組小鼠外觀差異不明顯，都表現(xiàn)出衰老小鼠的特征。CypD KO組小鼠體質(zhì)量為（29.38±1.32）g低于對(duì)照組（31.86±1.21）g（P＜0.05）；CypD KO組小鼠每周進(jìn)食量為（17.3±0.97）g，與對(duì)照組（18.24±1.00）g相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

2.2 兩組RER、產(chǎn)熱和活動(dòng)度比較兩組代謝籠數(shù)據(jù)都呈現(xiàn)有規(guī)律的晝夜節(jié)律。RER AUC比較，黑暗期CypD KO組高于對(duì)照組（P＜0.05），光照期兩組沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）；產(chǎn)熱AUC比較，光照期CypD KO組高于對(duì)照組（P＜0.05），黑暗期兩組沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）；活動(dòng)度AUC比較，黑暗期和光照期兩組均沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。代謝籠3 d光照期和黑暗期不同時(shí)段RER、產(chǎn)熱和活動(dòng)度曲線和AUC比較分別見圖1～3和表1。

表1 兩組3 d光照期和黑暗期不同時(shí)段RER、產(chǎn)熱和活動(dòng)度AUC比較（±s）

表1 兩組3 d光照期和黑暗期不同時(shí)段RER、產(chǎn)熱和活動(dòng)度AUC比較（±s）

注：與對(duì)照組相比，*P＜0.05。

組別對(duì)照組光照期黑暗期CypD KO組光照期黑暗期n 4 4 RER 產(chǎn)熱（kJ）活動(dòng)度（cnts/h）68.91±0.79 71.34±0.80 1 075±33.22 1 280±47.87 87 170±4 167 210 900±38 230 68 030±11 120 115 000±20 800 69.6±2.40 75.61±1.38*1 214±19.19*1 363±25.89

圖1 兩組3 d光照期和黑暗期不同時(shí)段RER曲線比較

圖2 兩組3 d光照期和黑暗期不同時(shí)段產(chǎn)熱曲線比較

圖3 兩組3 d光照期和黑暗期不同時(shí)段活動(dòng)度曲線比較

2.3 兩組糖代謝指標(biāo)比較

2.3.1 糖耐量比較CypD KO組糖耐量AUC為（759.9±178.4）mmol/（L·min），低于對(duì)照組［（1 347±94.57）mmol/（L·min）］（P＜0.01）。CypD KO組0、30、90、120 min血糖值低于對(duì)照組（P均＜0.05）。見圖4。

圖4 兩組糖耐量不同時(shí)點(diǎn)血糖值比較

2.3.2 胰島素敏感性比較CypD KO組胰島素敏感性AUC為（436.4±73.85）mmol/（L·min），低于對(duì)照 組［（657.5±46.16）mmol/（L·min）］（P＜0.01）。CypD KO組0、15、30、90 min血糖值低于對(duì)照組（P均＜0.05）。見圖5。

圖5 兩組胰島素敏感性不同時(shí)點(diǎn)血糖值比較

2.3.3 丙酮酸耐量比較CypD KO組丙酮酸耐量AUC為（471.8±38.67）mmol/（L·min），低于對(duì)照組［（625.5±17.18）mmol/（L·min）］（P＜0.01）。CypD KO組0、30、60 min血糖值低于對(duì)照組（P均＜0.05）。見圖6。

圖6 兩組丙酮酸耐量不同時(shí)點(diǎn)血糖值比較

2.4 兩組肝臟鐵死亡指標(biāo)比較

2.4.1 肝臟普魯士藍(lán)染色比較對(duì)照組衰老小鼠鐵沉積比較嚴(yán)重，染色結(jié)果為密集的點(diǎn)狀伴隨塊狀的鐵沉積，而CypD KO組的鐵沉積為細(xì)小的顆粒狀且無團(tuán)塊。見圖7。

圖7 肝臟普魯士藍(lán)染色結(jié)果（×100倍）

2.4.2 Gpx4蛋白檢測比較CypD KO組肝臟組織Gpx4的相對(duì)表達(dá)量為1.10±0.058，高于對(duì)照組的0.90±0.029（P＜0.05）。CypD KO組肌肉組織Gpx4的相對(duì)表達(dá)量為1.07±0.15，低于對(duì)照組的1.12±0.13，兩組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見圖8。

圖8 肝臟組織和肌肉組織Gpx4的Western blotting法檢測顯示條帶

3 討論

衰老是代謝性疾病的重要因素之一，利用衰老小鼠模型可以觀察各種因素對(duì)衰老狀態(tài)下代謝指標(biāo)的影響。線粒體功能障礙是多種疾病的重要發(fā)病機(jī)制，已有研究顯示線粒體功能紊亂與衰老具有密切聯(lián)系，衰老會(huì)導(dǎo)致線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔開放增加，進(jìn)而出現(xiàn)水腫、功能障礙，最終產(chǎn)生大量活性氧中介物（ROS），導(dǎo)致細(xì)胞整體的氧化應(yīng)激水平增加［8］。CypD作為線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔的重要元件，其表達(dá)量增加會(huì)導(dǎo)致線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔過度開放；CypD敲低或者敲除的模型中線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔開放減少，細(xì)胞整體的氧化應(yīng)激水平也會(huì)隨之降低。鐵死亡是以鐵依賴的脂質(zhì)過氧化為特征［9］，線粒體在鐵死亡的發(fā)生發(fā)展中也發(fā)揮了重要作用。

本研究顯示，CypD敲除小鼠（CypD KO組）體質(zhì)量較野生型衰老小鼠（對(duì)照組）低，但每周進(jìn)食量無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，推測是CypD敲除小鼠能量消耗更多導(dǎo)致。代謝籠是測量動(dòng)物能量收支的實(shí)驗(yàn)方法，其中，RER是二氧化碳產(chǎn)生量和耗氧量的比值，反映的是供能所消耗的底物情況。如果機(jī)體100%消耗碳水化合物供能，RER=1；如果機(jī)體100%消耗脂類供能，RER=0.7。因?yàn)轱嬍车膹?fù)合性，所以RER應(yīng)在0.7～1.0范圍內(nèi)。胰島素的改變會(huì)影響RER的變化。胰島素分泌增加，一方面促進(jìn)糖的攝取和利用，糖作為底物供能比增加；另一方面促進(jìn)脂質(zhì)儲(chǔ)存，脂質(zhì)作為底物供能比降低，兩方面均使RER升高。哺乳動(dòng)物90%的O2消耗供能在線粒體發(fā)生，所以富含線粒體的器官組織所占比例及其中線粒體的數(shù)量、供能均會(huì)影響產(chǎn)熱。本研究代謝籠顯示CypD KO組光照期產(chǎn)熱高于對(duì)照組，由于兩組小鼠開始喂養(yǎng)時(shí)體質(zhì)量無顯著差異，這可以解釋兩組小鼠飲食量無差異但CypD KO組小鼠體質(zhì)量降低的現(xiàn)象，推測產(chǎn)熱的改變可能是因?yàn)镃ypD的改變影響了衰老小鼠產(chǎn)熱的重要細(xì)胞器——線粒體的功能，進(jìn)一步推測產(chǎn)熱的重要器官——肝臟和肌肉（肌肉、肝臟富含線粒體［10］）可能存在差異。此外，代謝籠提示CypD KO組黑暗期活動(dòng)度低于對(duì)照組但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，推測黑暗期由于對(duì)照組活動(dòng)量的增加導(dǎo)致兩組產(chǎn)熱無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。但是，為什么CypD KO組小鼠黑暗期活動(dòng)量不及對(duì)照組還需要研究，一個(gè)推測是衰老導(dǎo)致大腦氧化應(yīng)激增加從而導(dǎo)致對(duì)照組小鼠表現(xiàn)出焦慮的癥狀。CypD KO組小鼠黑暗期RER高于對(duì)照組，說明CypD敲除的衰老小鼠以糖作為底物的比例高于對(duì)照組衰老小鼠。因此，CypD敲除在衰老小鼠中通過影響線粒體功能可以導(dǎo)致能量產(chǎn)生的底物利用和產(chǎn)熱的改變，具體機(jī)制還需要基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)的支持。

空腹血糖、糖耐量檢測可以反映胰島素分泌情況；胰島素敏感性可以反映外周組織對(duì)胰島素的響應(yīng)情況；丙酮酸耐量試驗(yàn)可以反映出饑餓狀態(tài)下肝臟糖異生能力。本研究中CypD KO組糖代謝明顯改善：胰島素分泌狀態(tài)優(yōu)于對(duì)照組，肌肉和肝臟對(duì)葡萄糖的利用良好以及肝臟糖異生弱于對(duì)照組。但是，糖代謝試驗(yàn)中未以年輕小鼠做對(duì)照，而且糖耐量試驗(yàn)在30 min時(shí)，CypD KO組小鼠血糖升高不理想且組內(nèi)數(shù)據(jù)有一定差異（30 min血糖數(shù)據(jù)組內(nèi)方差較大），因此不能得出CypD敲除的衰老小鼠糖代謝正常的結(jié)論。

肝臟在血糖調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用，而且肝臟是內(nèi)源性糖產(chǎn)出的最主要器官，其次是腎臟。此外，葡萄糖的清除主要依賴肝臟和骨骼肌等。丙酮酸耐量試驗(yàn)提示CypD KO組衰老小鼠饑餓狀態(tài)下肝臟糖異生能力弱于對(duì)照組衰老小鼠，提示空腹血糖的差異有可能是因?yàn)镃ypD敲除影響了肝臟糖異生能力。因此，研究肝臟的改變有助于發(fā)現(xiàn)CypD KO組小鼠血糖改變的機(jī)制。鐵死亡作為新近出現(xiàn)的細(xì)胞死亡方式，其過程涉及氨基酸代謝、糖代謝和脂代謝，是幾大代謝過程的交匯［11］。機(jī)體鐵代謝的異常導(dǎo)致各個(gè)器官的鐵死亡水平升高。其中，肝臟是機(jī)體鐵調(diào)控的樞紐。肝臟通過分泌hepcidin調(diào)控各個(gè)器官的鐵的轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝［12］。文獻(xiàn)報(bào)道鐵死亡參與了能量代謝異常的發(fā)生，例如糖尿?。?3］；另外，鐵死亡和衰老有密切聯(lián)系，鐵死亡參與神經(jīng)退行性疾病的發(fā)生發(fā)展［14］。普魯士藍(lán)染色可以觀察鐵在組織中的沉積狀況，肝臟切片的普魯士藍(lán)染色顯示野生型衰老小鼠存在大量密集的鐵沉積顆粒。Gpx4是觀察鐵死亡的核心指標(biāo)［15］。Gpx4通過還原谷胱甘肽過氧化物從而抑制鐵死亡［16］。本研究結(jié)果顯示，CypD KO組肝臟Gpx4表達(dá)高于對(duì)照組；而肌肉的Gpx4改變不明顯。提示，CypD敲除除緩解衰老導(dǎo)致的線粒體功能紊亂以外，還會(huì)抑制鐵死亡。進(jìn)一步提示與肌肉組織相比，肝臟在CypD敲除的衰老小鼠糖代謝改變中發(fā)揮了主要作用。但是，確鑿的證據(jù)需要利用肝臟CypD特敲的衰老小鼠模型證實(shí)。由于肝臟通過分泌肝鐵調(diào)素在全身鐵代謝中發(fā)揮核心作用，推測CypD敲除對(duì)肝臟的影響將導(dǎo)致全身鐵代謝的改變。肝臟糖代謝的改變與鐵死亡的關(guān)系需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)的證實(shí)。

綜上所述，CypD敲除可以改善衰老造成的體質(zhì)量增加、產(chǎn)熱降低、底物構(gòu)成比以及糖代謝異常，而且可以降低能量和糖代謝的重要器官——肝臟中的鐵死亡水平。以上研究為改善衰老的代謝狀況提供了新的思路，由于已有成熟的鐵死亡抑制劑和激動(dòng)劑以及CypD的抑制劑，因此可以通過減輕鐵死亡或抑制CypD的表達(dá)從而達(dá)到改善代謝的目的。

利益沖突所有作者聲明不存在利益沖突

作者貢獻(xiàn)聲明劉凱：實(shí)驗(yàn)研究、數(shù)據(jù)收集與整理、論文撰寫；王建寧：論文修訂與指導(dǎo)