魏 星,馬 莉,李維妙,周雅卿,趙永林*

(1西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科,西安 710004;2西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院腫瘤科;*通訊作者,E-mail:zhaoyonglinlin@163.com)

神經(jīng)毒性是紫杉類藥物的主要劑量限制性副作用,常見有外周感覺性的痛覺過敏、灼痛、刺痛和麻木等不適癥狀。白蛋白結(jié)合型紫杉醇是紫杉醇與人血白蛋白結(jié)合制成的納米微粒，與傳統(tǒng)劑型紫杉醇相比，白蛋白結(jié)合型紫杉醇的使用劑量更大，提高了療效，但同時也加重了紫杉醇藥物的不良反應(yīng)[1]。部分患者因無法耐受神經(jīng)毒性而選擇減量或者更換藥物，治療效果下降，因此闡明紫杉醇誘導(dǎo)神經(jīng)病理性疼痛的機制顯得尤為重要。

高遷移率族蛋白B1(high-mobility group protein B1，HMGB1)是主要存在于細胞核的內(nèi)源性危險性信號分子。Toll樣受體4(Toll-like receptor4，TLR4)是一種參與非特異性免疫反應(yīng)的蛋白質(zhì)分子[2]。HMGB1是TLR4的內(nèi)源性配體之一，以HMGB1/TLR4通路為靶點可減輕脊神經(jīng)損傷所致的神經(jīng)性疼痛，HMGB1/TLR4通路也與紫杉醇所致的神經(jīng)性疼痛有關(guān)，但是其機制尚不清楚，且HMGB1/TLR4通路在白蛋白結(jié)合型紫杉醇所致的神經(jīng)毒性中的作用也不明確[3]。本研究通過建立白蛋白結(jié)合型紫杉醇所致的神經(jīng)病理性疼痛大鼠模型，研究HMGB1/TLR4通路相關(guān)蛋白及下游炎性因子的表達變化，為揭示紫杉醇所致的神經(jīng)性病理痛的病理生理機制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物分組

8～10周齡SPF級雄性SD大鼠36只，體質(zhì)量250～300 g，購自西安交通大學(xué)實驗動物中心，生產(chǎn)許可證號SCXK(陜西)2006-001。大鼠于25 ℃的環(huán)境中適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，被隨機分為對照組和紫杉醇組，每組18只，每組6只用于形態(tài)學(xué)及免疫組化檢測，6只用于Western blot檢測，6只用于ELISA檢測炎性因子水平。

1.2 主要儀器與試劑

白蛋白結(jié)合型紫杉醇(粉劑，規(guī)格：100 mg，純度：99%，生產(chǎn)批號：B04190425)購自石藥集團歐意藥業(yè)有限公司，Von Frey細絲購自美國Stoelting公司，熱痛刺激儀BME2410A購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物工程研究所，TNF-α、IL-1β和IL-6 ELISA試劑盒購自美國R&D Systems公司，內(nèi)參抗體β-actin、MyD88、TRIF、IRF3、GFAP抗體購自美國Cell Signaling Technology公司，Iba-1抗體購自日本W(wǎng)ako公司，HMGB1、TLR4抗體購自英國Abcam公司，山羊抗兔SP試劑盒(IgG抗體)、DAB顯色盒購自北京中杉金橋公司，RIPA裂解液、蛋白含量檢測試劑盒、Western blot相關(guān)試劑購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.3 動物模型制備

本研究中，白蛋白結(jié)合型紫杉醇經(jīng)生理鹽水溶解(0.5 mg/ml)后，以2.47 mg/kg的劑量隔日腹腔給藥，共進行4次注射(第1，3，5，7天)，最終累積劑量為9.9 mg/kg，經(jīng)白蛋白結(jié)合型紫杉醇處理的大鼠為紫杉醇組[4]。對照組腹腔注射同劑量的生理鹽水。實驗第8天水合氯醛麻醉大鼠，暴露胸腔，生理鹽水和多聚甲醛灌注固定脊髓。

1.4 行為學(xué)測定

采用Von Frey細絲和熱痛刺激儀分別測定大鼠實驗前(day 0)、白蛋白結(jié)合型紫杉醇或生理鹽水注射后第4天(day 4)和第8天(day 8)的機械刺激縮足反射閾值(mechanical withdrawal threshold，MWT)和熱刺激縮足反射潛伏期(thermal withdrawal latency，TWL)作為痛閾觀察指標。

熱刺激縮足反射潛伏期測定：用左后足TWL作為反映大鼠熱痛閾的指標。將大鼠置于透明的有機玻璃箱中，待其處于安靜狀態(tài)時，將紅外輻射熱刺激發(fā)生器的加熱中心對準大鼠后足跖面進行連續(xù)輻射，待大鼠出現(xiàn)抬腿動作時，儀器可以自動記錄此時間點(s)，即為大鼠的TWL。每只大鼠試驗5次，每次間隔5 min。

機械刺激縮足反射閾值測定：將大鼠置于底部為鐵絲網(wǎng)的塑料籠中，適應(yīng)30 min，用代表不同壓力(最小0.4 g，最大26.0 g)的Von Frey探針刺激大鼠右后足10次，每次持續(xù)3～5 s，每次刺激間隔大于2 min。觀察大鼠的縮足反應(yīng)次數(shù)，根據(jù)公式計算大鼠的MWT(g)，作為反映大鼠機械痛閾指標。

1.5 Western blot檢測TLR4通路相關(guān)蛋白MyD88、TRIF、IRF3的表達

腹腔注射10%水合氯醛麻醉大鼠。心臟灌注4 ℃生理鹽水后，快速取出L4-6脊髓組織，液氮速凍，-80 ℃保存。取凍存脊髓組織加入蛋白裂解液，15 000 r/min離心10 min，收集上清，即為細胞總蛋白。BCA試劑盒測定蛋白質(zhì)樣品濃度。按照每孔30 μg加樣，蛋白質(zhì)樣品通過凝膠電泳分離，電泳結(jié)束后利用濕轉(zhuǎn)法使蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，脫脂奶粉室溫封閉1 h，加入一抗：β-actin(1 ∶1 000)、髓樣分化初反應(yīng)蛋白88(myeloid differentiation primary response protein 88，MyD88)(1 ∶500)、含有TIR結(jié)構(gòu)能誘導(dǎo)干擾素β的接頭分子(TIR-domain-containing adapter-inducing interferon-β，TRIF)(1 ∶500)、干擾素調(diào)節(jié)因子3(interferon regulatory factor 3，IRF3)(1 ∶500)，4 ℃孵育過夜，TBST漂洗，加入HRP標記的山羊抗鼠二抗(1 ∶5 000)室溫孵育2 h，化學(xué)發(fā)光法顯色，拍照，Image J軟件定量分析。

1.6 HE染色觀察脊髓病理改變

10%的水合氯醛溶液麻醉大鼠，經(jīng)左心室灌注生理鹽水，并繼續(xù)快速推注4%多聚甲醛約150 ml，最后4%多聚甲醛緩慢滴注15 min，大鼠肢體僵硬后，快速取出L4-6脊髓組織。常規(guī)石蠟包埋脊髓組織，5 μm厚度切片。HE染色，常規(guī)脫蠟、水化、染色、沖洗、中性樹膠封片，光鏡觀察脊髓組織細胞形態(tài)。

1.7 免疫組化染色檢測脊髓組織中GFAP、Iba-1、HMGB1及TLR4的表達

取石蠟切片，脫蠟、水化如前，過氧化氫消除內(nèi)源性過氧化物酶，高壓抗原修復(fù)，血清室溫封閉30 min，分別加HMGB1抗體(1 ∶300)、TLR4抗體(1 ∶200)、Iba-1抗體(1 ∶400)或、GFAP抗體(1 ∶200)，4 ℃過夜。生物素化二抗37 ℃孵育30 min，辣根酶標記鏈霉卵白素37 ℃孵育30 min。DAB顯色、蘇木素溶液復(fù)染，常規(guī)脫水、封片。光鏡觀察，顯微鏡成像系統(tǒng)采集圖片，生物醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)分析結(jié)果。GFAP為星形膠質(zhì)細胞活化標志物，Iba-1為小膠質(zhì)細胞活化標志物，GFAP及Iba-1表達升高提示膠質(zhì)細胞活化增強。

免疫組化結(jié)果判定[5]：每張切片隨機選取3個有代表性的高倍視野，免疫組化評分采用染色強度與陽性細胞數(shù)相結(jié)合的綜合評價，二者評分乘積為最終結(jié)果。染色強度評分：無染色0分，輕度黃染1分，中度黃染2分，重度黃染3分。陽性細胞數(shù)百分比評分：無染色0分，1%～10%細胞染色1分，11%～50%為2分；51%～80%為3分，81%～100%為4分。

1.8 ELISA檢測脊髓組織中TNF-α、IL-6、IL-1β的水平

稱取各組大鼠脊髓組織，加入生理鹽水后用電動勻漿器勻漿成勻漿液。采用ELISA試劑盒按照說明書步驟檢測各組大鼠脊髓勻漿液中TNF-α、IL-1β和IL-6含量，二抗?jié)舛? ∶5 000，用酶標儀在450 nm波長下測定吸光度，計算樣品濃度。

1.9 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 白蛋白結(jié)合型紫杉醇成功構(gòu)建大鼠神經(jīng)病理性疼痛模型

在開始給藥后第4天及第8天，紫杉醇組MWT、TWL較對照組均明顯降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，見圖1)，提示白蛋白結(jié)合型紫杉醇致神經(jīng)病理性疼痛大鼠模型成功建立。

與對照組相比，*P<0.05圖1 白蛋白結(jié)合型紫杉醇對大鼠MWT、TWL的影響Figure 1 Effects of nab-paclitaxel on MWT and TWL of rats

2.2 大鼠脊髓的病理學(xué)改變及HMGB1、TLR4的表達變化

HE染色結(jié)果表明：對照組大鼠L4-6脊髓組織中，神經(jīng)元結(jié)構(gòu)完整，核膜結(jié)構(gòu)清晰，核仁明顯，染色質(zhì)分布均勻，細胞無水腫；而紫杉醇組大鼠L4-6脊髓組織中，神經(jīng)細胞層次排列紊亂，神經(jīng)元固縮、扭曲，細胞體變形，部分細胞可見水腫(見圖2)。免疫組化結(jié)果表明：與對照組相比，紫杉醇組大鼠L4-6脊髓組織中HMGB1及TLR4的表達明顯升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，見圖3)。

圖2 HE染色觀察大鼠脊髓的病理學(xué)改變Figure 2 Pathological changes of spinal cord in rats by HE staining

與對照組相比，*P<0.05圖3 免疫組化檢測大鼠脊髓HMGB1、TLR4的表達變化Figure 3 The expression of HMGB1 and TLR4 in the rat spinal cord by immumohistochemical staining

2.3 白蛋白結(jié)合型紫杉醇對大鼠L4-6脊髓膠質(zhì)細胞活化的影響

免疫組化結(jié)果表明：與對照組相比，紫杉醇組大鼠L4-6脊髓組織中GFAP及Iba-1的表達明顯升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，見圖4)，提示白蛋白結(jié)合型紫杉醇可介導(dǎo)大鼠脊髓組織中的膠質(zhì)細胞活化。

與對照組相比，*P<0.05圖4 白蛋白結(jié)合型紫杉醇誘導(dǎo)大鼠L4-6脊髓中膠質(zhì)細胞活化Figure 4 Nab-paclitaxel promotes glial cell activation in L4-6 rat spinal cord by immumohistochemical staining

2.4 白蛋白結(jié)合型紫杉醇可激活大鼠脊髓組織中的TLR4通路

Western blot結(jié)果顯示，與對照組相比，紫杉醇組TLR4通路相關(guān)蛋白MyD88、TRIF、IRF3的表達明顯增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，見圖5)，提示TLR4通路可能參與白蛋白結(jié)合型紫杉醇誘導(dǎo)的神經(jīng)病理性疼痛。

與對照組相比，*P<0.05圖5 Western blot檢測白蛋白結(jié)合型紫杉醇對大鼠脊髓組織中的TLR4通路的影響Figure 5 Effect of nab-paclitaxel on the TLR4 pathway in rat spinal cord by Western blot

2.5 白蛋白結(jié)合型紫杉醇升高大鼠脊髓組織中的炎性因子水平

ELISA結(jié)果表明：與對照組相比，紫杉醇組大鼠L4-6脊髓組織中TNF-α、IL-1β和IL-6的含量明顯升高(P<0.05，見圖6)，結(jié)果提示白蛋白結(jié)合型紫杉醇誘導(dǎo)的神經(jīng)病理性疼痛可能與炎性因子水平升高有關(guān)。

與對照組相比，*P<0.05圖6 ELISA檢測白蛋白結(jié)合型紫杉醇對大鼠脊髓組織中的炎性因子水平的影響Figure 6 Effect of nab-paclitaxel on the levels of inflammatory factors in the spinal cord of rats by ELISA

3 討論

由于白蛋白結(jié)合型紫杉醇避免了有毒溶劑產(chǎn)生的不良反應(yīng)，增加了紫杉醇的安全使用劑量，大幅提高了治療的有效率，且中性粒細胞減少等不良反應(yīng)更輕，但是神經(jīng)病理性疼痛的發(fā)生率略有增加，而采用抗炎藥、阿片類藥物、抗抑郁藥等并不能明顯緩解此類型的疼痛。既往文獻表明紫杉醇導(dǎo)致的病理性疼痛可能與脊髓及背根神經(jīng)節(jié)的免疫調(diào)節(jié)、線粒體功能障礙、離子通道表達異常等有關(guān)，但具體機制仍不明確[6]。

生理狀況下HMGB1主要存在于細胞核，釋放到胞外則具有促炎癥作用。在應(yīng)激狀態(tài)、機體損傷、炎癥等過程中都可以引起HMGB1的釋放[7]。既往研究發(fā)現(xiàn)HMGB1及其受體在脊髓背角及背根神經(jīng)節(jié)中都有表達，在脊神經(jīng)結(jié)扎所致的外周神經(jīng)損傷模型中，脊髓背根神經(jīng)節(jié)中的HMGB1主要表達于神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細胞及小膠質(zhì)細胞[8]。HMGB1與病理性疼痛的發(fā)生密切相關(guān)，在大鼠的坐骨神經(jīng)或脊髓注射外源性的HMGB1可以誘導(dǎo)機械性痛覺超敏；給神經(jīng)痛的大鼠注射HMGB1特異性中和抗體，則能減輕大鼠的機械性痛覺超敏[9,10]。本研究結(jié)果提示白蛋白結(jié)合型紫杉醇作用大鼠后可成功誘導(dǎo)大鼠的痛覺過敏，同時L4-6脊髓中HMGB1的表達較對照組明顯升高，提示HMGB1可能也參與紫杉醇導(dǎo)致的神經(jīng)病理性疼痛的發(fā)生。

HMGB1被釋放到細胞外后可以激活相關(guān)的細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)受體，比如Toll樣受體家族、RAGE受體家族、JNK受體家族等。TLR4可通過MyD88依賴及MyD88非依賴途徑激活下游通路，TLR4的激活還依賴于一些接頭蛋白TRIF、IRF3等的參與。研究表明TLR4是HMGB1的下游信號，上調(diào)HMGB1可促進TLR4表達[2]。TLR4能夠引發(fā)巨噬細胞胞內(nèi)信號流，激活NF-κB、PI3K等信號通路，最終導(dǎo)致炎癥因子TNF-α、IL-6等的釋放[11]。此外，炎性因子TNF-α和IL-6也能引起HMGB1的釋放，血漿中或者神經(jīng)組織中的HMGB1又可調(diào)節(jié)致敏性損傷、誘導(dǎo)炎性因子的釋放，進而形成正反饋循環(huán)[12,13]。在術(shù)后慢性疼痛模型、脊髓損傷導(dǎo)致的慢性疼痛模型及普通劑型紫杉醇導(dǎo)致的神經(jīng)病理性疼痛模型中，TLR4通路均被激活，而抑制TLR4通路能一定程度緩解疼痛[14-16]。本研究也表明白蛋白結(jié)合型紫杉醇可導(dǎo)致大鼠L4-6脊髓TLR4的表達明顯升高，且TLR4通路的相關(guān)蛋白MyD88、TRIF、IRF3的表達及下游炎癥細胞因子TNF-α、IL-1β及IL-6的水平也升高，表明TLR4信號通路可能與神經(jīng)病理性疼痛有關(guān)，且HMGB1是TLR4的重要配體之一，白蛋白結(jié)合型紫杉醇可能通過釋放HMGB1，激活TLR4通路介導(dǎo)疼痛的發(fā)生。

膠質(zhì)細胞在脊髓中分布廣泛，在疼痛等病理條件下，膠質(zhì)細胞被激活，膠質(zhì)細胞標志物GFAP、Iba-1的表達增強，炎性因子TNF-α、IL-1β、IL-6等大量釋放[17]。本實驗研究表明白蛋白結(jié)合型紫杉醇使大鼠脊髓內(nèi)小膠質(zhì)細胞及星形膠質(zhì)細胞的標志物GFAP及Iba-1的表達升高，提示兩種膠質(zhì)細胞均被激活。既往研究發(fā)現(xiàn)，在神經(jīng)病理性疼痛的形成過程中，小膠質(zhì)細胞被激活，并激活星形膠質(zhì)細胞，而星形膠質(zhì)細胞可能在神經(jīng)病理性疼痛的產(chǎn)生和維持中起著重要的作用[18,19]。

綜上，白蛋白結(jié)合型紫杉醇可導(dǎo)致大鼠脊髓HMGB1/TLR4通路相關(guān)蛋白及下游炎性因子的表達增加，并促進膠質(zhì)細胞活化，HMGB1/TLR4通路可能與白蛋白結(jié)合型紫杉醇導(dǎo)致的神經(jīng)病理性疼痛有關(guān)。