張 蓉,閻春英,高淑娟,王 雪,單 虎,商博鑫*

(1陜西省人民醫(yī)院消化內科，西安 710068；2西安交通大學第二附屬醫(yī)院呼吸內科；*通訊作者,E-mail:shangboxinshb@163.com)

巨噬細胞作為人類免疫系統(tǒng)重要組成部分,參與機體內許多正常生理過程和病理過程,與感染、動脈粥樣硬化、肥胖、腫瘤、哮喘等眾多疾病密切相關[1]。機體發(fā)生炎癥后會造成局部組織缺氧，缺氧進一步誘導炎癥反應，促使局部炎癥微環(huán)境中大量的巨噬細胞浸潤[2,3]，低氧狀態(tài)下通過依賴于低氧誘導因子促進細胞外泌體的釋放。外泌體是由正常的或包含癌細胞在內的所有病變類型細胞分泌的細胞外微小囊泡，存在于所有體液和體外培養(yǎng)的細胞系中，其直徑大小約30～150 nm[4-6]。外泌體通過與周圍細胞之間相互交換信號分子進行細胞間信息傳遞，不僅能誘導炎癥反應而且能調節(jié)某些免疫反應，包括免疫的激活和免疫的抑制[7]，參與許多疾病的病理生理過程，如免疫反應、維持干細胞、組織修復、心血管疾病的病理過程、神經退行性變、腫瘤發(fā)生和炎癥[8]。巨噬細胞來源的外泌體在胰島素抵抗、炎癥性腸病、感染、腫瘤等很多疾病的發(fā)病機制中起著重要的作用。關于缺氧誘導巨噬細胞釋放的外泌體的特征及生物學特性目前研究甚少。因此，本研究主要觀察缺氧能否誘導巨噬細胞產生外泌體，進一步對外泌體的形態(tài)特征進行鑒定分析，為后續(xù)探索該外泌體在消化道炎癥性疾病及相關腫瘤中的生物學作用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

人單核細胞系THP-1及RPMI-1640培養(yǎng)基購自武漢普諾賽生命科技有限公司，胎牛血清購自美國的Gibco公司，能誘導THP-1細胞分化成巨噬細胞的佛波酯(phorbol 12-myristate 13-acetate，PMA)購自美國的MedChemexpress生物科技公司，總的外泌體提取試劑盒購自美國的Invitrogen生命技術有限公司，CD63兔抗人多克隆抗體購自武漢愛博泰克生物科技有限公司，HSP70鼠抗人單克隆抗體購自英國的Abcam公司，Histone作為核內參蛋白在此處作為外泌體蛋白的陰性對照，Histone H3鼠抗人單克隆抗體購自北京博奧森生物技術有限公司。BCA蛋白濃度測定試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司，缺氧培養(yǎng)箱Heal force HF100，透射電子顯微鏡JEM1230；納米顆粒跟蹤分析儀Nanosight NS300。

1.2 方法

1.2.1 巨噬細胞誘導培養(yǎng) 用含有10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基(含1%的青霉素和鏈霉素)培養(yǎng)人THP-1單核細胞，在37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，取對數生長期的細胞，制成單細胞懸液，接種至培養(yǎng)皿，待細胞密度達到80%后，采用含有PMA(0.1 mmol/L)的細胞培養(yǎng)基孵育培養(yǎng)24 h，促使THP-1細胞分化成為巨噬細胞。

1.2.2 缺氧誘導巨噬細胞的培養(yǎng) 將上述誘導分化好的巨噬細胞轉入25 ml培養(yǎng)瓶，加入含20%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液5 ml，置于37 ℃、5% CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h，然后在缺氧(37 ℃，5% CO2，93% N2，2% O2)培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)0，12，24 h，收集細胞培養(yǎng)上清液，分別收集20 ml細胞上清液進行后續(xù)實驗。

1.2.3 缺氧誘導巨噬細胞分泌外泌體 將收集到的細胞培養(yǎng)上清液經2 000g離心30 min，以去除細胞、碎片等物質，按照外泌體提取試劑盒說明書，以2 ∶1的體積加入細胞上清及外泌體提取液，將混合液于4 ℃孵育過夜，在4 ℃、10 000g離心1 h，所得沉淀即為所需外泌體，用PBS緩沖液重懸外泌體，分裝保存于4 ℃及-80 ℃，用于外泌體的下一步鑒定。

1.3 缺氧誘導巨噬細胞分泌外泌體的鑒定

1.3.1 外泌體蛋白含量的測定 使用BCA試劑盒按照說明書進行，將標準品進行適當稀釋，制成蛋白濃度為1，0.8，0.6，0.4，0.2 mg/ml的標準蛋白，將待測蛋白樣品及標準蛋白分別加入96孔板內，設置3個平行孔，每空加入20 μl，待反應結束后，用DG-3022A酶標儀測定OD568值，根據標準蛋白濃度和相應的OD值計算直線回歸方程，根據蛋白樣品OD值，利用回歸方程計算出樣品蛋白濃度。

1.3.2 Western blot測定外泌體中CD63、HSP70及Histone蛋白的表達 首先制備5%的濃縮膠和12%的分離膠，將提取的外泌體蛋白進行變性處理，在上樣孔中分別加入40 μg的蛋白樣品及Marker，先后以80 V和120 V的恒定電壓進行電泳分離，取出電泳凝膠根據Marker切下目標條帶，用濕轉法將凝膠中的蛋白轉移至PVDF膜上，再與CD63(1 ∶1 000)、HSP70(1 ∶1 000)、Histone(1 ∶20 000)一抗和相應二抗(1 ∶10 000，1 ∶10 000，1 ∶600)依次進行孵育。最后使用ECL試劑進行顯影曝光，掃描膠片，用BandScan軟件分析膠片灰度值。

1.3.3 透射電子顯微鏡觀察外泌體的形態(tài)和特征 將20 μl外泌體懸液滴于銅網表面，靜置3～5 min取出銅網，用濾紙條吸除多余的液體，采用3%磷鎢酸溶液進行室溫復染3～5 min，繼續(xù)使用濾紙吸除多余的液體，白熾燈下晾干。采用透射電子顯微鏡觀察并拍照記錄。

1.3.4 外泌體粒徑的測定 取20 μl外泌體懸液，用純水稀釋后通過針筒注入樣品池中，再把樣品池推入主機內，使用Nanosight NS300儀分析外泌體的粒徑大小。

1.4 統(tǒng)計學方法

2 結果

2.1 佛波酯誘導THP-1分化成巨噬細胞

THP-1細胞呈圓形或類圓形，待細胞培養(yǎng)生長密度達80%時，采用0.1 mmol/L的PMA誘導培養(yǎng)24 h，細胞分化成為梭形的巨噬細胞(見圖1)。

A.THP-1細胞 B.分化形成的巨噬細胞圖1 PMA誘導THP-1細胞分化成巨噬細胞 (×100)Figure 1 THP-1 cells and macrophages after PMA induction (×100)

2.2 外泌體的含量測定

以不同蛋白標準品的濃度為橫坐標，將各濃度蛋白標準品在568 nm處的吸光度值作為縱坐標繪制標準曲線，根據標準曲線計算出待測外泌體的濃度(見圖2)。結果顯示，缺氧0，12，24 h干預條件下，所得的20 ml細胞上清培養(yǎng)液分別提取的外泌體蛋白濃度約為(3.22±0.22)mg/ml，(3.24±0.22)mg/ml和(3.86±0.18)mg/ml。缺氧干預24 h所得的外泌體蛋白含量明顯高于缺氧干預0 h及12 h，差異有統(tǒng)計學意義(P=0.009，0.01)，然而，缺氧0 h與缺氧干預12 h相比，產生的外泌體蛋白含量之間的差異無統(tǒng)計學意義(P=0.939)。

圖2 BCA標準曲線檢測外泌體蛋白濃度Figure 2 The protein concentration of exosome detected by BCA standard curve

2.3 缺氧誘導巨噬細胞外泌體的標記蛋白表達

CD63、HSP70在各種細胞的外泌體中均有表達，是外泌體特征性的標記蛋白，而Histone作為外泌體的陰性對照蛋白。本研究經Western blot分析顯示，缺氧干預巨噬細胞分泌的外泌體中存在HSP70、CD63蛋白表達(見圖3)，而Histone蛋白無表達。缺氧0 h與缺氧12 h相比，HSP70蛋白水平的表達無差異(P=0.451)，相反，缺氧24 h誘導巨噬細胞分泌的外泌體中HSP70蛋白水平均明顯高于其他兩組(P分別為0.007，0.018)；此外，缺氧12 h和缺氧24 h誘導巨噬細胞產生的外泌體中CD63蛋白水平均顯著高于缺氧0 h(P分別為0.02，0.001)，并且隨著缺氧干預時間延長，CD63蛋白水平明顯增加(P=0.042)。綜上得出，缺氧干預24 h誘導巨噬細胞產生的外泌體含量最高，因此，后續(xù)的透射電鏡及NTA實驗進一步分析了缺氧誘導干預24 h產生外泌體的形態(tài)特征。

與缺氧0 h組相比，*P<0.05；與缺氧12 h組相比，#P<0.05圖3 外泌體中HSP70、CD63、Histone蛋白水平隨時間的變化Figure 3 The protein levels of HSP70, CD63 and Histone in exosome over time

2.4 缺氧誘導巨噬細胞分泌外泌體的形態(tài)特征表現

透射電子顯微鏡結果顯示，缺氧誘導巨噬細胞分泌的外泌體呈形態(tài)均一的類圓形，表面有完整的雙層模型結構，其內部含有低密度物質，多呈單個散狀分布(見圖4A)。采用NTA檢測系統(tǒng)進一步分析外泌體顆粒的粒徑大小，結果顯示，外泌體的粒徑集中在(150±44)nm，大多數外泌體顆粒的粒徑集中在154 nm左右(見圖4B)。

A.外泌體在透射電鏡下呈現雙膜結構 (×60 000)B.NTA檢測外泌體顆粒的粒徑大小圖4 外泌體的形態(tài)特征Figure 4 Morphological characteristics of exosome

3 討論

巨噬細胞主要來源于單核細胞系統(tǒng)，是人體免疫系統(tǒng)的關鍵組分，通過吞噬作用識別和清除細菌、真菌和病毒等入侵病原體及調節(jié)血管生成，維持機體內穩(wěn)態(tài)[3,9,10]。當機體受到某種慢性損傷等因素刺激時，這種內穩(wěn)態(tài)環(huán)境被破壞，從而導致許多疾病發(fā)生。缺氧就是其中的一種損傷，主要存在于炎癥及腫瘤組織中。研究證明，當巨噬細胞在體外經歷缺氧時，能夠促使VEGF、TNF-α、IL-8等基因表達上調，進而發(fā)揮促炎、促血管生成、誘導細胞凋亡及招募更多的巨噬細胞或炎癥細胞等生物學作用[3]。巨噬細胞活化后釋放的外泌體，如miRNA等，被受體細胞接收后，可以介導許多炎癥相關性疾病及腫瘤的發(fā)生。如溶血卵磷脂刺激巨噬細胞來源的外泌體能夠顯著增加心臟成纖維細胞的增殖、遷移和分化能力[11]。當巨噬細胞受到腫瘤壞死因子樣弱凋亡誘導因子(tumor necrosis factor-like weak inducer of apoptosis)刺激后產生的外泌體能抑制卵巢癌細胞的侵襲和遷移[12]。多項研究顯示，脂肪組織巨噬細胞來源的外泌體可以調節(jié)胰島素抵抗[13-15]。巨噬細胞來源的外泌體miR-223通過靶向激活PI3K/AKT信號通路促進胃癌細胞發(fā)生侵襲和轉移[16]。此外，另一項研究顯示，缺氧誘導的巨噬細胞上清液通過VEGF促進胃癌細胞的增殖和侵襲[17]，考慮到此細胞上清液為外泌體提取的前體物質，可推測出該上清液的促腫瘤作用可能也是通過外泌體的作用實現。

本研究采用缺氧干預巨噬細胞，收集培養(yǎng)上清液后，采用外泌體提取試劑盒分離提取外泌體。目前對于外泌體的鑒定方法主要有蛋白免疫印跡分析外泌體特異性蛋白分子、透射電子顯微鏡觀察外泌體形態(tài)及外泌體粒徑測定等[18]。一般用高爾基標記蛋白GM130、內質網標記蛋白Calnexin及細胞核標記蛋白Histone等特定細胞器蛋白作為鑒定外泌體蛋白表達的陰性對照。本研究得出，相比缺氧0 h及12 h，缺氧干預24 h后所獲得的外泌體蛋白含量較高，能滿足后續(xù)實驗的需求。

與常氧條件相比，缺氧能有效促進外泌體的標記蛋白HSP70、CD63表達，而Histone陰性對照蛋白無表達，相比缺氧干預12 h，缺氧干預24 h的外泌體蛋白分子含量更高，差異有統(tǒng)計學意義。因此，后續(xù)實驗采用缺氧干預24 h為目標時間進行形態(tài)學分析，進一步采用透射電子顯微鏡觀察外泌體的形態(tài)特征。結果顯示，外泌體呈形態(tài)均一的類圓形，表面有完整的雙層模型結構，多呈單個散狀分布；采用NTA檢測系統(tǒng)分析出大多數外泌體顆粒的粒徑集中在154 nm左右。該研究顯示，缺氧能夠誘導巨噬細胞產生外泌體，符合外泌體的粒徑范圍[4]。證實采用試劑盒提取的外泌體純度較高，能將外泌體提取完全，能夠滿足后續(xù)實驗的要求。通過以上結果進一步證實了缺氧干預的巨噬細胞具有分泌外泌體的功能，為后續(xù)進一步研究外泌體的生物學作用奠定基礎。

本研究采用缺氧干預巨噬細胞，利用試劑盒方法成功從細胞培養(yǎng)上清液中分離提取出外泌體，通過檢測其特異性標志蛋白及形態(tài)學分析顯示提取的外泌體含量及純度較高，為后續(xù)研究缺氧誘導巨噬細胞來源的外泌體在消化道炎癥性疾病及腫瘤等病變中的生物學作用奠定了實驗基礎，保證今后相關實驗的順利開展。