杜加亮，于傳飛，王文波，武 剛，崔永霏，郭璐韻，楊雅嵐，俞小娟，李 萌，王 蘭

(中國食品藥品檢定研究院單克隆抗體產(chǎn)品室，衛(wèi)生部生物技術(shù)產(chǎn)品檢定及標(biāo)準(zhǔn)化重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，國家藥品監(jiān)督管理局生物制品質(zhì)量研究與評價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 102629；#共同第一作者；*通訊作者,E-mail:wanglan@nifdc.org.cn)

單克隆抗體在腫瘤患者臨床治療中的作用受到越來越廣泛的關(guān)注和重視，我國也將部分單克隆抗體納入醫(yī)保[1]。2021年美國食品藥品管理局(Food and Drug Administration，F(xiàn)DA)批準(zhǔn)了第100個(gè)單抗制品[2]，預(yù)計(jì)2022年單抗的全球銷售額將高達(dá)2 000億美元[3]。隨著新靶點(diǎn)、研發(fā)管線和生物類似藥的不斷增加，以及對單抗作用機(jī)制研究的不斷深入[4]，監(jiān)管部門對于單抗制品的質(zhì)量控制也提出了越來越高的要求。

神經(jīng)母細(xì)胞瘤(neuroblastoma，NB)是兒童最常見的顱外實(shí)體腫瘤，其中高危NB患兒中仍有一半以上在經(jīng)過各種治療后終因復(fù)發(fā)而死亡[5]。自20世紀(jì)80年代以來，科學(xué)家陸續(xù)發(fā)現(xiàn)雙唾液酸神經(jīng)節(jié)苷脂(disialoganglioside，GD2)在幾乎所有的NB中高表達(dá)，而在正常人組織中的表達(dá)有限，因此GD2作為癌癥免疫治療的主要靶標(biāo)具有很高的價(jià)值，也被美國國家癌癥研究所列為75種潛在抗癌靶標(biāo)中的第12位[6]。經(jīng)過40多年的發(fā)展，目前已有3種抗GD2單抗獲得FDA或歐洲藥品管理局(EMA)的批準(zhǔn)上市[7-9]，用于高危NB患兒的臨床治療。我國僅有一種抗GD2單抗于2021年獲批上市，另一種正在審評中。

伴隨著該單抗制品在我國高危NB患兒臨床治療中的使用，將有越來越多的針對該靶點(diǎn)的原研藥和生物類似藥的研發(fā)。因此，為了有效地對抗GD2單抗進(jìn)行質(zhì)量控制，保證其安全性和有效性，本研究依據(jù)現(xiàn)行版《中華人民共和國藥典》和人用藥品注冊技術(shù)要求國際協(xié)調(diào)會(huì)議(The International Council for Harmonisation of Technical Requirements for Pharmaceuticals for Human Use，ICH)的指導(dǎo)要求[10,11]，研究建立抗GD2單抗的生物學(xué)活性、結(jié)合活性、純度分析、電荷異質(zhì)性分析、糖基化分析等方法，針對產(chǎn)品的關(guān)鍵質(zhì)量屬性進(jìn)行分析和探討，為抗GD2單抗的質(zhì)量控制提供依據(jù)和指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 抗體和主要試劑

重組人源化抗GD2單克隆抗體(以下簡稱抗GD2單抗)及其參比品為中國食品藥品檢定研究院單克隆抗體產(chǎn)品室留存。人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞LA-N-1和補(bǔ)體購自德國Merck公司。重組人GD2抗原購自美國Santa Cruz公司。重組人CD16a抗原購自加拿大R&D SYSTEMS公司。二硫蘇糖醇(DTT)、8.0 mol/L鹽酸胍、色譜級甲酸和乙腈購自美國ThermoFisher Scientific公司。碘乙酰胺(IAM)購自美國AMRESCO公司。載體兩性電解質(zhì)Pharmalyte 3-10、8-10.5及氨偶聯(lián)試劑盒購自美國GE Healthcare公司。pI標(biāo)志物5.85及9.22、1%甲基纖維素溶液、0.5%甲基纖維素溶液、cIEF柱FC-涂層均購自美國ProteinSimple公司。三氟乙酸(TFA)、乙二胺四乙酸四鈉鹽水合物(EDTA)、2-甲基吡啶硼烷、2-氨基苯甲酰胺、甲酸銨、遺傳霉素、2-巰基乙醇、N-乙基馬來酰亞胺(NEM)、一水合磷酸二氫鈉、無水磷酸氫二鈉、無水硫酸鈉及5%疊氮化鈉溶液均購自美國Sigma公司。谷氨酰胺、胎牛血清、細(xì)胞培養(yǎng)基RPMI-1640購自美國Gibco公司。N-糖苷酶F、質(zhì)譜級胰蛋白酶、Bio-Glo熒光素酶檢測試劑盒、Cell Titre-Glo試劑盒、ADCP報(bào)告基因檢測試劑盒購自美國Promega公司。

1.2 LA-N-1細(xì)胞殺傷試驗(yàn)測定抗GD2單抗的補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性(complement-dependent cytotoxicity，CDC)作用

取對數(shù)生長期的LA-N-1細(xì)胞用測定培養(yǎng)基懸浮，并調(diào)至細(xì)胞密度約為0.75×106個(gè)/ml，以25 μl/孔加入96孔板；用測定培養(yǎng)基稀釋樣品，以90 μg/ml為起始濃度，按照1 ∶4，1 ∶4，1 ∶3，1 ∶3，1 ∶3，1 ∶3，1 ∶4，1 ∶4的比例(V/V)依次稀釋(共9個(gè)稀釋度，包括起始濃度)，以25 μl/孔加入對應(yīng)孔中，37 ℃，5% CO2培養(yǎng)15～30 min；取補(bǔ)體工作液(10 ml測定培養(yǎng)基稀釋2.3 ml補(bǔ)體)以25 μl/孔加入相應(yīng)孔中，吹打混勻至少5次，37 ℃，5% CO2培養(yǎng)4～5 h；取平衡至室溫的CellTitre-Glo溶液，以75 μl/孔加入對應(yīng)孔中，100～150 r/min室溫避光震蕩2～5 min裂解細(xì)胞，室溫避光孵育10～30 min，使用熒光酶標(biāo)儀讀板。采用四參數(shù)法，以樣品濃度的對數(shù)為橫坐標(biāo)，以平均吸收值為縱坐標(biāo)，計(jì)算半效濃度(EC50，ng/ml)。

1.3 熒光素酶報(bào)告基因法測定抗GD2單抗的抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞吞噬(antibody-dependent cell-mediated phagocytosis，ADCP)效應(yīng)

取對數(shù)生長期的LA-N-1細(xì)胞用測定培養(yǎng)基懸浮，并調(diào)至細(xì)胞密度約為0.4×106個(gè)/ml，以25 μl/孔加入96孔板；用測定培養(yǎng)基稀釋樣品，以3 μg/ml為起始濃度，按照1 ∶2，1 ∶2，1 ∶2，1 ∶1.5，1 ∶1.5，1 ∶2.3，1 ∶2，1 ∶2的比例依次稀釋(共9個(gè)稀釋度，包括起始濃度)，以25 μl/孔加入對應(yīng)孔中；取液氮保存的ADCP效應(yīng)細(xì)胞于37 ℃水浴1 min，用測定培養(yǎng)基將細(xì)胞密度調(diào)為0.4×106個(gè)/ml，以25 μl/孔加入對應(yīng)孔中，吹打混勻至少4次，37 ℃，5% CO2培養(yǎng)過夜；取平衡至室溫的Bio-Glo溶液，以75 μl/孔加入對應(yīng)孔中，室溫避光孵育10～30 min，使用熒光酶標(biāo)儀讀板。采用四參數(shù)法，以樣品濃度的對數(shù)為橫坐標(biāo)，以平均吸收值為縱坐標(biāo)，計(jì)算半效濃度(EC50，ng/ml)。

1.4 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme-liked immunosorbent assay，ELISA)測定抗GD2單抗的GD2結(jié)合活性

取2 μg/ml GD2工作液，以50 μl/孔加入高結(jié)合的96孔板中，于30 ℃真空離心機(jī)中完全干燥。后加入封閉液300 μl/孔，于2～8 ℃封閉過夜。以500 ng/ml為起始濃度，按照1 ∶2倍比稀釋樣品，共11個(gè)稀釋度，以100 μl/孔至對應(yīng)孔中，37 ℃孵育60 min。取200 ng/ml的檢測抗體工作液，以100 μl/孔加入，室溫孵育60 min。取TMB底物溶液以100 μl/孔加入，室溫孵育10 min。以100 μl/孔加入終止液，用酶標(biāo)儀以650 nm波長為參比波長，在波長450 nm處測定吸光度。

1.5 采用SPR-Biacore法測定抗GD2單抗的CD16結(jié)合活性

樣品自320.89 nmol/L稀釋濃度起，以2.8倍系列稀釋至0.24 nmol/L(共8個(gè)稀釋度)。取50 μg/ml抗His抗體工作液偶聯(lián)420 s(30 μl/min)。CM5芯片使用EDC/NHS溶液(1 ∶1)活化420 s(10 μl/min)，使用1 mmol/L乙醇胺(pH 8)去活化420 s(10 μl/min)。分析參數(shù)：使用系列S傳感器芯片CM5、1×HBS-EP+運(yùn)行緩沖液、再生溶液(甘氨酸pH 1.5 10 mmol/L)、稀釋液1×HBS-EP+、FcγRIIIA(V)濃度1 μg/ml、配體捕獲接觸時(shí)間和速率分別為24 s和10 μl/min，分析物接觸時(shí)間和速率分別為120 s和30 μl/min、再生接觸時(shí)間和速率分別為60 s和30 μl/min。

1.6 還原/非還原十二烷基硫酸鈉毛細(xì)管凝膠電泳(capillary electrophoresis-sodium dodecyl sulfonate，CE-SDS)法進(jìn)行純度分析

用超純水將樣品稀釋至10 mg/ml，取該溶液10 μl，加入SDS樣品緩沖液75 μl，另外，還原CE-SDS法加入巰基乙醇5 μl，非還原CD-SDS法加入0.1 mol/L N-乙基馬來酰亞胺5 μl，混勻，之后在72 ℃水浴條件下孵育8 min，室溫放置5 min，渦旋混勻并離心之后取90 μl置于進(jìn)樣瓶中后上機(jī)分析。使用Beckman PA800 plus毛細(xì)管電泳系統(tǒng)，無涂層毛細(xì)管(內(nèi)徑50 μm，總長度31 cm，有效長度21 cm)檢測。檢測條件：進(jìn)樣電壓為5.0 kV，分離電壓為15 kV，毛細(xì)管溫度為25 ℃，樣品室溫度為15 ℃，紫外檢測波長為220 nm。計(jì)算樣品輕鏈峰+重鏈峰(還原型)或主峰(非還原型)峰面積百分比以及片段峰面積百分比。

1.7 分子排阻色譜(size exclusion-high performance liquid chromatography，SE-HPLC)法分析樣品純度

取濃度為2～5 mg/ml的樣品20 μl，采用Waters e2695高效液相色譜系統(tǒng)配備紫外檢測器、Acquity UPLC BEH200 SEC色譜柱(1.7 μm，4.6 nm×300 mm)進(jìn)行檢測。流動(dòng)相由0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液和0.25 mol/L Na2SO4配制而成，pH為6.8，流速為0.4 ml/min，上樣量20 μl，進(jìn)樣器溫度5 ℃，柱溫30 ℃，在波長280 nm處檢測，使用面積歸一化法計(jì)算單體和聚合物的百分比。

1.8 電荷異質(zhì)性分析

使用毛細(xì)管等電聚焦電泳(capillary isoelectric focusing electrophoresis，cIEF)法進(jìn)行分析，將樣品用Nanosep超濾離心管10 000g離心干燥(約3 min)。使用去離子水重懸，吹打混勻，調(diào)整濃度至約4.0 mg/ml，取上述置換緩沖液的供試品或標(biāo)準(zhǔn)品20 μl，加入兩性電解質(zhì)混合物180 μl，渦旋混勻，以10 000g離心5 min。取上清液150 μl，置于進(jìn)樣瓶中，以7 000 r/min離心3 min。分析條件：預(yù)聚焦電壓1.5 kV，持續(xù)1 min；聚焦電壓3 kV，持續(xù)時(shí)間為10 min。

1.9 糖基化分析

使用超高效液相色譜法進(jìn)行分析，將相當(dāng)于200 μg單抗的樣品溶液用50 mmol/L碳酸氫銨緩沖液稀釋至2 mg/ml，取80 μl加入預(yù)處理后的Zeba Spin脫鹽柱，1 500g離心2 min，收集離心液。取置換緩沖液的樣品7.5 μl(即約15 μg糖蛋白)，加水15.3 μl。加入配制的5% RapiGes溶液6 μl，110 ℃孵育5 min，室溫冷卻5 min。變性后樣品加入N糖苷酶F 1.2 μl，57 ℃孵育5 min，室溫冷卻3 min；取釋放N-聚糖的樣品加入配制的RapiFluor-M標(biāo)記溶液12 μl，室溫孵育約5 min。加入乙腈358 μl，稀釋；取HILIC μElution平板，依次取水、水/乙腈(15/85)以200 μl/孔平衡樹脂。加入處理好的供試品，取甲酸/水/乙腈溶液(1/9/90)以600 μl/孔洗板，重復(fù)2次。后加入SPE洗脫緩沖液30 μl洗脫，重復(fù)3次。最后加入樣品稀釋劑(DMF/ACN 32/68，V/V)310 μl，即得純化N-糖樣品。上樣分析。色譜條件：流動(dòng)相A為50 mmol/L甲酸銨，pH 4.4；流動(dòng)相B為乙腈。使用Waters H-Class超高效液相色譜儀，熒光檢測器進(jìn)行分析，檢測器激發(fā)波長265 nm，發(fā)射波長425 nm，色譜柱為Waters Acquity UPLC Glycan BEH amide 1.7 μm，150 mm×2.1 mm；進(jìn)樣體積為10 μl，柱溫60 ℃，樣品盤溫度8 ℃。采用面積歸一化計(jì)算單個(gè)聚糖的含量。

2 結(jié)果

2.1 抗GD2單抗參比品的生物學(xué)活性分析結(jié)果

ADCP和CDC效應(yīng)測定所得數(shù)據(jù)均符合四參數(shù)方程式：Y=(A-D)/[1+(X/C)B]+D，即在半對數(shù)坐標(biāo)上呈現(xiàn)典型的S型曲線(見圖1和圖2)。在ADCP效應(yīng)評價(jià)中，抗GD2單抗參比品的EC50值為(24.24±0.57)ng/ml，6次實(shí)驗(yàn)的RSD值為13.88%。在CDC效應(yīng)評價(jià)中，抗GD2單抗參比品的EC50值為(0.49±0.003)ng/ml，6次實(shí)驗(yàn)的RSD值為0.61%。

圖1 抗GD2單抗ADCP效應(yīng)的劑量反應(yīng)曲線Figure 1 Dose-response curves of ADCP effect of anti-GD2 mAb

2.2 抗GD2單抗參比品的結(jié)合活性分析結(jié)果

GD2和CD16結(jié)合活性檢測所得數(shù)據(jù)也均符合四參數(shù)方程式：Y=(A-D)/[1+(X/C)B]+D，即在半對數(shù)坐標(biāo)上呈現(xiàn)典型的S型曲線(見圖3和圖4)。在GD2結(jié)合活性評價(jià)中，抗GD2單抗參比品的EC50值為(17.53±2.14)ng/ml，6次實(shí)驗(yàn)的RSD值為1.21%。在CD16結(jié)合活性評價(jià)中，抗GD2單抗參比品的EC50值為(99.40±1.43)nmol/L，6次實(shí)驗(yàn)的RSD值為1.44%。

圖2 抗GD2單抗CDC作用的劑量反應(yīng)曲線Figure 2 Dose-response curves of CDC effect of anti-GD2 mAb

圖3 抗GD2單抗的GD2結(jié)合活性的劑量反應(yīng)曲線Figure 3 Dose-response curve of GD2-binding activity of anti-GD2 mAb

圖4 抗GD2單抗的CD16結(jié)合活性的劑量反應(yīng)曲線Figure 4 Dose-response curve of CD16-binding activity of anti-GD2 mAb

2.3 抗GD2單抗參比品的純度分析結(jié)果

非還原CE-SDS分析表明，抗GD2單抗參比品的主峰面積百分比為(98.61±0.17)%(見圖5)，6次實(shí)驗(yàn)的RSD值為0.17%。還原CE-SDS分析表明，抗GD2單抗參比品的重鏈(HC)和輕鏈(LC)的峰面積百分比之和為(97.39±0.15)%(見圖6)，6次實(shí)驗(yàn)的RSD值為0.15%。SE-HPLC分析表明，抗GD2單抗參比品主峰峰面積百分比為(98.32±0.01)%(見圖7)，6次實(shí)驗(yàn)的RSD值為0.01%。

圖5 抗GD2單抗純度的非還原CE-SDS純度分析圖譜Figure 5 The non-reduced CE-SDS purity analysis of anti-GD2 mAb

圖6 抗GD2單抗純度的還原CE-SDS純度分析圖譜Figure 6 The reduced CE-SDS purity analysis of anti-GD2 mAb

圖7 抗GD2單抗純度的SE-HPLC純度分析圖譜Figure 7 The SE-HPLC purity analysis of anti-GD2 mAb

2.4 抗GD2單抗參比品的電荷異質(zhì)性分析結(jié)果

cIEF分析表明，抗GD2單抗參比品中峰“l(fā)”的峰面積百分比為(14.88±0.15)%(見圖8)，6次實(shí)驗(yàn)的RSD值為1.01%；峰“m”的峰面積百分比為(37.18±0.37)%，6次實(shí)驗(yàn)的RSD值為1.00%；峰“n”的峰面積百分比為(38.67±0.50)%，6次實(shí)驗(yàn)的RSD值為1.29%。

圖8 抗GD2單抗的等電點(diǎn)及電荷異質(zhì)性的cIEF分析Figure 8 The cIEF analysis of isoelectric point and charge heterogeneity of anti-GD2 mAb

2.5 抗GD2單抗參比品的糖基化分析結(jié)果

每個(gè)單糖所占比例由熒光圖計(jì)算所得，結(jié)果見圖9。將相對百分比≥1%的單糖按照巖藻糖基化和半乳糖基化分為兩類進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果顯示抗GD2單抗巖藻糖基化單糖合計(jì)所占比例為(97.41±0.04)%，6次實(shí)驗(yàn)的RSD值為0.04%，半乳糖基化單糖合計(jì)所占比例為(18.93±0.07)%，6次實(shí)驗(yàn)的RSD值為0.37%。

G0F、G1F(6)、G1F(6)、G2F中的G表示半乳糖,F表示巖藻糖，G后面的數(shù)字表示連接到兩個(gè)N乙酰氨基葡萄糖(GlcNAc)的末端半乳糖(galactose)的數(shù)量，F(xiàn)后面括號(hào)中的數(shù)字表示巖藻糖的數(shù)目(沒有數(shù)字表示僅存在核心巖藻糖)圖9 抗GD2單抗的糖基化分析Figure 9 Glycosylation profiling of anti-GD2 mAb

3 討論

《中國藥典》2020年版明確提出應(yīng)采用現(xiàn)有先進(jìn)的分析手段，從物理化學(xué)、免疫學(xué)、生物學(xué)等角度對單抗制品進(jìn)行全面的分析，并提供盡可能詳盡的信息，以反映目標(biāo)產(chǎn)品內(nèi)在的天然質(zhì)量屬性。其中最為關(guān)鍵的一項(xiàng)是應(yīng)依據(jù)單抗預(yù)期的、潛在的作用機(jī)制或工作模式(可能不限于一種)建立相應(yīng)的生物學(xué)分析方法[10]。以往研究表明，抗GD2單抗的作用機(jī)制包括Fc段介導(dǎo)的ADCC、ADCP和CDC效應(yīng)，以及Fab段介導(dǎo)的直接殺傷作用和抑制循環(huán)中腫瘤細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)蛋白成分的結(jié)合和細(xì)胞歸巢等[12,13]。據(jù)此，本研究從Fc段和Fab段兩個(gè)層面對抗GD2抗體的生物學(xué)活性進(jìn)行了綜合全面的評價(jià)。包括以基于細(xì)胞水平殺傷的ADCP和CDC效應(yīng)實(shí)驗(yàn)和基于SPR-Biacore的CD16結(jié)合實(shí)驗(yàn)(代替細(xì)胞水平的ADCC效應(yīng)實(shí)驗(yàn))來評估抗GD2抗體的Fc段生物學(xué)功能，以基于ELISA的GD2結(jié)合實(shí)驗(yàn)(代替細(xì)胞水平的直接殺傷實(shí)驗(yàn))來評估抗GD2抗體的Fab段生物學(xué)功能。由于細(xì)胞水平的生物學(xué)功能研究更能有效地模擬抗體的真實(shí)功能[14]，因此本研究下一步將建立基于細(xì)胞水平的ADCC和Fab段生物學(xué)功能實(shí)驗(yàn)，并與現(xiàn)有的結(jié)合實(shí)驗(yàn)進(jìn)行平行性比較。但在常規(guī)的質(zhì)量控制活動(dòng)中，應(yīng)根據(jù)需要選擇既能反映真實(shí)生物學(xué)活性又便于實(shí)施操作的實(shí)驗(yàn)手段。

抗體藥物的純度檢測和控制貫穿于工藝開發(fā)的整個(gè)生命周期中。SDS-聚丙烯酰胺毛細(xì)管電泳(CE-SDS)和分子排阻液相色譜(SE-HPLC)是兩種主要的抗體藥物純度分析方法[15]。由于這兩種方法檢測原理的不同，導(dǎo)致其反映的抗體純度的側(cè)重點(diǎn)也不同。比如，非還原型CE-SDS側(cè)重將完整抗體和不完整抗體(非共價(jià)鍵連接的片段)分開，還原型CE-SDS能將非糖基化重鏈和斷裂片段檢測出來，而SE-HPLC則是在比較溫和的實(shí)驗(yàn)條件下將聚體(共價(jià)和非共價(jià)結(jié)合)和單體有效分離。本研究中同樣將兩種方法共同作為抗GD2抗體純度的質(zhì)控方法?？笹D2抗體部分生物學(xué)活性的發(fā)揮依靠Fc段功能，而重鏈的糖基化與Fc段功能有關(guān)，因此理論上在還原型CE-SDS中應(yīng)該增加對非糖基化重鏈的控制。但是考慮到其活性已經(jīng)從ADCP、CDC以及GD2和CD16結(jié)合等4個(gè)方面進(jìn)行了全面的質(zhì)控，故未在還原型CE-SDS中納入非糖基化重鏈的控制。

由于抗體是一種具有復(fù)雜翻譯后修飾的生物大分子，決定了抗體藥物的微觀不均一性。而幾乎所有這種微觀不均一的變體均能導(dǎo)致抗體表面電荷分布的差異，因此電荷的變化也成為監(jiān)測抗體降解和生產(chǎn)工藝一致性分析的重要指標(biāo)。目前用于電荷異質(zhì)性研究的常用方法有IEF、cIEF、icIEF、CEX、RP-HPLC、LC-MS等，每種方法各有優(yōu)缺點(diǎn)。本研究使用的cIEF可根據(jù)抗體凈電荷的變化精確地分離鑒別每種電荷變體，并選擇了占比前三位的電荷變體建立了質(zhì)控方法。

抗體的糖基化是一種復(fù)雜的翻譯后修飾，對單抗藥物的療效、穩(wěn)定性、免疫原性、藥代動(dòng)力學(xué)性質(zhì)等具有重要影響[16,17]。例如，核心巖藻糖基化的缺失會(huì)由于對FcγR受體的親和力增加而增強(qiáng)ADCC和ADCP效應(yīng)，末端半乳糖基化減少會(huì)降低CDC效應(yīng)等。有研究表明，在GnT1缺陷型CHO細(xì)胞中表達(dá)的抗GD2抗體攜帶Man5-GlcNAc2糖基化，而α1,6-巖藻糖缺失，與親本抗GD2抗體或其他Fc增強(qiáng)突變體相比，在體外和體內(nèi)抗腫瘤方面，作為治療性抗體的潛力更大[18]。另外，雖然半乳糖基化對抗體效應(yīng)功能的影響目前了解得相對較少，但是有研究表明半乳糖基化是以CDC為作用機(jī)制的單抗的關(guān)鍵質(zhì)量屬性，并且深入分析了末端半乳糖與單抗治療中補(bǔ)體激活的結(jié)構(gòu)-功能關(guān)系[19]?；诖?，本研究選擇了通過熒光檢測器的檢測確定各個(gè)糖型的比例，并通過巖藻糖基化和半乳糖基化的抗體比例建立了糖基化檢測的質(zhì)控方法。

綜上所述，本研究根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)并依據(jù)《中國藥典》和ICH Q6B的指導(dǎo)原則[10,11]，針對抗GD2單抗的質(zhì)量控制開展了研究。根據(jù)抗GD2單抗產(chǎn)品的特性和作用機(jī)制，確定了關(guān)鍵質(zhì)量屬性并建立了基于不同原理的質(zhì)控方法，對我國抗GD2單抗藥物的研發(fā)具有借鑒意義。隨著新技術(shù)的出現(xiàn)以及對該靶點(diǎn)作用機(jī)制更深入的研究，其質(zhì)控方法也將會(huì)隨之不斷發(fā)生變化。