楊 陽(yáng)，孫瑞芳，李玉龍，孫 娜*

(1陜西中醫(yī)藥大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院衛(wèi)生毒理學(xué)教研室，咸陽(yáng) 712046；2西安交通大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理學(xué)系；3陜西省人民醫(yī)院消化內(nèi)科；*通訊作者,E-mail:283529713@qq.com)

甲基化CpG結(jié)合蛋白2(methyl-CpG-binding domain protein 2，MeCP2)基因定位于染色體Xq28，是甲基化CpG結(jié)合域蛋白MBD家族(methyol-CpG-binding domain protein family，MBD)的重要的成員之一?，F(xiàn)有研究表明MeCP2蛋白是一種多功能蛋白，廣泛參與基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控、miRNA、lincRNA的表達(dá)、染色質(zhì)重塑等過(guò)程[1-3]?，F(xiàn)有研究表明MeCP2在結(jié)直腸癌[4]、口腔鱗狀細(xì)胞癌[5]、前列腺癌[6]等腫瘤的發(fā)生發(fā)展中扮演著重要角色。MeCP2在乳腺腫瘤組織中表達(dá)水平高于在非腫瘤組織中的表達(dá)，且其能夠影響乳腺癌的發(fā)展[7],linc-ROR/miR-194-3p/MeCP2軸在雷帕霉素治療期間促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的存活[8]。MeCP2通過(guò)與中性α-葡萄糖苷酶AB(GANAB)啟動(dòng)子的第2個(gè)甲基化CpG島結(jié)合調(diào)控GANAB表達(dá)，從而改變糖模式并影響胃癌細(xì)胞的增殖和凋亡[9]。在人結(jié)直腸腺癌上皮細(xì)胞DLD-1中抑制MeCP2的表達(dá)可抑制DLD-1細(xì)胞的增殖及遷移，提示MeCP2可能作為結(jié)直腸癌基因治療的潛在靶點(diǎn)[10]。有研究表明MeCP2參與circRNA對(duì)肝細(xì)胞癌索拉非尼耐藥的調(diào)控[11]。為探索MeCP2在腫瘤中的作用，本研究應(yīng)用生物信息學(xué)方法分析了MeCP2在不同腫瘤中的表達(dá)及其與多種腫瘤預(yù)后的關(guān)系，此外，本研究通過(guò)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步確認(rèn)MeCP2在肝癌細(xì)胞中的作用。

1 材料和方法

1.1 材料

Trizol裂解液、Lipofectamine2000購(gòu)自Invitrogen公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒及定量PCR試劑盒購(gòu)自TaKaRa公司。MeCP2過(guò)表達(dá)載體及其對(duì)照購(gòu)自上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司。si-MeCP2購(gòu)自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司。Hep3B細(xì)胞培養(yǎng)于10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，培養(yǎng)于5% CO2，37 ℃培養(yǎng)箱。

1.2 生物信息學(xué)分析MeCP2在腫瘤中的表達(dá)及預(yù)后

利用TIMER2.0[12](http://timer.cistrome.org)數(shù)據(jù)庫(kù)分析MeCP2在多種腫瘤中的表達(dá)情況，應(yīng)用GEPIA2[13](http://gepia2.cancer-pku.cn)數(shù)據(jù)庫(kù)分析MeCP2的表達(dá)與腫瘤患者生存期的關(guān)系；應(yīng)用cBioPortal[14](https://www.cbioportal.org)觀察MeCP2在不同腫瘤中發(fā)生遺傳變異的頻率；應(yīng)用UALCAN[15](http://ualcan.path.uab.edu)分析MeCP2在不同年齡段肝細(xì)胞癌患者中的表達(dá)及MeCP2在肝細(xì)胞癌患者TP53突變組及TP53未突變組的表達(dá)。

1.3 qRT-PCR檢測(cè)MeCP2的表達(dá)水平

將si-MeCP2、si-ctrl、ov-MeCP2、ov-ctrl分別轉(zhuǎn)染至Hep3B細(xì)胞，48 h后提取RNA，根據(jù)生物信息學(xué)設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄及熒光實(shí)時(shí)定量PCR，檢測(cè)MeCP2的表達(dá)水平。

1.4 細(xì)胞體外實(shí)驗(yàn)

1.4.1 分組及干預(yù) 實(shí)驗(yàn)分為si-MeCP2組和si-ctrl組，分別轉(zhuǎn)染si-MeCP2、si-ctrl至Hep3B細(xì)胞；實(shí)驗(yàn)分為ov-MeCP2組和ov-ctrl組，分別轉(zhuǎn)染ov-MeCP2、ov-ctrl至Hep3B細(xì)胞。轉(zhuǎn)染后于37 ℃ 5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

1.4.2 CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)MeCP2對(duì)Hep3B細(xì)胞生物學(xué)活性的影響 按上述分組將轉(zhuǎn)染后的Hep3B細(xì)胞于37 ℃ 5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng),24 h/48 h避光加入CCK-8，培養(yǎng)箱放置1 h后，采用酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的OD值。分析沉默或過(guò)表達(dá)MeCP2對(duì)Hep3B細(xì)胞生物學(xué)活性的影響。

1.4.3 細(xì)胞周期實(shí)驗(yàn)檢測(cè)MeCP2對(duì)Hep3B細(xì)胞周期的影響 按上述分組將轉(zhuǎn)染后的Hep3B細(xì)胞于37 ℃ 5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng),48 h后，胰酶消化細(xì)胞收集于15 ml離心管中，1 000 r/min離心5 min。棄上清，PBS沖洗細(xì)胞2～3次。棄去PBS，重新加入4 ℃預(yù)冷的70%酒精(PBS稀釋)重懸細(xì)胞，于4 ℃過(guò)夜固定。1 000 r/min離心5 min，棄上清液。用PBS沖洗細(xì)胞2次，離心棄上清PBS，避光加150 μl RNA酶和150 μl PI，輕柔混合，室溫避光靜置30 min后采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS13.0軟件進(jìn)行分析。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用Student’st檢驗(yàn)分析兩組間均數(shù)比較。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 MeCP2在多種腫瘤中高表達(dá)

TIMER2.0基于TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)分析MeCP2在多種腫瘤中的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)與正常組織相比，MeCP2在乳腺浸潤(rùn)癌、膽管癌、食管癌、頭頸部鱗狀細(xì)胞癌、腎嫌色細(xì)胞癌、肝細(xì)胞癌中的mRNA表達(dá)顯著增加(見圖1)。

兩樣本比較,*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，橫坐標(biāo)為腫瘤種類(紅色為腫瘤樣本，藍(lán)色為對(duì)應(yīng)的正常樣本)圖1 MeCP2在多種腫瘤中的表達(dá)Figure 1 The expression of MeCP2 in various tumors

2.2 MeCP2的表達(dá)對(duì)腫瘤患者生存期的影響

應(yīng)用GEPIA2數(shù)據(jù)庫(kù)分析MeCP2的表達(dá)與腫瘤患者生存期的關(guān)系，結(jié)果顯示顯示在乳腺浸潤(rùn)癌(BRCA)、結(jié)腸癌(COAD)、腎乳頭狀細(xì)胞癌(KIRP)、肝細(xì)胞癌(LIHC)中MeCP2高表達(dá)的患者的總生存率顯著低于MeCP2低表達(dá)組，而在腎透明細(xì)胞癌(KIRC)中MeCP2高表達(dá)的患者總生存率及無(wú)病生存率顯著高于MeCP2低表達(dá)組，而在葡萄膜黑色素瘤(UVM)中MeCP2高表達(dá)的患者無(wú)病生存期率顯著低于MeCP2低表達(dá)組(見圖2)。

紅色表示lgHR>0，藍(lán)色表示lgHR<0圖2 MeCP2的表達(dá)對(duì)腫瘤患者生存率的影響Figure 2 The effect of MeCP2 expression on the survival rate of tumor patients

2.3 MeCP2在多種腫瘤中的遺傳變異情況

應(yīng)用cBioPortal分析MeCP2在多種腫瘤中的遺傳變異情況，結(jié)果顯示，MeCP2的變異頻率在彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤中最高(10.42%，見圖3A)。MeCP2突變的位點(diǎn)如圖3B所示，錯(cuò)義突變是其突變的主要類型。

圖3 MeCP2在多種腫瘤中的基因變異情況Figure 3 Gene variation of MeCP2 in various tumors

2.4 UALCAN分析MeCP2在肝細(xì)胞癌中的表達(dá)

應(yīng)用UALCAN分析發(fā)現(xiàn)肝細(xì)胞癌不同年齡組患者中MeCP2的表達(dá)均顯著高于正常對(duì)照(見圖4)。發(fā)生TP53突變及未發(fā)生TP53的肝細(xì)胞癌患者M(jìn)eCP2的表達(dá)均顯著高于正常對(duì)照，TP53突變及未發(fā)生TP53的肝細(xì)胞癌患者中MeCP2的表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(見圖4)。

與正常組比較，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001圖4 MeCP2在肝細(xì)胞癌中的表達(dá)Figure 4 Expression of MeCP2 in liver hepatocellular carcinoma

2.5 MeCP2在肝細(xì)胞癌中發(fā)揮癌基因的作用

應(yīng)用qRT-PCR檢測(cè)MeCP2的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)與si-ctrl組相比，MeCP2在si-MeCP2組中的表達(dá)顯著降低(P<0.05)；與ov-ctrl組相比，MeCP2在ov-MeCP2組中的表達(dá)顯著升高(P<0.01，見圖5)。CCK-8實(shí)驗(yàn)表明抑制MeCP2表達(dá)可抑制肝癌Hep3B細(xì)胞增殖(P<0.01)；過(guò)表達(dá)MeCP2可促進(jìn)肝癌Hep3B細(xì)胞增殖(P<0.05，見圖5)。細(xì)胞周期實(shí)驗(yàn)表明抑制MeCP2可將肝癌Hep3B細(xì)胞阻滯在G1期(P<0.01，見圖5)。

與相應(yīng)的ctrl組相比，*P<0.05，**P<0.01圖5 MeCP2對(duì)Hep3B細(xì)胞增殖及細(xì)胞周期的影響Figure 5 Effect of MeCP2 on the proliferation and cell cycle of Hep3B cells

3 討論

腫瘤是一種高發(fā)病率、高死亡率的嚴(yán)重威脅人類健康的疾病。探索腫瘤的發(fā)病機(jī)制，尋找腫瘤生物標(biāo)志物，對(duì)優(yōu)化腫瘤的診療及探尋潛在的治療靶點(diǎn)有重要意義。腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程受到多種因素的調(diào)控，目前研究表明表觀遺傳調(diào)控與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。甲基化作為DNA的主要且最具特征的表觀遺傳修飾之一，引起人們的廣泛關(guān)注[16]。哺乳動(dòng)物DNA的甲基化可導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄抑制和染色質(zhì)結(jié)構(gòu)改變，CpG二核苷酸是DNA甲基化發(fā)生的主要位點(diǎn),甲基化CpG通過(guò)甲基-CpG結(jié)合蛋白介導(dǎo)[1]。MeCP2能夠通過(guò)與甲基化DNA結(jié)合調(diào)控基因表達(dá)并調(diào)節(jié)染色質(zhì)結(jié)構(gòu)。MeCP2有兩個(gè)重要的結(jié)構(gòu)域，甲基CPG結(jié)合結(jié)構(gòu)域(methyl-CpG-binding domain，MBD)和轉(zhuǎn)錄抑制結(jié)構(gòu)域(transcriptional-repression domain，TRD)，MBD能夠結(jié)合mCpG，TRD可通過(guò)招募蛋白復(fù)合物在轉(zhuǎn)錄水平發(fā)揮調(diào)控作用。現(xiàn)有研究證據(jù)表明，MeCP2在多種腫瘤中存在異常表達(dá)，廣泛參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展[17-19]。本研究通過(guò)生物信息分析MeCP2在包括肝細(xì)胞癌在內(nèi)的多種腫瘤中的表達(dá)，結(jié)果表明MeCP2在肝細(xì)胞癌中的表達(dá)水平高于正常組織，與之前文獻(xiàn)報(bào)道一致[20]。本研究借助GEPIA2數(shù)據(jù)庫(kù)分析MeCP2與腫瘤患者預(yù)后的關(guān)系，顯示肝細(xì)胞癌患者中MeCP2高表達(dá)組的總生存率顯著低于MeCP2低表達(dá)組，進(jìn)一步通過(guò)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)MeCP2對(duì)Hep3B生物學(xué)活性的影響，發(fā)現(xiàn)沉默MeCP2可抑制Hep3B細(xì)胞增殖，將細(xì)胞周期阻滯于G1期。Wu等[21]的研究表明MeCP2在肝細(xì)胞癌組織中高表達(dá)，沉默MeCP2可抑制細(xì)胞增殖，而過(guò)表達(dá)MeCP2可促進(jìn)SMMC-7721細(xì)胞增殖。結(jié)合既往研究結(jié)果，提示MeCP2在肝癌中可能發(fā)揮癌基因的作用，可能是肝癌治療的潛在靶點(diǎn)。

本研究通過(guò)生物信息學(xué)分析MeCP2在泛癌中的表達(dá)及預(yù)后關(guān)系，為系統(tǒng)認(rèn)識(shí)MeCP2在腫瘤中的作用提供依據(jù)，進(jìn)一步通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)揭示了MeCP2在肝細(xì)胞癌中發(fā)揮的作用，但仍存在不足之處。該研究?jī)H在體外水平檢測(cè)了MeCP2對(duì)肝癌細(xì)胞的影響且未涉及相關(guān)機(jī)制研究，后續(xù)還需要進(jìn)一步的細(xì)胞和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)深入研究MeCP2基因在肝癌發(fā)生中涉及的具體機(jī)制。