王 鋼，秦 鮮

(1.湖北省武漢市江夏區(qū)第一人民醫(yī)院，湖北 武漢 430200 2.武漢大學(xué)人民醫(yī)院消化內(nèi)科，湖北 武漢 430060)

甲狀腺癌(thyroid carcinoma,TC)是一種常見(jiàn)的內(nèi)分泌惡性腫瘤，病理學(xué)分型顯示我國(guó)最常見(jiàn)類型為甲狀腺濾泡狀癌與甲狀腺乳頭狀癌，分化良好的TC被認(rèn)為是“惰性腫瘤”，患者的長(zhǎng)期生存率可以高于95%[1]，而侵襲性TC具有近100%的疾病特異性死亡率[2]。20世紀(jì)80年代以后，許多國(guó)家TC的發(fā)病率繼續(xù)上升，相關(guān)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，1974年到2013年間的平均發(fā)病率約為6.66%，TC已經(jīng)是發(fā)病率排名第九的癌癥[3]。對(duì)TC發(fā)病機(jī)制及治療方式的研究尤為緊迫，微小RNA-218(MicroRNA-218,miR-218)是腫瘤抑制性miRNA的一種，在宮頸癌組織中低表達(dá)可以顯著促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲，其作用機(jī)制可能與miR-218靶向調(diào)控TPD52蛋白有關(guān)[4]。miR-218在結(jié)腸癌組織中可以調(diào)控磷脂酰肌醇3激酶(phosphatidylinositol 3-kinase,PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B,Akt)/哺乳動(dòng)物雷帕霉素(mammalian target of rapamycin,mTOR)通路，抑制此通路的激活達(dá)到抑制結(jié)腸癌細(xì)胞侵襲和遷移的效果。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路在TC組織中被激活，促進(jìn)TC細(xì)胞的增殖，導(dǎo)致患者不良預(yù)后，抑制PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路的激活可以有效誘導(dǎo)TC細(xì)胞凋亡與自噬，有利于改善患者TC病癥[5]。因此本實(shí)驗(yàn)以TC細(xì)胞為研究對(duì)象，探究miR-218靶向PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路對(duì)甲狀腺癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響，期望為PTC患者帶來(lái)新的曙光。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞來(lái)源：人TC細(xì)胞株8505C(貨號(hào)：GD-C00136260)購(gòu)自上海冠導(dǎo)生物工程有限公司。

1.2主要試劑及儀器：LipofectamineTM3000 Transfection Reagent(貨號(hào)：L3000001)購(gòu)自賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司；總RNA提取試劑盒(貨號(hào)：R1200)購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；RIPA裂解液(貨號(hào)：abs9229)購(gòu)自愛(ài)必信(上海)生物科技有限公司；SD-001 MinuteTM總蛋白提取試劑盒(貨號(hào)：SD-001)購(gòu)自晨學(xué)生物科技(廣州)有限公司；BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒、CCK-8試劑盒(貨號(hào)：P0012S、C0039)購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；DMEM basic(1X)高糖培養(yǎng)液(貨號(hào)：C11995500BT)購(gòu)自廣州賽國(guó)生物科技有限公司；ki-67、基質(zhì)金屬蛋白酶2(MMP-2)、基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP-9)、p-PI3K、p-AKT、p-mTOR、PI3K、AKT、mTOR、GAPDH兔源抗體及辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG二抗(貨號(hào)：A2094、A19080、A2095、A4860、AP0637、AP0115、A19742、A17909、A2445、A19056、AC005)均購(gòu)自武漢愛(ài)博泰克生物科技有限公司；細(xì)胞培養(yǎng)箱(型號(hào)：WJ-80A-Ⅲ)購(gòu)自上海海向儀器設(shè)備廠；酶標(biāo)儀(型號(hào)XElx800)購(gòu)自美國(guó)Perkin Elmer公司。

1.3細(xì)胞培養(yǎng)、分組與轉(zhuǎn)染：將8505C細(xì)胞置于含有1%雙抗與10% FBS的DMEM培養(yǎng)基中，使用24孔培養(yǎng)板于細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)氣象條件為5% CO2，95%O2，溫度設(shè)置為37℃。每?jī)商旄鼡Q培養(yǎng)基一次，當(dāng)細(xì)胞密度高于80%時(shí)進(jìn)行胰蛋白酶消化傳代培養(yǎng)。將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的8505C細(xì)胞隨機(jī)分為：對(duì)照組(未處理的8505C細(xì)胞)、miR-218 NC組(轉(zhuǎn)染陰性mimics)、miR-218 mimics組(轉(zhuǎn)染miR-218 mimics)、通路激活劑組(未處理的8505C細(xì)胞)滴加PI3K/AKT/mTOR通路激活劑IGF-1至終濃度100 ng/mL[6]、miR-218mimics+通路激活組(轉(zhuǎn)染miR-218 mimics)滴加IGF-1至終濃度100 ng/mL。

1.4RT-QPCR法檢測(cè)8505C細(xì)胞中miR-218表達(dá)水平：參照RNA提取試劑盒說(shuō)明書的要求提取8505C細(xì)胞中總RNA，根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒中說(shuō)明書的要求反轉(zhuǎn)錄得到cDNA。miR-218引物序列：上游引物5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'，下游引物5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'；β-actin作為內(nèi)參引物序列：上游引物5'-ACACTCCAGCTGGGTTGATCTAA-3'，下游引物5'-GGAAGATGGTGATGGGATT-3'?？偡磻?yīng)體系為20μL：2×SYBR Mix10μL，H2O 8μL，上下游引物各0.5μL，10×cDNA模板1μL。反應(yīng)條件設(shè)定為：95℃預(yù)變性30s，95℃變性30s、60℃退火延伸30s，共40個(gè)循環(huán)，72℃延伸50s。根據(jù)2-△△CT算法進(jìn)行計(jì)算8505C細(xì)胞中miR-218的表達(dá)水平。

1.5CCK-8法檢測(cè)8505C細(xì)胞增殖能力：取1.3各組8505C細(xì)胞，將濃度調(diào)整為2×105個(gè)/孔接種至24孔培養(yǎng)板中，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)氣象條件為5% CO2，95%O2，溫度設(shè)置為37℃，在藥物處理的24h時(shí)后向每孔加入10μL CCK-8溶液，37℃孵育2h，利用酶標(biāo)儀檢測(cè)450nm處的吸光度(OD)值。

1.6劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)8505C細(xì)胞遷移能力：取1.3各組8505C細(xì)胞，將濃度調(diào)整為2×105個(gè)/孔接種至24孔培養(yǎng)板中，將8505C細(xì)胞置于細(xì)胞培養(yǎng)箱(37℃、95%O2、5% CO2)中繼續(xù)培養(yǎng)24h進(jìn)行觀察，待細(xì)胞鋪滿板內(nèi)85%左右時(shí)，用10μL移液槍頭垂直于24孔板底部做直線劃痕，之后細(xì)胞繼續(xù)置于恒溫培養(yǎng)箱(37℃、95%O2、5% CO2)中培養(yǎng)后24h，于倒置光學(xué)顯微鏡下拍照(×100)觀察，利用Image J軟件測(cè)量劃痕區(qū)域面積，并計(jì)算細(xì)胞劃痕愈合率=1-24h劃痕面積/0h劃痕面積×100%。實(shí)驗(yàn)進(jìn)行3次重復(fù)。

1.7Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)8505C細(xì)胞侵襲能力：對(duì)于8505C細(xì)胞侵襲能力測(cè)定步驟如下，將4×105個(gè)8505C細(xì)胞懸浮在200μL無(wú)糖與FBS的DMEM培養(yǎng)基中，將8505C細(xì)胞懸浮液加入到預(yù)先涂有Matrigel的Transwell上室中，同時(shí)向Transwell下室中加入600μL含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基，常溫下孵育48h后，用棉簽擦除上室表面的細(xì)胞，將侵襲的細(xì)胞用4%的多聚甲醛固定15min，1%結(jié)晶紫染色20min，隨機(jī)選取3個(gè)視野利用顯微鏡觀察并計(jì)數(shù)，估算8505C細(xì)胞的侵襲能力。

1.8Western blot檢測(cè)8505C細(xì)胞中蛋白表達(dá)水平：取1.3各組8505C細(xì)胞濃度調(diào)整為2×105個(gè)/孔接種至24孔培養(yǎng)板中，使用RIPA裂解緩沖液中裂解30min，在4℃條件下以10000rpm離心10min，收集上清即獲得各組8505C細(xì)胞總蛋白。通過(guò)BCA試劑盒測(cè)定蛋白質(zhì)濃度，使用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)方法將各組8505C細(xì)胞總蛋白分離出等量的蛋白質(zhì)，使用濕轉(zhuǎn)法將分離出的各組等量蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，用5%脫脂牛奶封閉1h后，加入一抗ki-67(1∶1000)、MMP-2(1∶2500)、MMP-9(1∶2000)、p-PI3K(1∶3000)、PI3K(1∶1000)、p-AKT(1∶3000)、AKT(1∶2000)、p-mTOR(1∶1000)、mTOR(1∶2500)、GAPDH(1∶1000)在4℃條件下孵育過(guò)夜，第2天再加入羊抗兔IgG二抗(1∶2000)在室溫下孵育2h。顯影并通過(guò)Image J軟件對(duì)目標(biāo)條帶的灰度值進(jìn)行分析，獲得各組8505C細(xì)胞總ki-67、MMP-2、MMP-9、p-PI3K、PI3K、p-AKT、AKT、p-mTOR、mTOR蛋白表達(dá)水平。

2 結(jié) 果

2.1各組8505C細(xì)胞中miR-218表達(dá)水平：與對(duì)照組比較，miR-218 NC組8505C細(xì)胞中miR-218 mRNA表達(dá)水平變化不顯著(P>0.05)，miR-218 mimics組8505C細(xì)胞中miR-218 mRNA表達(dá)水平顯著上調(diào)(P<0.05)，通路激活劑組8505C細(xì)胞中miR-218 mRNA表達(dá)水平顯著下調(diào)(P<0.05)；與miR-218 mimics組相比，miR-218 mimics+通路激活組8505C細(xì)胞中miR-218 mRNA表達(dá)水平顯著下調(diào)(P<0.05)，見(jiàn)表1。

表1 各組8505C細(xì)胞中miR-218 mRNA表達(dá)水平

2.2各組8505C細(xì)胞增殖情況：與對(duì)照組比較，miR-218 NC組8505C細(xì)胞在24h時(shí)的OD450值變化不顯著(P>0.05)，miR-218 mimics組8505C細(xì)胞在24h時(shí)的OD450值顯著下調(diào)(P<0.05)，通路激活劑組8505C細(xì)胞在24h時(shí)的OD450值顯著上調(diào)(P<0.05)；與miR-218 mimics組相比，miR-218 mimics+通路激活組8505C細(xì)胞在24h時(shí)的OD450值顯著上調(diào)(P<0.05)，見(jiàn)表2。

表2 各組8505C細(xì)胞增殖情況

2.3各組8505C細(xì)胞遷移情況：與對(duì)照組比較，miR-218 NC組8505C細(xì)胞劃痕愈合率變化不顯著(P>0.05)，miR-218 mimics組8505C細(xì)胞劃痕愈合率顯著下調(diào)(P<0.05)，通路激活劑組8505C細(xì)胞劃痕愈合率顯著上調(diào)(P<0.05)；與miR-218 mimics組相比，miR-218 mimics+通路激活組8505C細(xì)胞劃痕愈合率顯著上調(diào)(P<0.05)，見(jiàn)表3，圖1。

表3 各組8505C細(xì)胞遷移情況

圖1 劃痕愈合實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組8505C細(xì)胞遷移能力(×200)

2.4各組8505C細(xì)胞侵襲情況：與對(duì)照組比較，miR-218 NC組8505C細(xì)胞侵襲數(shù)目變化不顯著(P>0.05)，miR-218 mimics組8505C細(xì)胞侵襲數(shù)目顯著下調(diào)(P<0.05)，通路激活劑組8505C細(xì)胞侵襲數(shù)目顯著上調(diào)(P<0.05)；與miR-218 mimics組相比，miR-218 mimics+通路激活組8505C細(xì)胞侵襲數(shù)目顯著上調(diào)(P<0.05)，見(jiàn)圖2、表4。

圖2 Transwell檢測(cè)各組8505C細(xì)胞侵襲能力(×200)

表4 各組8505C細(xì)胞侵襲數(shù)目比較

2.5各組8505C細(xì)胞中增殖、遷移及侵襲相關(guān)蛋白表達(dá)情況：與對(duì)照組比較，miR-218 NC組8505C細(xì)胞中ki-67、MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)水平變化不顯著(P>0.05)，miR-218 mimics組8505C細(xì)胞中ki-67、MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)水平顯著下調(diào)(P<0.05)，通路激活劑組8505C細(xì)胞中ki-67、MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)水平顯著上調(diào)(P<0.05)；與miR-218 mimics組相比，miR-218 mimics+通路激活組8505C細(xì)胞中ki-67、MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)水平顯著上調(diào)(P<0.05)，見(jiàn)圖3，圖4。

圖3 Western Blot檢測(cè)各組8505C細(xì)胞中ki-67、MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)情況

2.6各組8505C細(xì)胞中PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)情況：與對(duì)照組比較，miR-218 NC組8505C細(xì)胞中p-PI3K、p-AKT、p-mTOR蛋白表達(dá)水平變化不顯著(P>0.05)，miR-218 mimics組8505C細(xì)胞中p-PI3K、p-AKT、p-mTOR蛋白表達(dá)水平顯著下調(diào)(P<0.05)，通路激活劑組8505C細(xì)胞中p-PI3K、p-AKT、p-mTOR蛋白表達(dá)水平顯著上調(diào)(P<0.05)；與miR-218 mimics組相比，miR-218 mimics+通路激活組8505C細(xì)胞中p-PI3K、p-AKT、p-mTOR蛋白表達(dá)水平顯著上調(diào)(P<0.05)，見(jiàn)圖5和表5。

表5 各組8505C細(xì)胞中p-PI3K p-AKT p-mTOR蛋白表達(dá)情況

圖4 各組8505C細(xì)胞中ki-67、MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)情況

圖5 Western Blot檢測(cè)各組8505C細(xì)胞中PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路相關(guān)蛋白

3 討 論

TC是一種具有侵襲性的癌癥，手術(shù)、放射性碘及甲狀腺激素抑制劑等治療方式，有治愈TC的可能，但是患者出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等病理特征時(shí)，TC患者具有較差的預(yù)后，同時(shí)TC癌細(xì)胞顯示出有絲分裂增加的特征[7]。miRNA參與細(xì)胞分化、細(xì)胞增殖、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等多種途徑，具有成為治療靶點(diǎn)和生物標(biāo)志物的潛力，通過(guò)對(duì)文獻(xiàn)檢索發(fā)現(xiàn)miRNA在TC細(xì)胞增殖、遷移與侵襲過(guò)程中發(fā)揮重要調(diào)控作用[8]。miR-218在腎細(xì)胞癌、前列腺癌、宮頸癌等多種腫瘤組織和細(xì)胞中低表達(dá)，發(fā)揮抑制細(xì)胞增殖及轉(zhuǎn)移的作用。當(dāng)miR-218在口腔癌細(xì)胞UM1中過(guò)表達(dá)時(shí)可以逆轉(zhuǎn)口腔癌細(xì)胞UM1的耐藥性，促進(jìn)其凋亡[9]。既往研究發(fā)現(xiàn)，miR-218在TC組織和細(xì)胞系中下調(diào)表達(dá)，且能夠抑制細(xì)胞遷移、侵襲和腫瘤生長(zhǎng)[10]。但是，miR-218抑制TC細(xì)胞生物學(xué)行為的分子機(jī)制尚不清楚。因此本實(shí)驗(yàn)以人TC細(xì)胞株8505C為研究對(duì)象，通過(guò)轉(zhuǎn)染miR-218 mimics發(fā)現(xiàn)，miR-218表達(dá)水平顯著上調(diào)，增殖能力、細(xì)胞劃痕愈合率、侵襲數(shù)目顯著降低，與之前的研究一致，說(shuō)明上調(diào)8505C細(xì)胞中miR-218表達(dá)水平可以顯著抑制8505C細(xì)胞的增殖、遷移以及侵襲。ki-67是公認(rèn)的評(píng)估細(xì)胞增殖活性的標(biāo)志物之一，其過(guò)表達(dá)是TC復(fù)發(fā)的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[11]。MMP-2與MMP-9在TC患者體內(nèi)的含量對(duì)于腫瘤的遷移與侵襲具有重要意義，其在TC患者體內(nèi)水平顯著升高，意味著不良預(yù)后[12]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)檢測(cè)不同處理的8505C細(xì)胞中的蛋白水平發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染miR-218 mimics后，8505C細(xì)胞中ki-67、MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)水平顯著下調(diào)，其結(jié)果表明，上調(diào)8505C細(xì)胞中miR-218表達(dá)水平對(duì)8505C細(xì)胞的增殖、遷移以及侵襲的抑制作用與降低ki-67、MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)密切相關(guān)。

PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)對(duì)細(xì)胞的增殖、代謝與凋亡具有重要調(diào)控作用，在癌癥患者中此信號(hào)通路失調(diào)，其與癌癥的發(fā)生與發(fā)展具有密切關(guān)系。PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路異常激活會(huì)導(dǎo)致TC患者具有較差的預(yù)后[13]。使用白藜蘆醇可以抑制TC細(xì)胞增殖、遷移與侵襲，可能與其顯著抑制PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路的激活有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，過(guò)表達(dá)miR-218能夠降低8505C細(xì)胞中p-PI3K、p-AKT、p-mTOR蛋白表達(dá)水平，這與上述研究結(jié)果一致，說(shuō)明在8505C細(xì)胞中PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路處于激活狀態(tài)，可能導(dǎo)致腫瘤的進(jìn)一步惡化，而上調(diào)8505C細(xì)胞中miR-218的表達(dá)可使原本的活化狀態(tài)被抑制，從而抑制細(xì)胞的增殖、遷移及侵襲，減緩腫瘤的進(jìn)展過(guò)程。進(jìn)一步使用PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路激活劑處理8505C細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，通路激活劑組8505C細(xì)胞中p-PI3K、p-AKT、p-mTOR蛋白表達(dá)水平顯著高于對(duì)照組，表明通路激活劑可以激活PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路；而且在轉(zhuǎn)染miR-218 mimics的基礎(chǔ)上加入通路激活劑后，miR-218對(duì)PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路的抑制作用被消除，同時(shí)，8505C細(xì)胞的增殖能力、細(xì)胞劃痕愈合率、侵襲數(shù)目及ki-67、MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)水平均顯著上調(diào)，提示miR-218抑制8505C細(xì)胞增殖、遷移與侵襲的作用，可能與抑制PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路激活進(jìn)而抑制ki-67、MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)有關(guān)。

綜上所述，miR-218通過(guò)抑制PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路激活抑制8505C細(xì)胞增殖、遷移與侵襲。PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路紛繁復(fù)雜，還有待進(jìn)一步確認(rèn)其它信號(hào)通路在此過(guò)程的調(diào)控作用，更需要臨床中檢驗(yàn)miR-218在TC發(fā)生與發(fā)展中的作用。