張亮亮，趙程錦，周煜虎，曹 博，段明明，馮陽陽

(延安大學(xué)附屬醫(yī)院創(chuàng)傷骨科，陜西 延安 716000)

脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞是一類來源于脂肪組織的成體干細(xì)胞，具有自我更新和分化為脂肪細(xì)胞、軟骨細(xì)胞及成骨細(xì)胞等多類細(xì)胞的多向分化潛能，隨著脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞分離及鑒定技術(shù)日趨成熟，可將其用于骨組織工程進(jìn)行骨損傷修復(fù)以及治療骨相關(guān)疾病[1]。然而如何保證脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨方向單向分化，進(jìn)而提高修復(fù)及治療效率是當(dāng)前骨組織工程領(lǐng)域亟待解決的問題。柚皮苷是一類雙氫黃酮類化合物，是中藥骨碎補的主要活性成分，具有抗炎、抗氧化、抗微生物、抗誘變、抗癌等作用，已有研究表明柚皮苷可促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化[2]。然而有關(guān)柚皮苷能否調(diào)控脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞成骨向分化的報道極少。環(huán)磷酸腺苷(cAMP)/蛋白激酶A(PKA)/cAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白(CREB)通路是G蛋白偶聯(lián)受體下游重要的信號通路，在干細(xì)胞成骨分化過程發(fā)揮重要的誘導(dǎo)作用，已有報道指出通過調(diào)節(jié)cAMP/PKA/CREB信號通路可調(diào)控脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化[3]。但柚皮苷能否通過調(diào)節(jié)cAMP/PKA/CREB信號通路調(diào)控脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨向分化尚未可知。故本研究選取人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行體外細(xì)胞實驗，探究柚皮苷通過調(diào)節(jié)cAMP/PKA/CREB信號通路調(diào)控人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的作用及機制。

1 材料與方法

1.1材 料

1.1.1實驗細(xì)胞與試劑:人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞(購自武漢普諾賽生命科技有限公司，生產(chǎn)批號CP-H202)；柚皮苷(購自上海純優(yōu)生物科技有限公司，生產(chǎn)批號P0027)；cAMP抑制劑(SQ22536)(購自上海藍(lán)木化工有限公司，生產(chǎn)批號S8283)；地塞米松、β-甘油磷酸鈉、抗壞血酸(購自上海聯(lián)碩生物科技有限公司，生產(chǎn)批號D1756、G6251、N/A-1255)；四唑硝基藍(lán)(BCIP/NBT)堿性磷酸酶(ALP)顯色試劑盒、ALP檢測試劑盒、二喹啉甲酸(BCA)蛋白濃度檢測試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司，生產(chǎn)批號C3206、P0321M、P0012)；茜素紅S(ARS)染色試劑盒(購自上海拜力生物科技有限公司，生產(chǎn)批號8678)；人cAMP酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒(購自江西艾博因生物科技有限公司，生產(chǎn)批號IB-E10006)；總核糖核酸(RNA)提取試劑盒(購自上?？泼羯锟萍加邢薰?，生產(chǎn)批號80224)；PKA、CREB、矮小相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2(Runx2)、骨鈣素蛋白(OCN)、骨橋蛋白(OPN)、磷酸脫氫酶(GAPDH)聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)引物(委托上海滬宇生物科技有限公司合成)；總蛋白提取試劑盒(購自上海雅吉生物科技有限公司，生產(chǎn)批號D1700)；細(xì)胞核蛋白提取試劑盒(購自上海梵態(tài)生物科技有限公司，生產(chǎn)批號FT30504yy)；兔抗人PKA、p-PKA、CREB、p-CREB、Runx2、OCN、OPN、GAPDH、組蛋白3(H3)單克隆抗體(一抗)，羊抗兔PKA、p-PKA、CREB、p-CREB、Runx2、OCN、OPN、GAPDH、H3辣根過氧化物酶標(biāo)記多克隆抗體(二抗)(購自廣州威佳科技有限公司，生產(chǎn)批號P4234Rb-h、9621、PA1-850、MA5-11192、12556、ab93876、ab8448、5174S、ab1791；A10547、65-6120、A24537、32260、G-21234、31466、A24531、31461、ab6721)。

1.1.2實驗設(shè)備:IX73型倒置顯微鏡(購自日本奧林巴斯)；3-18K型高速冷凍離心機(購自德國Sigma)；SpectraMax iD5型多功能酶標(biāo)儀[購自美谷分子儀器(上海)有限公司]；7500型PCR儀(購自美國ABI)；EPS-200型電泳儀(購自上海天能科技有限公司)。

1.2方 法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)、分組與給藥:將人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞接種至杜氏改良培養(yǎng)液(DMEM)(含10%胎牛血清、100U/mL青霉素、100μg/mL鏈霉素)中常規(guī)培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)70%時，按1∶3重懸細(xì)胞進(jìn)行傳代。當(dāng)細(xì)胞傳至第3代時，調(diào)整細(xì)胞密度為1×105個/mL，將細(xì)胞分為對照組、柚皮苷低、中、高劑量組、cAMP抑制劑(SQ22536)組、成骨分化誘導(dǎo)組(誘導(dǎo)組)，柚皮苷低、中、高劑量組分別加12.5μmoL/L、25μmoL/L、50μmoL/L柚皮苷，SQ22536組加100μmoL/L SQ22536，誘導(dǎo)組加10-8moL/L地塞米松、10mmoL/L β-甘油磷酸鈉和50mg/L抗壞血酸誘導(dǎo)脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化；對照組僅加等體積DMEM培養(yǎng)液，每組設(shè)置6個復(fù)孔。

1.2.2ALP染色及磷酸對硝基苯酯(PNPP)法檢測各組細(xì)胞ALP活性:培養(yǎng)48h后，取各組細(xì)胞接種于6孔板，調(diào)整細(xì)胞密度為5×104個/mL，磷酸鹽緩沖液(PBS)漂洗3遍，多聚甲醛固定，加入BCIP/NBT工作液覆蓋樣品，室溫避光25min，去除工作液，蒸餾水洗2次終止反應(yīng)， 倒置顯微鏡下觀察 ALP 染色情況；另取各組細(xì)胞加細(xì)胞裂解液，12000 r/min(有效離心半徑 6.3cm)4℃離心10min后取上清，BCA法檢測上清蛋白濃度，根據(jù)試劑盒要求添加檢測緩沖液、顯色底物、標(biāo)準(zhǔn)工作液及檢測樣品，室溫孵育5min后終止反應(yīng)，酶標(biāo)儀于405nm處檢測各組細(xì)胞ALP活性。

1.2.3ARS染色觀察各組細(xì)胞鈣沉積:培養(yǎng)48h后，取各組細(xì)胞接種至24孔板，調(diào)整細(xì)胞密度為1×105個/mL，多聚甲醛固定，PBS洗滌，500μL茜素紅s染液染色30min，倒置顯微鏡下觀察各組細(xì)胞鈣沉積情況。

1.2.4ELISA法檢測各組細(xì)胞cAMP水平:培養(yǎng)48h后，取各組細(xì)胞，加細(xì)胞裂解液 12000r/min (有效離心半徑6.3cm)4℃離心10min后取上清，嚴(yán)格按照cAMP試劑盒操作說明檢測各組細(xì)胞cAMP水平。

1.2.5實時定量聚合酶鏈反應(yīng)(RT-qPCR)檢測各組細(xì)胞PKA、CREB、RUNX2、OCN、OPN信使核糖核酸(mRNA)表達(dá):培養(yǎng)48h后，取各組細(xì)胞，根據(jù)總RNA提取試劑盒操作說明提取細(xì)胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄為互補脫氧核糖核酸，進(jìn)行PCR反應(yīng)，引物序列見表1，PCR反應(yīng)條件：95℃ 30s；95℃ 5s，65℃ 30s，45個循環(huán)。本研究選取GAPDH為內(nèi)參基因，并通過2-ΔΔCt[4]方法表示各組細(xì)胞目的基因相對表達(dá)量。

1.2.6蛋白質(zhì)免疫印跡法(WB)檢測各組細(xì)胞PKA、CREB、RUNX2、OCN、OPN蛋白表達(dá)及p-PKA、p-CREB水平：培養(yǎng)48h后，取各組細(xì)胞，根據(jù)總蛋白提取試劑盒提取細(xì)胞PKA、RUNX2、OCN、OPN總蛋白，同時根據(jù)核蛋白提取試劑盒操作說明提取細(xì)胞p-PKA、p-CREB、CREB核蛋白；BCA法檢測蛋白濃度，上樣20μg，電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉，加一抗(稀釋比例1∶1000)4℃孵育過夜，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗(稀釋比例1∶2000)室溫孵育1h，進(jìn)行顯影分析。其中p-PKA、p-CREB、CREB選取H3為內(nèi)參基因，其余基因選取GAPDH為內(nèi)參基因。

表1 PCR反應(yīng)引物序列

2 結(jié) 果

2.1各組細(xì)胞ALP染色結(jié)果和ALP活性比較:對照組可見少量藍(lán)色沉淀，SQ22536組藍(lán)色沉淀最少，誘導(dǎo)組和柚皮苷低劑量組藍(lán)色沉淀增多，柚皮苷中劑量組藍(lán)色沉淀進(jìn)一步增多，柚皮苷高劑量組藍(lán)色沉淀最多。與對照組比，SQ22536組ALP活性顯著下降(P<0.01)；與對照組和SQ22536組比，誘導(dǎo)組和柚皮苷3劑量組ALP活性顯著上升(P<0.01)；誘導(dǎo)組和柚皮苷低劑量組ALP活性差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；柚皮苷3劑量組ALP活性呈劑量依賴性。見圖1和表2。

圖1 各組細(xì)胞ALP染色結(jié)果

表2 各組ALP活性

2.2ARS染色觀察各組細(xì)胞鈣沉積情況:對照組存在少量鈣沉積，SQ22536組細(xì)胞鈣沉積顯著減少，誘導(dǎo)組和柚皮苷低劑量組鈣沉積增加，柚皮苷中劑量組鈣沉積進(jìn)一步增加，柚皮苷高劑量組鈣沉積最多。見圖2。

圖2 各組細(xì)胞ARS染色結(jié)果

2.3各組細(xì)胞cAMP水平、PKA、CREB、RUNX2、OCN、OPN mRNA表達(dá):與對照組比，SQ22536組細(xì)胞cAMP水平、PKA、CREB、RUNX2、OCN、OPN mRNA表達(dá)顯著下降(P<0.01)；與對照組和SQ22536組比，誘導(dǎo)組和柚皮苷3劑量組上述指標(biāo)上升，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)；誘導(dǎo)組和柚皮苷低劑量組上述指標(biāo)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；上述指標(biāo)柚皮苷3劑量組呈劑量依賴性。見表3、4。

表3 各組細(xì)胞cAMP水平

表4 各組細(xì)胞PKA CREB RUNX2 OCN OPN mRNA表達(dá)

2.4各組細(xì)胞PKA、CREB、RUNX2、OCN、OPN蛋白表達(dá)及p-PKA、p-CREB水平:與對照組比，SQ22536組細(xì)胞PKA、CREB、RUNX2、OCN、OPN蛋白表達(dá)及p-PKA、p-CREB水平顯著下降(P<0.01)；與對照組和SQ22536組比，誘導(dǎo)組和柚皮苷3劑量組上述指標(biāo)上升，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)；誘導(dǎo)組和柚皮苷低劑量組上述指標(biāo)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；上述指標(biāo)柚皮苷3劑量組呈劑量依賴性。見圖3、4和表5、6。

圖3 各組細(xì)胞PKA、CREB蛋白表達(dá)及p-PKA、p-CREB水平

表5 各組細(xì)胞PKA CREB蛋白表達(dá)及p-PKA p-CREB水平

表6 各組細(xì)胞RUNX2 OCN OPN蛋白表達(dá)

圖4 各組細(xì)胞RUNX2、OCN、OPN蛋白表達(dá)

3 討 論

脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞是骨組織工程學(xué)中最具有研究潛力的間充質(zhì)干細(xì)胞之一，因其具有來源廣泛、取材方便、損傷小、免疫原性低、增殖迅速、表型穩(wěn)定等優(yōu)點，已然成為骨組織修復(fù)領(lǐng)域重要的種子細(xì)胞之一[5]。而如何提高脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨向分化能力及成骨活性是當(dāng)前再生醫(yī)學(xué)及骨組織工程的研究熱點。

SQ22536是針對cAMP的抑制劑，可有效抑制cAMP/PKA/CREB信號通路[6]，成骨誘導(dǎo)劑地塞米松、β-甘油磷酸鈉和抗壞血酸聯(lián)合使用可誘導(dǎo)細(xì)胞成骨分化[7]，故本研究選取SQ22536和成骨誘導(dǎo)劑分別作為研究的陰性和陽性對照，確保本研究的嚴(yán)謹(jǐn)性和準(zhǔn)確性。本研究結(jié)果表明柚皮苷可促進(jìn)脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞ALP表達(dá)和鈣沉積，上調(diào)ALP活性，發(fā)揮促進(jìn)脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的作用。在骨代謝過程中成骨細(xì)胞占據(jù)重要地位，柚皮苷作為骨碎補的主要活性單體成分，可調(diào)節(jié)骨代謝[8]，據(jù)此推測柚皮苷可能通過調(diào)節(jié)骨代謝從而促進(jìn)脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化。

本研究結(jié)果表明柚皮苷可上調(diào)cAMP水平，促進(jìn)PKA、CREB表達(dá)，上調(diào)p-PKA、p-CREB水平，促進(jìn)RUNX2、OCN、OPN表達(dá)，促進(jìn)脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化。當(dāng)信號分子與細(xì)胞膜上G蛋白偶聯(lián)受體結(jié)合時可上調(diào)第二信使cAMP水平，cAMP激活PKA，活化的PKA入核進(jìn)一步磷酸化激活CREB，與特異性反應(yīng)原件結(jié)合，啟動基因的轉(zhuǎn)錄作用，cAMP/PKA/CREB通路在細(xì)胞的成骨分化過程發(fā)揮重要作用[9]。ALP和Runx2是細(xì)胞成骨分化的早期標(biāo)志物，OCN和OPN是細(xì)胞成骨分化的晚期標(biāo)志物，在脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化過程中發(fā)揮重要作用[10]。崇顯瑾等[11]指出通過激活cAMP/PKA/CREB通路，上調(diào)cAMP、p-PKA/PKA和p-CREB/CREB水平，可提高成骨細(xì)胞活力；韓宇等[12]指出通過激活cAMP/PKA/CREB信號通路，可促進(jìn)ALP表達(dá)，發(fā)揮促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化為成骨細(xì)胞的作用；Xie W等[13]指出通過抑制cAMP/PKA/CREB信號通路，下調(diào)cAMP、p-PKAs和p-CREB水平，抑制RUNX2、OCN表達(dá)，可抑制骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨向分化；Yu W等[14]指出激活cAMP/PKA/CREB信號通路，上調(diào)ALP活性，促進(jìn)RUNX2表達(dá)，可促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨；閻然等[15]指出在誘導(dǎo)脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化過程中，成骨分化關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子RUNX2、OCN、OPN及ALP的表達(dá)上升。本研究結(jié)果與上述研究結(jié)果一致，提示柚皮苷可能通過激活cAMP/PKA/CREB信號通路，上調(diào)cAMP水平，促進(jìn)PKA、CREB表達(dá)，上調(diào)p-PKA、p-CREB水平，促進(jìn)RUNX2、OCN、OPN表達(dá)，發(fā)揮促進(jìn)人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的作用。

綜上所述，柚皮苷可促進(jìn)人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化，可能通過激活cAMP/PKA/CREB通路，促進(jìn)RUNX2、OCN、OPN表達(dá)，上調(diào)ALP活性發(fā)揮調(diào)節(jié)功能；柚皮苷呈劑量依賴性。