劉語(yǔ)涵 高秀娟 王圣珺 王家璐 馬鳳鑾 王澤辰 丁高峰 孫子昂 孫 暉 張 君4

1 濱州醫(yī)學(xué)院第一臨床醫(yī)學(xué)院 山東 濱州 256603； 2 濱州醫(yī)學(xué)院第二臨床醫(yī)學(xué)院 山東 煙臺(tái) 264003；3 濱州醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 山東 煙臺(tái) 264003； 4 濱州職業(yè)學(xué)院 山東 濱州 256600

發(fā)光二極管(light emitting diode，LED)光源因其節(jié)能、耐用等優(yōu)點(diǎn)在日常生活中被廣泛應(yīng)用。照明LED光源是以GaN芯片和釔鋁石榴石組成，通過(guò)GaN芯片發(fā)出藍(lán)光(465 nm)激發(fā)釔鋁石榴石熒光粉后混合得到常見的復(fù)色白光[1]，因此，與傳統(tǒng)燈源比較，LED光源含有更多藍(lán)光成分[2]。神經(jīng)節(jié)細(xì)胞對(duì)藍(lán)光非常敏感[3]，短波藍(lán)光更容易造成視網(wǎng)膜細(xì)胞的損傷[4]。藍(lán)光對(duì)視網(wǎng)膜的危害主要表現(xiàn)為色素上皮細(xì)胞和感光細(xì)胞的病理變化，包括細(xì)胞空泡樣變、線粒體腫脹、微絨毛減少[5]、細(xì)胞凋亡[6]及視網(wǎng)膜功能相關(guān)蛋白表達(dá)水平的下降[7]。雖然目前LED光源采取了消減藍(lán)光光譜的保護(hù)性措施，符合國(guó)家有關(guān)標(biāo)準(zhǔn)，但照明LED光源對(duì)視網(wǎng)膜的損傷，特別是對(duì)視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的損傷還缺乏關(guān)注。隨著LED光源在室外和室內(nèi)照明中的普及，探討其對(duì)視網(wǎng)膜特別是視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的損傷非常必要。本研究擬通過(guò)利用自然光、日光燈、LED燈及藍(lán)光燈分別照射小鼠，觀察其對(duì)視網(wǎng)膜各層厚度和視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞(retinal ganglion cells，RGC)密度變化的影響，進(jìn)而評(píng)估不同光源，特別是LED光源對(duì)視網(wǎng)膜細(xì)胞是否構(gòu)成損傷，為今后LED光源暴露損傷視網(wǎng)膜的研究和藍(lán)光損傷預(yù)防提供研究依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物 7周齡健康雄性昆明種小鼠，購(gòu)自于濟(jì)南朋悅研究動(dòng)物繁育有限公司。動(dòng)物房室內(nèi)通風(fēng)良好，使用標(biāo)準(zhǔn)飼料(濟(jì)南朋悅研究動(dòng)物繁育有限公司)喂養(yǎng)，自由飲水進(jìn)食，室內(nèi)照明光源(白熾燈)調(diào)節(jié)日夜節(jié)律(12 h開，12 h關(guān))，1周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。本研究過(guò)程符合濱州醫(yī)學(xué)院動(dòng)物保護(hù)倫理委員會(huì)的相關(guān)要求。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物光照模型的制備 將小鼠置于50 cm×50 cm曠場(chǎng)中(曠場(chǎng)正上方放置可調(diào)節(jié)高度的燈架)，分別給予室內(nèi)光源(521 Lux)、LED光源(35 W燈帶，歐普照明，中國(guó))、470 nm藍(lán)光光源(15 W燈帶，三燿照明，中國(guó))、日光燈光源(50 W燈條，歐普照明，中國(guó))暴露。先將60只小鼠隨機(jī)分為6組，每組10只；將各組小鼠分別置于6個(gè)曠場(chǎng)中，LED光源照射時(shí)間(12 h/d)分別為0、3、6、9、12、15 d。另取48只小鼠隨機(jī)分為4組，每組12只，分別置于4個(gè)曠場(chǎng)中，給予室內(nèi)光源、日光燈光源、LED光源、藍(lán)光燈光源暴露(12 h/d)15 d。為保證光強(qiáng)度與室內(nèi)光強(qiáng)度一致，利用光譜照度計(jì)(SPIC-300AW，中國(guó)遠(yuǎn)方)在研究前及過(guò)程中檢測(cè)曠場(chǎng)中光強(qiáng)度，調(diào)節(jié)燈架高度使日光燈光源、LED燈光源光強(qiáng)度與自然光一致(510～530 Lux)，調(diào)節(jié)藍(lán)光燈光強(qiáng)度與LED光源藍(lán)光光強(qiáng)度相一致(156 Lux)。

1.2.2 標(biāo)本制備 采用頸椎脫臼法處死小鼠后，取光照模型小鼠眼球置于4%中性甲醛中固定過(guò)夜，梯度酒精脫水，二甲苯透明，65℃液體石蠟中浸泡過(guò)夜。浸蠟后按照染料標(biāo)記方向上的矢狀位水平包埋，冷卻后在4℃冰箱保存。經(jīng)視神經(jīng)進(jìn)行石蠟切片，厚度為4 μm，70℃烤箱烤片30 min，進(jìn)行HE染色，脫水后用中性樹膠封片，400倍光學(xué)顯微鏡(Olympus CX31)下拍攝視神經(jīng)旁開2 mm視網(wǎng)膜。

1.3 觀察指標(biāo) 選取經(jīng)過(guò)視神經(jīng)的切片旁開2 mm拍照，使用image J測(cè)量，并記錄視網(wǎng)膜總厚度、內(nèi)核層(inner nuclear layer，INL)、外核層(outer nuclear layer，ONL)、感光細(xì)胞層厚度及同視野下視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞數(shù)量(160 μm內(nèi))。

2 結(jié)果

2.1 LED燈照射不同時(shí)間對(duì)視網(wǎng)膜的損傷的影響 陰性對(duì)照組的小鼠視網(wǎng)膜細(xì)胞形態(tài)基本正常，排列規(guī)整，分界清楚。神經(jīng)節(jié)細(xì)胞單行整齊排列，局部可見小血管。INL細(xì)胞由6～7層重疊排列的雙極細(xì)胞核組成，核染色較淺。ONL細(xì)胞由約10層重疊排列的感光細(xì)胞核組成，核染色較深。感光細(xì)胞層細(xì)胞內(nèi)外節(jié)完整，內(nèi)節(jié)較粗，染色深，而外節(jié)較細(xì)，染色淺(圖1)。此后，每三天取材觀察小鼠視網(wǎng)膜的變化，包括測(cè)量RGC密度，視網(wǎng)膜全層、INL、ONL、內(nèi)叢狀層(inner plexiform layer，IPL)厚度等。視網(wǎng)膜層厚度、INL、ONL、IPL厚度均在LED光源暴露第6天開始變薄(與對(duì)照組比較，P<0.05)，RGC密度在LED光源暴露第9天開始減小(與對(duì)照組比較，P<0.05)。這些變化在LED光源暴露第12天逐漸穩(wěn)定，第15天視網(wǎng)膜損傷與第12天比較沒(méi)有改變(表1)。因此，本研究后續(xù)LED光源暴露時(shí)間均采用15 d。與第0天比較，第15天時(shí)RGCs皺縮，胞質(zhì)嗜酸性變，細(xì)胞排列疏松。核大小不一，可見核固縮、核碎裂、核溶解，有殘存細(xì)胞空泡。IPL、INL、ONL層厚度變薄。INL和ONL細(xì)胞密度降低，邊緣不整，部分細(xì)胞凋亡。而感光細(xì)胞層(photoreceptor layer，PRL)部分細(xì)胞外節(jié)丟失，細(xì)胞疏松、形態(tài)不規(guī)則(圖1)。

GCL.神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層；IPL.內(nèi)叢狀層；INL.內(nèi)核層；ONL.外核層；PRL.感光細(xì)胞層。

表1 LED光源暴露不同時(shí)間視網(wǎng)膜厚度RGC密度統(tǒng)計(jì)

2.2 不同光源照射對(duì)視網(wǎng)膜的影響 為進(jìn)一步驗(yàn)證LED光源對(duì)視網(wǎng)膜的損傷是通過(guò)其藍(lán)光照射導(dǎo)致，本研究使用不同光照射15 d觀察其對(duì)視網(wǎng)膜的損傷情況，不同光包括自然光、日光燈、LED燈、藍(lán)光燈。與自然光照射比較，日光燈組視網(wǎng)膜總厚度、INL、ONL和IPL厚度均沒(méi)有明顯變薄，RGC密度也沒(méi)有明顯改變，P>0.05，而藍(lán)光燈組視網(wǎng)膜總厚度、INL、ONL和IPL厚度明顯變薄，RGC密度也明顯降低，P<0.05(表2)。視網(wǎng)膜HE染色顯示，藍(lán)光燈組小鼠RGCs出現(xiàn)細(xì)胞排列疏松、核固縮，嗜酸性粒細(xì)胞增多等病理?yè)p傷表現(xiàn)，還出現(xiàn)凋亡后殘余細(xì)胞空泡。藍(lán)光燈組INL、ONL也出現(xiàn)病理?yè)p傷，包括細(xì)胞層數(shù)減少、排列紊亂，邊界不齊，而PRL部分細(xì)胞外節(jié)丟失，細(xì)胞疏松、形態(tài)不規(guī)則(圖2)。

GCL.神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層；IPL.內(nèi)叢狀層；INL.內(nèi)核層；ONL.外核層；PRL.感光細(xì)胞層。

與自然光比較，LED光源暴露對(duì)視網(wǎng)膜的損傷出現(xiàn)于視網(wǎng)膜全層，INL、ONL和IPL厚度變薄，RGC密度降低，P<0.05(表2)，這與藍(lán)光照射對(duì)視網(wǎng)膜的損傷相似。這些結(jié)果提示，LED燈對(duì)視網(wǎng)膜的損傷主要是其藍(lán)光光譜作用的結(jié)果，與其他光譜照射無(wú)關(guān)。另外，LED光源暴露對(duì)視網(wǎng)膜全層、IPL厚度及RGC細(xì)胞密度的影響較藍(lán)光暴露小(P<0.05)，而INL和ONL層厚度則沒(méi)有明顯區(qū)別(P>0.05)。這提示LED光源對(duì)視網(wǎng)膜的損傷作用比單純藍(lán)光更弱，這可能與LED光源其他光譜成分的作用有關(guān)。

表2 不同光源暴露15 d視網(wǎng)膜厚度與RGC密度統(tǒng)計(jì)

3 討論

目前，LED光源被廣泛應(yīng)用，隨著LED燈的迅速普及，家用LED燈導(dǎo)致的視網(wǎng)膜損傷逐漸引起重視。Koide等[8]最早進(jìn)行了LED產(chǎn)生的藍(lán)光對(duì)獼猴視網(wǎng)膜損傷的研究，發(fā)現(xiàn)LED光源刺激時(shí)間超過(guò)40 min即可造成視網(wǎng)膜干細(xì)胞的破壞。南莉等[9]使用500 lux的LED光源照射7 d即可造成大鼠視網(wǎng)膜細(xì)胞損傷，細(xì)胞凋亡相關(guān)基因 Bax、Caspase-3 促進(jìn)光損傷的發(fā)生與進(jìn)展。200 lux的藍(lán)色LED光源照射1個(gè)月會(huì)導(dǎo)致凋亡相關(guān)cleved-PARP蛋白的表達(dá)水平增加，而綠光、紅光LED照射組沒(méi)有觀察到相似變化。

藍(lán)光的色素光譜吸收峰值與線粒體相似，可能是導(dǎo)致線粒體的破壞和氧自由基的增加的直接因素[10]。此外，視紫紅質(zhì)介導(dǎo)的光化學(xué)損傷、色素上皮細(xì)胞代謝產(chǎn)物的積聚、脂質(zhì)過(guò)氧化、氧自由基的破壞作用、細(xì)胞因子表達(dá)改變等也可能是視網(wǎng)膜光損傷的相關(guān)因素[11]。本研究發(fā)現(xiàn)，在不同時(shí)長(zhǎng)的LED光源暴露下，第6天視網(wǎng)膜即開始出現(xiàn)病理?yè)p傷變化，第15天損傷達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)，視網(wǎng)膜各層厚度減少是其損傷主要組織學(xué)表現(xiàn)，INL、IPL和ONL厚度減小。本研究還發(fā)現(xiàn)，RGC也出現(xiàn)損傷，主要表現(xiàn)為細(xì)胞核的固縮、凋亡小體出現(xiàn)和細(xì)胞密度的降低等病理表現(xiàn)，并且與LED光源暴露時(shí)長(zhǎng)呈正相關(guān)。RGC在形成視神經(jīng)動(dòng)作電位的過(guò)程中至關(guān)重要，而其損傷與神經(jīng)元類似具有不可再生性，其對(duì)視力的影響尤為重要。本研究結(jié)果顯示，長(zhǎng)期LED光源暴露對(duì)RGC可形成不可逆性損傷。這提示，LED光源可能存在損傷視力的潛在風(fēng)險(xiǎn)，將在下一步的研究中明確其損傷機(jī)制及其預(yù)防的方法。本研究還利用不同光源暴露發(fā)現(xiàn)，藍(lán)光暴露造成的視網(wǎng)膜損傷與LED光源暴露相似，這提示目前LED光源對(duì)藍(lán)光的屏蔽效果還需進(jìn)一步改進(jìn)。另外，與藍(lán)光暴露比較，LED光源暴露在視網(wǎng)膜全層厚度、IPL厚度和RGC細(xì)胞密度等方面損傷較輕。這提示，LED光源與藍(lán)光暴露對(duì)視網(wǎng)膜的損傷并不完全一致，LED光源中其他光譜成分可能也會(huì)影響視網(wǎng)膜光損傷。LED光源藍(lán)光成分的其他作用也被發(fā)現(xiàn)。張麗敏等[12]發(fā)現(xiàn)，高糖環(huán)境下低能LED光照可以起到抗細(xì)胞凋亡的作用，提示光生物調(diào)節(jié)可能成為治療糖尿病視網(wǎng)膜病變的輔助治療手段。Wright等[13]發(fā)現(xiàn)，470 nm的藍(lán)色LED光源可調(diào)節(jié)褪黑素分泌，可以調(diào)節(jié)晝夜節(jié)律。嚴(yán)永紅等[14]發(fā)現(xiàn)，LED照明在工廠作業(yè)中同樣具有優(yōu)勢(shì)，被試者疲勞度下降，視覺(jué)靈敏度和認(rèn)知能力與對(duì)照組比較均有提高[14]。因此，LED光源中藍(lán)光成分對(duì)機(jī)體的影響還需進(jìn)一步探討。

此外，LED光源的色溫、頻閃也是視網(wǎng)膜致傷原因。高色溫LED燈可刺激活化相關(guān)信號(hào)通路，干擾色素上皮細(xì)胞炎性因子的分泌[15]。由于LED燈的正向伏安特性導(dǎo)致其頻閃現(xiàn)象明顯多于傳統(tǒng)光源，光源頻閃頻率的增高可損害視網(wǎng)膜功能[16]。

由于嚙齒動(dòng)物視網(wǎng)膜與人存在差異性，其對(duì)LED光源暴露造成的影響也與人的視網(wǎng)膜存在差異。Sliney[17]發(fā)現(xiàn)，大鼠視網(wǎng)膜在相同燈光亮度下接受的輻射照度比人視網(wǎng)膜接受的輻射照度高出60%。這提示，本研究需要通過(guò)臨床相關(guān)病例進(jìn)一步研究。

綜上所述，LED光源暴露時(shí)間與視網(wǎng)膜損傷呈正相關(guān)，并且其對(duì)小鼠視網(wǎng)膜的損傷與藍(lán)光暴露造成的視網(wǎng)膜損傷相似。日常LED光源中藍(lán)光光譜對(duì)視網(wǎng)膜的損傷作用需要引起重視。