陸星宇，劉登鴻，龐 聰，徐鴻濤，方 芳，萬(wàn) 楚，高 潔

（廣西大學(xué) 輕工與食品工程學(xué)院，廣西 南寧 530000）

馬尾藻（Sargassum pallidum）屬褐藻門(mén)（Phaeophyta），墨角藻目（Fucalus），馬尾藻科（Sargassaceae），馬尾藻屬（Sargassum）[1]，是一種暖溫帶性藻類(lèi)，盛產(chǎn)于我國(guó)渤海和黃海等沿海各地，分布廣泛，資源豐富[2]。馬尾藻營(yíng)養(yǎng)豐富，含有膳食纖維、氨基酸、維生素、礦物元素（Ca、P、K等）和不飽和脂肪酸等多種營(yíng)養(yǎng)成分[3-4]，具有良好的保健功能，如馬尾藻含有的膳食纖維對(duì)雌性激素的吸附作用大于紅藻類(lèi)膳食纖維，且具有良好的通便作用[5]。馬尾藻多糖是從馬尾藻中提取出的高黏度水溶性物質(zhì)[6]，主要成分為巖藻聚糖硫酸酯（Fucoidan），其單糖組成主要是巖藻糖，并含有活性基團(tuán)硫酸基，最早是由瑞典科學(xué)家Kylin在20世紀(jì)初提出來(lái)并命名的[7]，現(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)該糖具有免疫調(diào)節(jié)[8]、降血脂[9]、降血糖[10]、抗腫瘤[11-12]、抗病毒[13]、抗氧化[14-15]、抗炎等多種生理活性，具有極大的藥用價(jià)值。

低聚糖（oligosaccharide）又稱(chēng)寡糖，是一種具有特殊生理功能的不消化性糖，具有改善腸道菌群和提高機(jī)體免疫力等重要的生理作用。低聚糖的化學(xué)本質(zhì)是一些不能被消化的短鏈碳水化合物，一般由2～10個(gè)單糖單位通過(guò)糖苷鍵連接的直鏈或支鏈的小聚合體[16]，介于單體單糖與高度聚合的多糖之間。與多糖相比，低聚糖具有黏度低、聚合度低、分子質(zhì)量小、水溶性好、無(wú)抗原性、易吸收、生物利用性好以及在宿主體內(nèi)積累效應(yīng)較弱[13，17-18]等顯著優(yōu)勢(shì)。

馬尾藻低聚糖是由馬尾藻多糖水解后得到的一種低分子質(zhì)量的硫酸化海藻低聚糖[19]。海藻低聚糖的制備途徑一般有兩種：一是從天然原料中直接提取，缺點(diǎn)是得率低且純度難以保證；二是通過(guò)海藻多糖降解，即先從原料中提取多糖，再對(duì)多糖進(jìn)行降解獲取海藻低聚糖。海藻多糖降解制備海藻低聚糖的方法主要有化學(xué)降解、物理降解和酶法降解，但是傳統(tǒng)的化學(xué)降解和物理降解存在反應(yīng)劇烈、設(shè)備維護(hù)成本高、環(huán)境污染嚴(yán)重、產(chǎn)量較低以及產(chǎn)物聚合度難以控制等問(wèn)題，而與化學(xué)降解法和物理降解法相比，酶解法具有反應(yīng)條件溫和、提取效率高、工藝容易控制且對(duì)環(huán)境友好等特點(diǎn)，因此酶法制備海藻寡糖逐漸成為近年來(lái)研究的熱點(diǎn)。國(guó)內(nèi)外對(duì)酶降解制備低聚糖的研究已有報(bào)道，賀秋紅等[19]利用商業(yè)海藻膠裂解酶制備海藻寡糖，得到了平均聚合度為4.08的海藻寡糖；CHEN J等[20]用需鈉弧菌SK 42.001產(chǎn)生的海藻裂解酶降解海藻酸鈉獲得低聚糖，并對(duì)其結(jié)構(gòu)和活性進(jìn)行了研究。本研究采用水提醇沉法獲得馬尾藻粗多糖，利用水解酶對(duì)馬尾藻粗多糖進(jìn)行降解，并通過(guò)單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化制備馬尾藻功能性低聚糖的酶解工藝，對(duì)馬尾藻低聚糖的制備和生產(chǎn)起到一定指導(dǎo)作用，為馬尾藻低聚糖的開(kāi)發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 原料和菌株

干燥馬尾藻：廣西北海市云南路水產(chǎn)市場(chǎng)；副干酪乳桿菌（Lactobacillus paracei）TYM201：本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 化學(xué)試劑

果膠酶（50 000 U/mL）、纖維素酶（700 U/mL）、植物水解酶（5 086 U/mL）：諾維信（中國(guó)）生物技術(shù)有限公司；3,5-二硝基水楊酸（dinitrosalicylic acid，DNS）（分析純）：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

MRS液體培養(yǎng)基：蛋白胨10 g/L，牛肉膏5 g/L，酵母粉4 g/L，葡萄糖10 g/L，乙酸鈉5 g/L，磷酸二氫鉀2 g/L，檸檬酸三銨2 g/L，硫酸鎂0.2 g/L，硫酸錳0.05 g/L，吐溫80 1 g/L。調(diào)pH值至5.7±0.2。121 ℃高壓蒸汽滅菌15 min。

1.2 儀器與設(shè)備

HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋：上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海亞榮生化儀器廠；TF-FD-1真空冷凍干燥機(jī)：上海田楓實(shí)業(yè)有限公司；XW-80A多用途混勻儀：海門(mén)市其林貝爾儀器制造有限公司；HJ-3恒溫磁力攪拌器：常州國(guó)華電器有限公司；3-18R離心機(jī)：湖南恒諾儀器設(shè)備有限公司；Infinite M200PRO酶標(biāo)儀：奧地利Tecan Austria GmbH有限公司；XT-A400多功能粉碎機(jī)：永康市紅太陽(yáng)機(jī)電有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 馬尾藻粗多糖制備

采用水提醇沉法[21]提取馬尾藻粗多糖：稱(chēng)取250.00 g干燥馬尾藻，用打粉機(jī)打成粉末，加入5.00 L蒸餾水，80 ℃熱水提取5 h，用紗布濾去殘?jiān)?，將濾液在8 000 r/min的條件下離心15 min后，取出上清液并濃縮至原來(lái)體積的1/5，冷卻至室溫，向濃縮液中加入5倍體積分?jǐn)?shù)為95%的乙醇，靜置于4 ℃醇沉24 h，紗布過(guò)濾并收集沉淀，在-18 ℃的條件下冷凍干燥36 h得馬尾藻粗多糖。

1.3.2 分析檢測(cè)

低聚糖得率與還原糖增量呈正相關(guān)，以還原糖增量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用DNS比色法[22-23]測(cè)定。

葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)繪制：以葡萄糖含量為橫坐標(biāo)（X），以O(shè)D540nm值為縱坐標(biāo)（Y），繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)得葡萄糖溶液的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)回歸方程為Y=0.569 1X-0.021 2，相關(guān)系數(shù)R2=0.998 3。

樣品的制備：準(zhǔn)確稱(chēng)取10mg馬尾藻粗多糖，溶解于10mL pH為4.5的磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer solution，PBS）中，其他試驗(yàn)條件設(shè)置為：酶解溫度50 ℃、酶解時(shí)間240 min、酶底比5∶1 000，酶解結(jié)束后沸水加熱5 min滅酶，冷卻。

取馬尾藻多糖酶解液和酶解前馬尾藻多糖溶液各1 mL于試管中，加入2 mL DNS試劑，混勻，沸水浴2 min，流水冷卻，補(bǔ)水至15 mL，混勻，取200 μL于96孔板，測(cè)OD540nm值。代入葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)回歸方程，求得酶解前后的還原糖含量[22，24]，其增量計(jì)算公式如下：

式中：m1為多糖酶解后的還原糖含量，mg/mL；m0為多糖酶解前的還原糖含量，mg/mL；m為馬尾藻多糖初始含量，mg/mL。

1.3.3 酶篩選試驗(yàn)

本試驗(yàn)選用比較常用的幾種分解酶：果膠酶（A）、纖維素酶（B）、植物水解酶（C），以還原糖增量及低聚糖對(duì)副干酪乳桿菌TYM201的益生作用為評(píng)價(jià)指標(biāo)。3種酶以下列組合形式：A、B、C、AB（1∶1）、AC（1∶1）、BC（1∶1）、ABC（1∶1∶1）分別酶解馬尾藻多糖，篩選出最佳的酶組合。酶解條件為：酶解溫度50 ℃、酶解pH 4.5、酶解時(shí)間240 min、酶底比5∶1 000。

（1）不同酶組合對(duì)酶解效果的影響

以滅活酶解液（沸水浴5 min）為試驗(yàn)組，酶解前滅活多糖溶液為空白對(duì)照，以還原糖增量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，初步篩選出酶解效果最好的3種酶組合。還原糖增量測(cè)定方法參考1.3.2。

（2）不同酶組合對(duì)副干酪乳桿菌TYM201生長(zhǎng)的影響

去除MRS液體培養(yǎng)基中的葡萄糖和水，加入初篩選出的3種酶組合對(duì)應(yīng)的酶解液，配制低聚糖培養(yǎng)基（記為OX，X為酶組合編號(hào)）；為排除酶以及多糖自身對(duì)試驗(yàn)的影響，用等量同濃度多糖＋滅活酶溶液代替OX中的酶解液，配制多糖＋滅活酶培養(yǎng)基（記為PEX，X為酶組合編號(hào)）；去除MRS液體培養(yǎng)基中的葡萄糖，配制空白培養(yǎng)基（記為K）。向上述培養(yǎng)基中接種5%副干酪乳桿菌TYM201，在37 ℃下培養(yǎng)24 h，每隔3 h取100 μL菌液在波長(zhǎng)600 nm下測(cè)定菌液的OD600nm值。以菌液的OD600nm值為縱坐標(biāo)繪制生長(zhǎng)曲線(xiàn)[25-26]，考察不同酶組合對(duì)副干酪乳桿菌TYM201生長(zhǎng)的影響，從而篩選出綜合效果最好的酶組合。

1.3.4 酶解工藝優(yōu)化

（1）單因素試驗(yàn)

以還原糖增量為指標(biāo)，酶解工藝基本參數(shù)及還原糖增量測(cè)定方法參考1.3.2。在基本參數(shù)下采用單因素法依次考察酶底比（5∶1 000、6∶1 000、7∶1 000、8∶1 000、9∶1 000）、酶解溫度（40 ℃、45 ℃、50 ℃、55 ℃、60 ℃）、酶解時(shí)間（60 min、90 min、120 min、150 min、180 min）、酶解pH（4.0、4.5、5.0、5.5、6.0）對(duì)還原糖增量的影響。

（2）響應(yīng)面試驗(yàn)

Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)：在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，利用Plackett-Burman（PB）試驗(yàn)設(shè)計(jì)（N=12），以還原糖增量為響應(yīng)值，對(duì)酶底比、酶解溫度、酶解時(shí)間及酶解pH 4個(gè)單因素進(jìn)行評(píng)價(jià)，篩選出顯著性因素，運(yùn)用Design-Expert 12.0.3軟件進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)，共12次試驗(yàn)，設(shè)置每個(gè)因素的-1、1水平[27]，具體試驗(yàn)設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

表1 Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平Table 1 Factors and levels of Plackett-Burman tests design

最陡爬坡試驗(yàn)：根據(jù)PB試驗(yàn)結(jié)果，去除影響不顯著的因素，對(duì)剩下因素的相互影響進(jìn)行探究。采用最陡爬坡試驗(yàn)確定顯著因素酶解溫度、酶底比與酶解pH的最佳區(qū)域。

Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)：以最陡爬坡試驗(yàn)得出的最高響應(yīng)值點(diǎn)作為中心點(diǎn)，設(shè)計(jì)3因素3水平的響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)[28-30]。以酶解溫度（X1）、酶底比（X2）及酶解pH（X3）為自變量，以還原糖增量（Y）為響應(yīng)值，采用Design-Expert 12.0.3軟件設(shè)計(jì)Box-Behnken響應(yīng)面試驗(yàn)方案并對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平見(jiàn)表2。

表2 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平Table 2 Factors and levels of Box-Behnken tests design

1.3.5 數(shù)據(jù)處理

所有試驗(yàn)設(shè)計(jì)3個(gè)平行，試驗(yàn)結(jié)果采用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。采用Origin 9.0對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行作圖，響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果采用Design-Expert 12.0.3進(jìn)行分析處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 酶的種類(lèi)及組合篩選

2.1.1 不同酶組合對(duì)酶解效果的影響

以滅活酶解液為試驗(yàn)組，酶解前滅活多糖溶液為空白對(duì)照，測(cè)定得酶解前后吸光度值的差值，然后根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)回歸方程計(jì)算還原糖增量，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 不同酶組合對(duì)還原糖增量的影響Table 3 Effect of different enzyme combinations on reducing sugar increment

由表3可知，C、AC（1∶1）和ABC（1∶1∶1）3種酶組合的酶解效果最好，經(jīng)3種酶組合酶解后的還原糖增量分別為0.167 7 mg/mg、0.171 5 mg/mg、0.067 9 mg/mg，明顯高于其他組。因此，選擇C、AC（1∶1）和ABC（1∶1∶1）3種酶組合進(jìn)行下一步試驗(yàn)。

2.1.2 不同酶組合對(duì)副干酪乳桿菌TYM201生長(zhǎng)的影響

由圖1a、圖1b可知，在培養(yǎng)過(guò)程中AC和ABC兩組中酶解液的OD600nm值均高于空白組的OD600nm值，即酶解液中副干酪乳桿菌TYM201的數(shù)量比空白組多，說(shuō)明酶解液對(duì)副干酪乳桿菌TYM201生長(zhǎng)具有一定的促進(jìn)作用，同時(shí)多糖＋酶溶液的OD600nm值明顯高于酶解液組的OD600nm值，說(shuō)明多糖+酶對(duì)副干酪乳桿菌TYM201有益，故不能證明酶解液中的低聚糖能夠促進(jìn)副干酪乳桿菌TYM201的增殖。由圖1c可知，C酶（植物水解酶）酶解液的OD600nm值高于多糖＋酶溶液的OD600nm值，且24 h時(shí)的OD600nm值＞0.35，其余兩組中酶解液的OD600nm值均低于多糖＋酶溶液的OD600nm值，表明經(jīng)過(guò)植物水解酶水解產(chǎn)生的低聚糖對(duì)副干酪乳桿菌TYM201生長(zhǎng)有促進(jìn)作用。綜上，選擇植物水解酶作為本試驗(yàn)用酶。

圖1 不同酶組合對(duì)副干酪乳桿菌TYM201生長(zhǎng)的影響Fig.1 Effect of different enzyme combinations on Lactobacillus paracasei TYM201 growth

2.2 酶解工藝優(yōu)化單因素試驗(yàn)

2.2.1 酶底比對(duì)酶解效果的影響

由圖2可知，隨著酶底比在5∶1 000～7∶1 000范圍內(nèi)的增高，還原糖增量也逐漸增大；在酶底比達(dá)到7∶1 000時(shí)，還原糖增量達(dá)到最大值，為（0.205 6±0.004 4）mg/mg；酶底比在7∶1 000～9∶1 000范圍內(nèi)繼續(xù)增加，還原糖增量呈現(xiàn)出下降的趨勢(shì)。一般而言，隨著酶濃度的增加，酶促反應(yīng)速度加快，即單位時(shí)間內(nèi)生成的產(chǎn)物量增大。但是當(dāng)酶濃度足夠大時(shí)，沒(méi)有多余的底物與酶結(jié)合，過(guò)量的酶反而會(huì)抑制酶反應(yīng)的進(jìn)行，從而導(dǎo)致還原糖增量下降[31]。因此，最適酶底比為7∶1 000。

圖2 不同酶底比對(duì)還原糖增量的影響Fig.2 Effect of different enzyme and substrate ratios on reducing sugar increment

2.2.2 酶解溫度對(duì)酶解效果的影響

由圖3可知，在酶解溫度為40～55 ℃時(shí)，還原糖增量隨酶解溫度升高而增加；在酶解溫度為55 ℃時(shí)，還原糖增量達(dá)到最大值，為（0.218 0±0.002 9）mg/mg；在酶解溫度高于55 ℃之后，還原糖增量有所下降。在一定范圍內(nèi)酶活性隨著溫度的升高而增強(qiáng)，但高于最適溫度后，酶活性隨著溫度的升高而降低甚至失活，造成酶催化活性的降低[17]。因此，最適酶解溫度為55 ℃。

圖3 不同酶解溫度對(duì)還原糖增量的影響Fig.3 Effect of different enzymolysis temperature on reducing sugar increment

2.2.3 酶解時(shí)間對(duì)酶解效果的影響

由圖4可知，當(dāng)酶解時(shí)間為60～120 min時(shí)，還原糖增量隨酶解時(shí)間延長(zhǎng)而增高；當(dāng)酶解時(shí)間達(dá)到120 min時(shí)，還原糖增量達(dá)到最大值，為（0.196 7±0.001 5）mg/mg；當(dāng)酶解時(shí)間＞120 min之后，還原糖增量有所下降。造成這種現(xiàn)象的原因是隨著酶解反應(yīng)進(jìn)行，底物濃度降低，酶的活力下降，不利于酶促反應(yīng)繼續(xù)進(jìn)行，從而造成還原糖增量下降[31-32]。因此，最適酶解時(shí)間為120 min。

圖4 不同酶解時(shí)間對(duì)還原糖增量的影響Fig.4 Effects of different enzymolysis time on reducing sugar increment

2.2.4 酶解pH對(duì)酶解效果的影響

由圖5可知，當(dāng)pH值4.0～5.5時(shí)，隨著pH值的升高，還原糖增量也隨之增加；當(dāng)酶解pH值為5.5時(shí)，還原糖增量最大，為（0.204 7±0.004 9）mg/mg；當(dāng)酶解pH值＞5.5之后，隨著pH值的升高，還原糖增量隨之減少。這可能與酶自身的性質(zhì)和結(jié)構(gòu)有關(guān)，即酶在一定的pH值范圍內(nèi)會(huì)表現(xiàn)出最大活力，偏離最適pH值時(shí)會(huì)改變酶的活性中心構(gòu)像，甚至改變整個(gè)酶分子的結(jié)構(gòu)，使酶變性失活，而酶活力下降，影響了酶解反應(yīng)的進(jìn)程，減弱了酶解速度，還原糖增量下降[33]。因此，最適酶解pH值為5.5。

圖5 不同酶解pH值對(duì)還原糖增量的影響Fig.5 Effect of different enzymolysis pH on reducing sugar increment

2.3 Plackett-Burman試驗(yàn)結(jié)果與分析

對(duì)PB試驗(yàn)結(jié)果（表4）進(jìn)行回歸分析，結(jié)果見(jiàn)表5。由表5可知，酶底比表現(xiàn)為正效應(yīng)（即隨著影響因素值的增大，還原糖增量為升高趨勢(shì)），酶解溫度、酶解時(shí)間與酶解pH表現(xiàn)為負(fù)效應(yīng)（即隨著影響因素值的增大，還原糖增量為降低趨勢(shì)）。試驗(yàn)因素酶解pH、酶底比對(duì)還原糖增量影響極顯著（P＜0.01），溫度對(duì)還原糖增量影響顯著（P＜0.05），而時(shí)間影響不顯著（P＞0.05），故選擇酶解溫度、酶底比和酶解pH三個(gè)顯著影響因素進(jìn)行馬尾藻功能低聚糖制備工藝的響應(yīng)面優(yōu)化和設(shè)計(jì)。由于時(shí)間對(duì)還原糖增量影響不顯著且表現(xiàn)為負(fù)效應(yīng)，因此，在優(yōu)化提取過(guò)程中，考慮到提高效率及節(jié)約成本[34]，并結(jié)合單因素試驗(yàn)結(jié)果，將酶解時(shí)間固定為120 min。

表4 Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 4 Design and results of Plackett-Burman tests

表5 各因素水平、效應(yīng)值及顯著性分析Table 5 Level,effect value and significance analysis of each factors

通過(guò)最陡爬坡試驗(yàn)可以確定響應(yīng)面的分析中心。由表6可知，隨著酶解溫度、酶底比和酶解pH的改變，還原糖的增加量先增加后減少，當(dāng)酶解溫度為55 ℃、酶底比為7∶1 000、酶解pH 5.5時(shí)馬尾藻還原糖增量最大，因此以第3組水平作為響應(yīng)面的分析中心，進(jìn)行下一步優(yōu)化。

表6 最陡爬坡試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 6 Design and results of the steepest ascent tests

2.4 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

在最陡爬坡試驗(yàn)結(jié)果基礎(chǔ)上，以酶解溫度（X1）、酶底比（X2）及酶解pH（X3）為自變量，還原糖增量為響應(yīng)值（Y）進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)，利用Design-Expert 12.0.3進(jìn)行Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)，Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表7，回歸模型方差分析見(jiàn)表8。

表7 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果及分析Table 7 Results and analysis of Box-Behnken tests design

表8 回歸模型方差分析Table 8 Variance analysis of regression model

利用Design-Expert 12.0.3對(duì)表7的試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行方程擬合分析，以酶解溫度（X1）、酶底比（X2）及酶解pH（X3）為自變量，以還原糖增量（Y）為響應(yīng)值，得到的三次回歸方程如下：

由表8可知，所選模型極顯著（P＜0.01），失擬項(xiàng)不顯著（P＞0.05），說(shuō)明所得回歸方程擬合度較好，所選模型合適。由P值可知，三次項(xiàng)X12X2、X12X3，二次項(xiàng)X12、X22、X32，交互項(xiàng)X1X2、X1X3對(duì)還原糖增量影響極顯著（P＜0.01），說(shuō)明各因素對(duì)響應(yīng)值的影響不是簡(jiǎn)單的線(xiàn)性關(guān)系。由F值可知，在影響還原糖增量的3個(gè)關(guān)鍵因素中，強(qiáng)弱順序?yàn)閄1＞X3＞X2（即酶解溫度＞酶解pH＞酶底比）。用Design-Expert 12.0.3分析模型的可信度，模型的決定系數(shù)R2=99.58%，調(diào)整決定系數(shù)R2Adj=98.66%，R2接近1，表明模型預(yù)測(cè)的響應(yīng)值準(zhǔn)確，可用于試驗(yàn)分析和預(yù)測(cè)。同時(shí)模型的變異系數(shù)（coefficient of variation，CV）=5.99%＜15%（變異系數(shù)反映試驗(yàn)的可重復(fù)性，其值越小表明試驗(yàn)越精確），說(shuō)明模型比較精確，可信度較高并可用于擬合試驗(yàn)結(jié)果。綜上分析，該模型可用于分析預(yù)測(cè)植物水解酶酶解馬尾藻多糖制備馬尾藻功能低聚糖的工藝。

2.5 各因素交互作用響應(yīng)面分析

由Box-Behnken試驗(yàn)結(jié)果，利用軟件Design-Expert 12.0.3建立3D響應(yīng)面及等高線(xiàn)見(jiàn)圖6。在利用響應(yīng)面分析因素對(duì)響應(yīng)值的影響時(shí)，如果坡面比較陡，表明因素變化對(duì)響應(yīng)值影響顯著，反之則表明因素變化對(duì)響應(yīng)值影響不大[35]。等高線(xiàn)則能夠直觀反映因素交互作用對(duì)響應(yīng)值的影響，橢圓形的等高線(xiàn)表示交互作用顯著[36]。由圖6可知，3D響應(yīng)面在X1、X3方向上的坡面較陡，X1X2、X1X3、X2X3的等高線(xiàn)均呈橢圓形，表明X1、X3以及X1X2、X1X3、X2X3的交互作用對(duì)還原糖增量的影響顯著（P＜0.05）。

圖6 各因素間交互作用對(duì)還原糖增量影響的響應(yīng)面及等高線(xiàn)Fig.6 Response surface plots and contour lines of effects of interaction between each factors on reducing sugar increment

2.6 驗(yàn)證試驗(yàn)

通過(guò)Design-Expert 12.0.3軟件計(jì)算得到優(yōu)化后的酶解工藝參數(shù)為：酶解溫度54.460 ℃，酶底比7∶1000，酶解pH 5.460。在此條件下，馬尾藻多糖酶解后的還原糖增量預(yù)測(cè)值為0.206 4 mg/mg。為驗(yàn)證此方法的合理性，根據(jù)優(yōu)化后的酶解工藝稍作改動(dòng)后進(jìn)行試驗(yàn)，即酶解溫度54.5 ℃，酶底比7∶1 000，酶解pH 5.46。在此優(yōu)化條件下進(jìn)行3次平行驗(yàn)證試驗(yàn)，得到還原糖增量實(shí)際值為0.214 4 mg/mg，與試驗(yàn)?zāi)Ｐ偷念A(yù)測(cè)值0.206 4 mg/mg基本吻合，偏差較小。結(jié)果表明，響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化的結(jié)果比較準(zhǔn)確，所獲得的模型可以應(yīng)用于對(duì)馬尾藻功能性多糖酶解制備中還原糖增量的預(yù)測(cè)。

3 結(jié)論

本研究主要探究酶解法制備馬尾藻功能性低聚糖的最佳工藝，首先以低聚糖對(duì)副干酪乳桿菌TYM201的益生作用為功能指標(biāo)，篩選出益生效果最好的植物水解酶作為后續(xù)試驗(yàn)用酶。通過(guò)Plackett-Burman設(shè)計(jì)和Box-Behnken響應(yīng)面分析對(duì)制備工藝進(jìn)行優(yōu)化。最終確定酶法制備馬尾藻功能低聚糖的最佳工藝參數(shù)：酶解溫度54.5 ℃，酶底比7∶1 000，酶解pH 5.46。在此條件下馬尾藻多糖經(jīng)酶解后的還原糖增量為0.214 4 mg/mg。因此，通過(guò)響應(yīng)面優(yōu)化馬尾藻功能低聚糖的制備提取工藝是可行的，本實(shí)驗(yàn)可以為馬尾藻的進(jìn)一步加工利用提供科學(xué)參考。