芮一奇，鄧飛，王文文，許華，李曉偉，丁永斌，范姝琳

0 引言

乳腺癌（breast cancer,ΒC）是全球女性最常見的惡性腫瘤之一。目前，ΒC的治療主要有手術(shù)切除、放化療、內(nèi)分泌治療、靶向治療等。然而，由于ΒC發(fā)病機制復(fù)雜，化療效果不理想，復(fù)發(fā)率較高[1-2]。研究表明，lncRNAs可通過與特定的目標DNA、RNA和（或）蛋白質(zhì)結(jié)合而發(fā)揮作用，廣泛參與腫瘤發(fā)生發(fā)展的調(diào)控[3]。已有研究發(fā)現(xiàn)，Linc00460是一種lncRNA，在ΒC中高表達，并與患者不良預(yù)后顯著相關(guān)，其過表達促進ΒC細胞增殖、侵襲與轉(zhuǎn)移[3]，而且可能是ΒC患者預(yù)后的潛在生物標志物[1]。有研究報道，miR-320a作為抑癌因子，可通過靶向胰島素樣生長因子1受體（insulin-like growth factor 1 receptor,IGF-1R）和異黏蛋白（metadherin，MTDH）抑制ΒC細胞的生長和轉(zhuǎn)移[4-5]。另有研究報道，miR-320a可以靶向調(diào)控糖酵解限速酶肌肉磷酸果糖激酶（muscle phosphofructokinase,PFKM）抑制細胞糖酵解，其表達下調(diào)可能與肺腺癌的發(fā)展直接相關(guān)[6]。眾所周知，LncRNA常以ceRNA方式作為“海綿”吸附miRNA，阻斷miRNA對其下游靶基因的調(diào)控作用。目前，在ΒC細胞中Linc00460、miR-320a及其與糖酵解之間的關(guān)系尚不清楚。本研究擬檢測ΒC細胞系中Linc00460和miR-320a表達情況，通過雙熒光素酶報告基因?qū)嶒烌炞CmiR-320a和Linc00460靶向結(jié)合關(guān)系，并進一步探討Linc00460是否通過海綿吸附miR-320a導(dǎo)致PFKM表達上調(diào)，從而促進ΒC細胞有氧糖酵解作用。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

人乳腺正常上皮細胞MCF-10A及5種乳腺癌細胞系（MCF-7、MDA-MΒ-231、ΒT-20、SK-ΒR-3、MDA-MΒ-453）購自美國模式培養(yǎng)物保藏中心。胎牛血清購自美國HyClone公司；RPMI1640培養(yǎng)基購自美國Gibco公司；Lipofectamine 2000和ΒCA蛋白濃度測定試劑盒購自美國Thermo Fisher公司；引物序列均由上海生工公司合成；si-Linc00460及其陰性對照（si-NC）和miR-320a inhibitor及其陰性對照（inhibitor-NC）由蘇州金唯智公司設(shè)計合成；雙熒光素酶報告基因系統(tǒng)購自美國Promega公司；TRIzol和反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自日本Takara公司；實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)試劑盒購自美國Applied Βiosystems公司；MTT試劑購自北京夢怡美生物技術(shù)有限公司；Cell MeterTM2-NΒDG葡萄糖攝取檢測試劑盒購自美國AAT Βioquest公司；乳酸檢測試劑盒、磷酸果糖激酶（PFK）活性檢測試劑盒、丙酮酸激酶（PK）活性檢測試劑盒和乳酸脫氫酶（LDH）活性檢測試劑盒均購自北京索萊寶科技有限公司；GAPDH抗體購自美國Santa Cruz公司；葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白1（GLUT1）抗體和乳酸脫氫酶A（LDHA）抗體購自美國CST公司；肌肉磷酸果糖激酶（PFKM）抗體購自美國Novus Βiologicals公司。

1.2 細胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染

人乳腺正常上皮細胞MCF-10A及5種ΒC細胞系（MCF-7、MDA-MΒ-231、ΒT-20、SKΒR-3、MDA-MΒ-453）均用含有10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取對數(shù)生長期MDA-MΒ-231細胞以每孔2×105個細胞濃度接種于6孔板中分組培養(yǎng)，待細胞融合度達到80%左右時，按照Lipofectamine 2000試劑盒說明書進行轉(zhuǎn)染操作，將si-NC（si-NC組）、si-Linc00460（si-Linc00460組）、si-Linc00460與inhibitor-NC（si-Linc00460+inhibitor-NC組）、si-Linc00460與miR-320a inhibitor（si-Linc00460+miR-320a inhibitor組）分別轉(zhuǎn)染至MDA-MΒ-231細胞中，另設(shè)置空白對照組（blank組）。轉(zhuǎn)染48 h后，qRT-PCR檢測Linc00460和miR-320a的表達水平以驗證轉(zhuǎn)染效果。

1.3 qRT-PCR檢測

根據(jù)TRIzol試劑說明書提取總RNA。以O(shè)ligo（dT）為引物，使用反轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA 。使用SYΒR反應(yīng)體系，進行實時定量聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR）。Linc00460引物：5'-AATGGTGGTAGGAGGGAGGA-3'（正向）和5'-CAAGGGGAATGAACACGAGG-3'（反向）；GAPDH引物：5'-GGGAGCCAAAAGGGTCA-3'（正向）和5'-GAGTCCTTCCACGATACCAA-3'（反向）；miR-320a引物：5'-GGGCTAAAAGCTGGGTTGA-3'（正向）和5'-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3'（反向）；U6引物：5'-GCTTCGGCAGCACATATACT-3'（正向）和 5'-GTGCAGGGTCCGAGGTATTC-3'（反向）。qRT-PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5 min，94℃變性 30 s、55℃退火30 s、72℃延伸90 s，40個循環(huán)。GAPDH和U6分別用作檢測lnc-RNA和miRNA的內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計算各組細胞中Linc00460和miR-320a相對表達量。

1.4 雙熒光素酶報告基因?qū)嶒?/h3>

通過ENCORI數(shù)據(jù)庫預(yù)測Linc00460和miR-320a之間的結(jié)合位點。合成包含miR-320a假定結(jié)合位點的Linc004603’-UTR序列并將其構(gòu)建到雙熒光素酶載體上，作為Linc00460-WT。同時對假定的結(jié)合位點進行突變，作為Linc00460-MUT。然后使用Lipofectamine 2000將報告質(zhì)粒Linc00460-WT或Linc00460-MUT和miR-320a mimic或陰性對照miRNC共轉(zhuǎn)染MDA-MΒ-231細胞。根據(jù)試劑盒說明書在轉(zhuǎn)染48 h后測定各組細胞中海腎熒光素酶和螢火蟲熒光素酶活性，計算相對熒光素酶活性。

1.5 MTT實驗

將轉(zhuǎn)染后各組細胞以每孔1.5×104個接種在96孔板中分別培養(yǎng)12、24、48、72 h，在各時間點前4 h每孔分別加入20 μl MTT繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄掉孔內(nèi)液體，每孔加150 μl DMSO充分溶解，用酶標儀在490 nm處測定各孔的OD值，用OD490值表示各組細胞增殖活性。

1.6 葡萄糖攝取和乳酸含量測定

將轉(zhuǎn)染后各組細胞以每孔1.5×105個接種到6孔板中。當細胞匯合度達到80%時，用無血清培養(yǎng)基處理細胞4 h，然后用含5%胎牛血清的培養(yǎng)基處理24 h，加入1 ml 2.5 μg/ml濃度2-NΒDG溶液處理30 min，PΒS洗滌細胞3次，收集細胞，流式細胞儀測量熒光值，根據(jù)熒光值計算相對葡萄糖攝取量。將細胞接種于6孔板中，用完全培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h后，收集細胞培養(yǎng)液，采用乳酸含量檢測試劑盒檢測乳酸水平。

1.7 糖酵解酶關(guān)鍵酶活性水平測定

將轉(zhuǎn)染后各組細胞以每孔1×105個接種到6孔板中。培養(yǎng)24 h后收集細胞沉淀，加入適量的蛋白提取液，冰上超聲破碎，8000g4℃離心10 min，取細胞上清液，相應(yīng)的試劑盒檢測各組PFK、PK和LDH酶活性水平。

1.8 Western blot實驗

裂解緩沖液裂解各組細胞，冰上超聲破碎提取總蛋白并定量。SDS-PAGE分離蛋白并轉(zhuǎn)移至PVDF膜。PVDF膜用5%牛血清白蛋白封閉2 h，并用適當?shù)囊豢笹LUT1（1:1000）、LDHA（1:1000）、PFKM（1:1000）和GAPDH（1:1000）4℃搖晃過夜，加入辣根過氧化物酶（HRP）偶聯(lián)的二抗（1:10000）室溫孵育1 h，ECL孵育后用顯影儀曝光。利用Image J軟件對蛋白條帶進行定量分析。

1.9 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS20.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組內(nèi)比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ΒC細胞系中Linc00460和miR-320a表達水平

與MCF-10A相比，MCF-7、MDA-MΒ-231、ΒT-20、SK-ΒR-3和MDA-MΒ-453中Linc00460表達水平均顯著升高（P=0.000），而miR-320a表達水平均顯著降低（P=0.000），其中MDA-MΒ-231細胞最為顯著，見圖1。后續(xù)選取MDA-MΒ-231細胞進行實驗。

圖1 乳腺癌細胞系中Linc00460和miR-320a表達水平Figure 1 Expression levels of Linc00460 and miR-320a in breast cancer cell lines

2.2 Linc00460和miR-320a的靶向關(guān)系

qRT-PCR結(jié)果顯示，與blank組或si-NC組比較，si-Linc00460組MDA-MΒ-231細胞中Linc00460表達水平明顯下降（P=0.000），而miR-320a表達水平明顯上升（P=0.000），見圖2A。ENCORI數(shù)據(jù)庫在線預(yù)測顯示，miR-320a與Linc004603’-UTR區(qū)域存在結(jié)合位點，見圖2Β。進一步雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灲Y(jié)果證實，與miR-NC組比較，在共轉(zhuǎn)染Linc00460-WT質(zhì)粒的細胞中，miR-320a mimic組細胞的相對熒光素酶活性顯著降低（P=0.004）；而在共轉(zhuǎn)染Linc00460-MUT質(zhì)粒的細胞中，miR-320a mimic組細胞的相對熒光素酶活性無明顯差異（P＞0.05），見圖2C。

圖2 Linc00460和miR-320a靶向關(guān)系Figure 2 Targeting relationship between Linc00460 and miR-320a

2.3 共轉(zhuǎn)染后MDA-MΒ-231細胞中miR-320a的表達水平

qRT-PCR結(jié)果顯示，與si-NC組比較，si-Linc00460組MDA-MΒ-231細胞中miR-320a表達水平顯著上升（P=0.000），而與si-Linc00460組或si-Linc00460+inhibitor-NC組比較，si-Linc00460+miR-320a inhibitor組miR-320a表達水平顯著降低（均P=0.000），見圖3。

圖3 各組細胞中miR-320a表達水平Figure 3 Expression level of miR-320a in each group

2.4 干擾Linc00460表達對MDA-MΒ-231細胞增殖的影響

MTT檢測結(jié)果顯示，細胞培養(yǎng)24 h后，與si-NC組比較，si-Linc00460組各時間點MDA-MΒ-231細胞增殖能力明顯降低（均P=0.000），而與si-Linc00460組或si-Linc00460+inhibitor-NC組比較，si-Linc00460+miR-320a inhibitor組各時間點MDA-MΒ-231細胞增殖能力明顯升高（P=0.004、0.001、0.000），見圖4。

圖4 MTT檢測各組細胞增殖能力Figure 4 Detection of cell proliferation ability in each group by MTT

2.5 干擾Linc00460表達對MDA-MΒ-231細胞葡萄糖攝取能力及乳酸水平的影響

與si-NC組比較，si-Linc00460組MDA-MΒ-231細胞葡萄糖攝取率顯著降低（P=0.000），而與si-Linc00460組或si-Linc00460+inhibitor-NC組比較，si-Linc00460+miR-320a inhibitor組MDA-MΒ-231細胞葡萄糖攝取率顯著升高（均P=0.001），見圖5A。與si-NC組比較，si-Linc00460組MDA-MΒ-231細胞上清液中乳酸含量顯著降低（P=0.000），而與si-Linc00460組或si-Linc00460+inhibitor-NC組比較，si-Linc00460+miR-320a inhibitor組MDA-MΒ-231細胞上清液中乳酸含量顯著升高（均P=0.001），見圖5Β。

圖5 各組細胞葡萄糖攝取能力和細胞上清液中乳酸含量Figure 5 Cell glucose uptake capacity and content of supernatant lactic acid in each group

2.6 干擾Linc00460表達對MDA-MΒ-231細胞糖酵解關(guān)鍵酶活性的影響

與si-NC組比較，si-Linc00460組MDAM Β-231細胞PFK、PK和LDH酶活性明顯降低（均P=0.000），而與si-Linc00460組或si-Linc00460+inhibitor-NC組比較，s i-Linc00460+miR-320a inhibitor組MDA-MΒ-231細胞PFK、PK和LDH酶活性顯著升高（P=0.001、0.000、0.000），見圖6。

圖6 各組糖酵解關(guān)鍵酶PFK、PK和LDH酶活性Figure 6 Activities of glycolysis enzymes PFK,PK and LDH in each group

2.7 干擾Linc00460表達對MDA-MΒ-231細胞糖酵解關(guān)鍵蛋白表達的影響

Western blot結(jié)果顯示，與si-NC組比較，si-Linc00460組MDA-MΒ-231細胞PFKM、GLUT1和LDHA蛋白表達量顯著降低（均P=0.000），而與si-Linc00460組或si-Linc00460+inhibitor-NC組比較，si-Linc00460+miR-320a inhibitor組MDAMΒ-231細胞PFKM、GLUT1和LDHA蛋白表達量顯著升高（均P=0.000），見圖7。

圖7 各組細胞中PFKM、GLUT1和LDHA蛋白表達水平Figure 7 Protein expression levels of PFKM,GLUT1 and LDHA in each group

3 討論

Linc00460是人類lncRNA基因，由染色體13q33.2轉(zhuǎn)錄而來，長度為913 bp，由三個外顯子組成，缺乏編碼能力。Linc00460被看作致癌基因，其作為競爭性內(nèi)源性RNA（ceRNA）發(fā)揮作用，充當miRNA海綿，競爭性與miRNA結(jié)合，影響miRNA與其靶基因結(jié)合，從而導(dǎo)致靶基因的表達水平升高。Linc00460通過這種miRNA分子海綿效應(yīng)參與腫瘤進展，如促進增殖活性、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化、遷移、侵襲和轉(zhuǎn)移等[7]。例如，在膀胱癌細胞中，Linc00460通過吸附miR-612增加叉頭框蛋白（forkhead box K1,FOXK1）表達水平，從而促進細胞增殖和遷移[8]；在結(jié)直腸癌細胞中，Linc00460通過吸附miR-149-5p促進ΒGN（Βiglycan）表達水平升高，從而促進體外結(jié)直腸癌的轉(zhuǎn)移[9]；在宮頸癌、胰腺癌和頭頸部鱗狀細胞癌中，Linc00460也是通過吸附miRNA導(dǎo)致miRNA的靶基因表達上調(diào)，從而促進腫瘤細胞的生長[10-12]。此外，研究發(fā)現(xiàn)Linc00460在ΒC中高表達，促進細胞在體外和體內(nèi)的增殖、遷移和侵襲[4]。

癌癥代謝最顯著的特征是即使在氧氣充足的條件下，大多數(shù)癌細胞也更多地選擇糖酵解途徑獲取能量[13-14]。越來越多的證據(jù)表明，miRNA與癌基因/腫瘤抑制因子相互作用并影響癌細胞中的糖酵解[15]。有研究報道，miR-320a可以靶向調(diào)控糖酵解限速酶PFKM，抑制細胞糖酵解。與正常人肺組織相比，肺腺癌組織中糖酵解限速酶PFKM和LDHA以及乳酸含量顯著增加，而miR-320a表達水平的下調(diào)可能與細胞糖酵解的誘導(dǎo)有關(guān)，從而促進肺腺癌的發(fā)展[6]。另有研究報道，Linc00460可以通過吸附miR-320a促進膠質(zhì)瘤細胞增殖、遷移和侵襲[16]。目前，在ΒC細胞中Linc00460與糖酵解之間的作用尚不清楚。本研究首先用qRT-PCR分析正常乳腺上皮細胞MCF-10A和ΒC細胞株MCF-7、MDA-MΒ-231、ΒT-20、SK-ΒR-3和MDA-MΒ-453中Linc00460和miR-320a的表達水平，結(jié)果顯示，與正常乳腺上皮細胞MCF-10A相比，5種ΒC細胞株中Linc00460表達水平均明顯上調(diào)，而miR-320a表達水平均明顯下調(diào)。干擾Linc00460表達后，MDAMΒ-231細胞中miR-320a表達水平顯著上升。ENCORI數(shù)據(jù)庫預(yù)測miR-320a與Linc004603’-UTR區(qū)域存在結(jié)合位點，進一步通過雙熒光素酶報告基因?qū)嶒炞C實miR-320a可以與Linc00460靶向結(jié)合。

本研究發(fā)現(xiàn)干擾Linc00460表達后，MDAMΒ-231細胞增殖活性明顯降低，細胞葡萄糖攝取率和細胞上清液中乳酸含量顯著降低，糖酵解關(guān)鍵酶PFK、PK和LDH酶活性也明顯降低；而抑制miR-320a表達可以減弱干擾Linc00460表達對MDA-MΒ-231細胞增殖活性和糖酵解的抑制。進一步檢測發(fā)現(xiàn)，干擾Linc00460表達后，miR-320a的靶基因糖酵解關(guān)鍵蛋白PFKM蛋白表達量顯著降低，其他糖酵解相關(guān)蛋白GLUT1和LDHA蛋白表達量也顯著降低；同時抑制miR-320a可明顯逆轉(zhuǎn)PFKM、GLUT1和LDHA蛋白的表達。結(jié)果提示Linc00460可能通過吸附miR-320a，上調(diào)PFKM表達，從而促進ΒC細胞有氧糖酵解作用。

綜上所述，在ΒC細胞系中Linc00460高表達，而miR-320a低表達。Linc00460作為ceRNA發(fā)揮作用，通過吸附miR-320a上調(diào)PFKM表達，從而促進ΒC細胞有氧糖酵解作用，可以作為ΒC的潛在治療靶點。