劉堯，孫雪梅，劉靜，劉煒，呂菲，劉月平

0 引言

2020年全球食管癌新發(fā)病例約60.4萬，年發(fā)病率為6.3/105，占全部惡性腫瘤的3.1%；食管癌導(dǎo)致的死亡病例約54.4萬，年死亡率為5.6/105，占全部惡性腫瘤的5.5%[1]。鱗狀細(xì)胞癌是食管癌最常見的組織學(xué)類型，近年來，隨著診療技術(shù)的進(jìn)步，盡管其5年生存率有了一定的提高，但縱觀全球，5年生存率仍維持在10%～30%的較低水平[2]。尋找食管癌新的生物標(biāo)志物和治療靶點，對中晚期食管癌的治療具有重要意義。

目前臨床上對中晚期食管癌患者的治療主要是放化療、靶向治療以及PD-1/PD-L1免疫治療等，但效果有限，患者會出現(xiàn)腫瘤耐藥和不良反應(yīng)，因此，為了克服腫瘤耐藥和不良反應(yīng)，提高不同檢查點抑制劑協(xié)同用藥的抗腫瘤效果，開發(fā)新的免疫治療靶點迫在眉睫。纖維蛋白原樣蛋白1（fibrinogen-like protein 1,FGL1）屬于纖維蛋白原家族，其主要由肝細(xì)胞分泌，并參與其有絲分裂和代謝功能[3]。相關(guān)研究表明，F(xiàn)GL1是淋巴細(xì)胞活化基因3（Lymphocyte-activation gene 3,LAG-3）的T細(xì)胞抑制功能的主要配體，F(xiàn)GL1與LAG-3具有特異性的高親和力相互作用，阻斷LAG-3/FGL1相互作用可以增強(qiáng)抗腫瘤作用[4]。FGL1作為一個新的免疫檢查點靶點顯示出顯著優(yōu)勢，靶向FGL1是臨床試驗中一種新的免疫檢查點阻斷策略[3]。在腫瘤微環(huán)境中，TILs的存在也是決定免疫檢查點抑制劑抗腫瘤效果的重要因素。當(dāng)機(jī)體存在大量的TILs時，表明機(jī)體發(fā)揮了抗腫瘤的免疫反應(yīng)，患者通常具有較好的預(yù)后[5]。目前有關(guān)FGL1和TILs在食管癌中的研究尚未見報道。鑒于FGL1可作為一個新的免疫檢查點且與不良預(yù)后相關(guān)[6]，因此，本研究分析了FGL1在ESCC中的表達(dá)、TILs的分布情況及其相關(guān)性，同時進(jìn)行預(yù)后分析，為預(yù)測食管癌的預(yù)后和免疫治療提供新思路。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

篩選2019—2020年河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院經(jīng)手術(shù)切除后病理診斷準(zhǔn)確且術(shù)前未行新輔助治療的食管鱗狀細(xì)胞癌（esophageal squamous cell carcinoma,ESCC）手術(shù)患者120例，所有切片均由兩位高年資病理醫(yī)師根據(jù)第五版WHO消化系統(tǒng)腫瘤病理學(xué)和遺傳學(xué)分類標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行復(fù)閱，確定診斷無誤。按照美國癌癥聯(lián)合委員會（American Joint Committee on Cancer,AJCC）和國際抗癌聯(lián)盟（Union International Center of Cancer,UICC）聯(lián)合發(fā)表的第8版臨床分期進(jìn)行分期。本研究經(jīng)河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，所有入選患者均同意手術(shù)樣本使用且簽訂書面同意書。120例ESCC患者均經(jīng)電話隨訪或來院復(fù)查，隨訪截止時間為2021年12月。

1.2 試劑及儀器

兔抗人FGL1單克隆抗體購自Abcam公司（上海，EPR24018-27）；RM2135石蠟切片機(jī)購自德國Leica公司；全自動免疫組織化學(xué)機(jī)購自瑞士Roche公司。

1.3 方法

所有標(biāo)本均經(jīng)3.7%甲醛液固定，常規(guī)脫水、透明、石蠟包埋；將蠟塊固定于切片機(jī)上，切成4 μm厚的薄片，45℃水中展片、貼片，56℃恒溫箱中烤片，常規(guī)HE染色。免疫組織化學(xué)采用EnVision兩步法染色，DAΒ顯色，蘇木精對比染色。石蠟切片脫蠟、水化、自來水沖洗，抗原修復(fù)，切片陽性對照為人正常肝組織，陽性標(biāo)準(zhǔn)為細(xì)胞質(zhì)著色。

1.4 染色結(jié)果判定

顯微鏡下觀察FGL1定位于細(xì)胞質(zhì)，腫瘤細(xì)胞≥1%的細(xì)胞質(zhì)染色即為FGL1陽性，反之則為陰性。腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞（tumor-infiltrating lymphocytes,TILs）包括腫瘤內(nèi)浸潤淋巴細(xì)胞（intratumoral tumor-infiltrating lymphocytes,iTILs）和腫瘤間質(zhì)浸潤淋巴細(xì)胞（stromal tumor-infiltrating lymphocytes,sTILs），其評估根據(jù)浸潤程度分為低度（TILs≤10%）和高度（TILs＞10%）。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)處理采用SPSS26.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析。Spearman相關(guān)性分析FGL1的表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系，Kaplan-Meier法和多因素Cox回歸評估總生存率和預(yù)后影響因素。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 FGL1在食管鱗狀細(xì)胞癌中的表達(dá)情況

120例ESCC患者的臨床資料，見表1。在ESCC組織中，F(xiàn)GL1的陽性表達(dá)率為18.3%（22/120），主要定位于細(xì)胞質(zhì)，見圖1。FGL1的表達(dá)與TNM分期、淋巴結(jié)有無轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)，而與TILs呈負(fù)相關(guān)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05)，見表1。

圖1 食管鱗狀細(xì)胞癌中FGL1的表達(dá)(EnVision,×200)Figure 1 Expression of FGL1 in ESCC(EnVision,×200)

表1 120例食管鱗狀細(xì)胞癌中FGL1的表達(dá)及與臨床病理學(xué)特征的關(guān)系Table 1 Relationship between FGL1 expression and clinicopathological features in 120 cases of ESCC

2.2 食管鱗狀細(xì)胞癌中TILs的分布情況

在120例ESCC患者中，低度iTILs 73例（60.8%），高度iTILs 47例（39.2%）；低度sTILs 82例（68.3%），高度sTILs 38例（31.7%）。iTILs分布與腫瘤分化程度呈正相關(guān)，與FGL1的表達(dá)和TNM分期呈負(fù)相關(guān)；sTILs分布與腫瘤部位呈正相關(guān)，與FGL1的表達(dá)和TNM分期呈負(fù)相關(guān)，見表2。

表2 120例食管鱗狀細(xì)胞癌中TILs狀態(tài)與臨床病理學(xué)特征的關(guān)系Table 2 Relationship between TIL status and clinicopathological features in 120 cases of ESCC

2.3 預(yù)后分析

120例ESCC患者從確診時開始計算生存時間，截至2021年12月，隨訪時間12～36個月，平均24個月。隨訪期內(nèi)死亡13例（10.8%）。Kaplan-Meier生存分析結(jié)果顯示：患者生存時間與腫瘤直徑、TNM分期、淋巴結(jié)有無轉(zhuǎn)移、FGL1的表達(dá)、iTILs、sTILs有關(guān)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見圖2A。多因素Cox回歸結(jié)果顯示：患者生存時間與TNM分期、FGL1的表達(dá)有關(guān)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見圖2Β。

圖2 患者生存時間與臨床病理特征的關(guān)系Figure 2 Relationship between survival time and clinicopathological features

3 討論

ESCC較常發(fā)生于50歲以上的男性，在中國和其他亞洲國家相對常見，其特點是死亡率高，預(yù)后差。目前食管癌多采取聯(lián)合治療，包括術(shù)前放療和手術(shù)切除，或聯(lián)合放療、化療、免疫治療等[7]，但ESCC總體預(yù)后非常差。最近一項研究報道ESCC的3年和5年生存率分別為22.2%和19.0%[8]。因此，尋找一種新的生物標(biāo)志物和治療靶點迫在眉睫，這對于未來食管癌的治療也有重要意義。

FGL1屬于纖維蛋白原家族，與纖維蛋白原β亞基和γ亞基的羧基末端具有高氨基酸同源性，正常生理條件下，F(xiàn)GL1蛋白主要由肝細(xì)胞分泌，并參與其有絲分裂和代謝功能[9-10]。2019年，耶魯大學(xué)陳列平教授團(tuán)隊在Cell上發(fā)表了研究論文，證明了FGL1是LAG-3的一個重要的功能性配體，并揭示了該LAG-3-FGL1通路在腫瘤免疫中的作用[4]。自陳列平教授1999年發(fā)現(xiàn)PD-L1以來已過去20多年[11]。PD-1及其配體PD-L1的出現(xiàn)是腫瘤免疫治療領(lǐng)域的里程碑事件和腫瘤免疫逃逸機(jī)制的研究熱點，也是近年來腫瘤免疫療法研究的熱點。FGL1/LAG-3作為一條新的腫瘤免疫逃逸通路，可能作為腫瘤免疫治療的生物標(biāo)志物和治療靶點，它可能為腫瘤免疫治療提供一個新的思路。有研究表明，F(xiàn)GL1在肺癌、前列腺癌、黑色素瘤、結(jié)直腸癌、乳腺癌和腦瘤中表達(dá)上調(diào)，但在胰腺癌、肝癌和頭頸癌中表達(dá)下調(diào)[3]。有研究表明，F(xiàn)GL1在腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)，較高的血漿FGL1水平與癌癥患者對免疫治療的耐藥性和不良預(yù)后相關(guān)[12]。臨床前動物實驗證明，阻斷FGL1的單克隆抗體以類似于抗LAG-3的方式刺激T細(xì)胞免疫。作為新發(fā)現(xiàn)的LAG3高親和力配體，F(xiàn)GL1有可能以不同于MHCⅡ的作用方式與LAG3結(jié)合重新啟動“免疫剎車”[13]。此外，血漿中FGL1分泌水平是一個潛在的生物標(biāo)志物，可用于識別不能從免疫治療中獲益的患者[14]。本研究結(jié)果顯示，F(xiàn)GL1的陽性率為18.3%，F(xiàn)GL1的表達(dá)與TNM分期、淋巴結(jié)有無轉(zhuǎn)移和TILs有關(guān)。前述的研究已表明，F(xiàn)GL1在腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)，它可能是一個預(yù)后不良的生物標(biāo)志物，本研究120例ESCC患者中，F(xiàn)GL1表達(dá)更趨向于臨床分期較晚、淋巴結(jié)陽性的患者中，提示這些患者的預(yù)后不良。

在腫瘤微環(huán)境中，除了PD-L1在腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)外，TILs的存在也是決定免疫檢查點抑制劑抗腫瘤效果的重要因素[15]。研究表明腫瘤中高度淋巴細(xì)胞浸潤與良好的預(yù)后相關(guān)，TILs也成為了一個有價值的預(yù)后指標(biāo)[16]。在FGL1高表達(dá)的患者中，TILs，包括iTILs和sTILs的分布范圍相對較局限，iTILs分布與FGL1的表達(dá)、腫瘤分化程度和臨床分期有關(guān)；sTILs分布與FGL1的表達(dá)、腫瘤部位和臨床分期有關(guān)。這些研究可能提示，F(xiàn)GL1和TILs聯(lián)合評估可作為ESCC預(yù)測預(yù)后的生物標(biāo)志物，也為將來更進(jìn)一步的研究提供了思路。本研究生存分析結(jié)果顯示腫瘤直徑、臨床分期、淋巴結(jié)狀況、FGL1的表達(dá)、TILs的分布均與患者的預(yù)后有關(guān)，而且FGL1的表達(dá)、TILs的分布和臨床分期是患者預(yù)后的影響因素，這也證實了我們前述的推論。

總之，免疫系統(tǒng)與腫瘤發(fā)生發(fā)展的關(guān)系是復(fù)雜而動態(tài)的，特別是免疫微環(huán)境中的成分相互制約。因此，充分認(rèn)識腫瘤的免疫治療機(jī)制，是腫瘤治療的新方向。在本研究中，F(xiàn)GL1的表達(dá)與ESCC的不良預(yù)后相關(guān)，可能成為ESCC的預(yù)后生物標(biāo)志物。FGL1和TILs聯(lián)合評估可更好地預(yù)測ESCC的預(yù)后，為臨床治療提供新的思路，對研究下一代癌癥免疫療法具有重要的意義。