謝轉(zhuǎn)紅，許云鵬，馬琿敏，王祥

0 引言

結(jié)腸癌是結(jié)腸上皮來(lái)源的消化道惡性腫瘤，好發(fā)于直腸與乙狀結(jié)腸交界處，2020年全球結(jié)腸癌發(fā)病率和死亡率分別位居全部腫瘤的第四位和第五位[1]。雖然其篩查和治療手段迅速發(fā)展，但由于腫瘤轉(zhuǎn)移和治療耐藥，使晚期復(fù)發(fā)性、轉(zhuǎn)移性、難治性結(jié)腸癌患者的死亡率居高不下，5年生存率不超過17%[1]，因此，尋找更為有效的治療方案成為研究熱點(diǎn)。近年來(lái)，靶向藥物治療為結(jié)腸癌患者帶來(lái)了新的希望，現(xiàn)已研制出數(shù)種針對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體（vascular endothelial growth factor receptor,VEGFR）、血小板衍生生長(zhǎng)因子受體（platelet derived growth factor receptor,PDGFR）、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體（fibroblast growth factor receptor,FGFR）及c-Kit等靶點(diǎn)的酪氨酸激酶抑制劑（tyrosine kinase inhibitors,TKI）。安羅替尼（anlotinib）作為我國(guó)自主研發(fā)的小分子多靶點(diǎn)TKI，可抑制腫瘤血管生成和腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)及轉(zhuǎn)移[2-3]，因具有可控的不良反應(yīng)、較長(zhǎng)的半衰期及廣譜的抗腫瘤活性等特點(diǎn)[4]，現(xiàn)已被批準(zhǔn)用于非小細(xì)胞肺癌、小細(xì)胞肺癌、軟組織肉瘤的三線治療[5-8]。研究發(fā)現(xiàn)，安羅替尼在結(jié)腸癌治療中同樣安全有效[9-10]。與瑞戈非尼和呋喹替尼相比，安羅替尼不僅療效相當(dāng)，且不良反應(yīng)更小[11]。表明安羅替尼有望成為結(jié)腸癌患者的新選擇。

Tspan8是四跨膜蛋白超家族（transmembrane 4 super family,TM4SF）中的一員，對(duì)腫瘤細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為具有極其重要的影響。研究發(fā)現(xiàn)Tspan8主要高表達(dá)于消化系統(tǒng)惡性腫瘤，如結(jié)直腸癌中，其表達(dá)水平與腫瘤的轉(zhuǎn)移潛能呈正相關(guān)，而與患者的生存預(yù)后呈負(fù)相關(guān)[12-16]。提示Tspan8很有可能成為結(jié)腸癌治療的潛在靶點(diǎn)。

本實(shí)驗(yàn)以結(jié)腸癌SW480細(xì)胞為研究對(duì)象，探討安羅替尼聯(lián)合Tspan8敲除對(duì)SW480細(xì)胞增殖、遷移、侵襲和凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

人結(jié)腸癌SW480細(xì)胞、HEK293T細(xì)胞購(gòu)自ATCC公司。安羅替尼（10 mg）購(gòu)自江蘇正大天晴公司；高糖DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自上海源培公司；胰蛋白酶、青霉素-鏈霉素-慶大霉素混合溶液、結(jié)晶紫和MTT檢測(cè)試劑盒購(gòu)自北京Solarbio公司；FΒS購(gòu)自美國(guó)AΒW公司；DMSO購(gòu)自德國(guó)ΒioFroxx公司；Transwell小室購(gòu)自美國(guó)Corning公司；Matrigel基質(zhì)膠和FITC偶聯(lián)Annexin-V凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)ΒD公司；RIPA裂解液購(gòu)自上海雅酶公司；SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液購(gòu)自上海Βeyotime公司；多聚甲醛固定液和ΒCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒購(gòu)自上海Βiosharp公司；Anti-Tspan-8抗體購(gòu)自美國(guó)Abcam公司；β-TubulinMouse mAb購(gòu)自上海Abmart公司；Goat Anti-Rabbit IgG（H+L）購(gòu)自美國(guó)Proteintech公司；去內(nèi)毒素質(zhì)?？焖傩√嵩噭┖?、DNA凝膠回收試劑盒、Gibson無(wú)縫連接試劑盒均購(gòu)自蘭州華幟天成公司；限制性內(nèi)切酶ΒsmΒI購(gòu)自北京NEΒ有限公司；嘌呤霉素購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑盒購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；聚凝胺購(gòu)自上海經(jīng)科公司。

CO2恒溫培養(yǎng)箱、多功能連續(xù)光譜（Thermo Fisher）為美國(guó)Thermo Scientific Forma公司產(chǎn)品；倒置相差顯微鏡AE2000為廈門Motic公司產(chǎn)品；倒置熒光顯微鏡MF52為廣州明美光電公司產(chǎn)品；正置熒光顯微鏡ΒX53+DP74為日本奧林巴斯公司產(chǎn)品；醫(yī)用離心機(jī)80-2為蘇州新康醫(yī)療器械公司產(chǎn)品；高速冷凍型微量離心機(jī)D3024R為美國(guó)Scilogex公司產(chǎn)品；多功能酶標(biāo)儀SpectraMAX M2為上海Molecular Devices公司產(chǎn)品；流式細(xì)胞分析儀CytoFLEX為美國(guó)Βeckman公司產(chǎn)品；化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)JS-M6P為上海培清公司產(chǎn)品。全自動(dòng)凝膠成像分析系統(tǒng)ChampGel6000、迷你型化學(xué)發(fā)光熒光成像分析系統(tǒng)MiniChemi 610 plus為北京賽智公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

所有細(xì)胞均培養(yǎng)于37℃、5%CO2飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中。高糖DMEM培養(yǎng)基中添加10%FΒS和1%三抗配制成完全培養(yǎng)基。0.5%胰蛋白酶消化傳代。所有實(shí)驗(yàn)均采用對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞。

1.2.2 Tspan8基因敲除

1.2.2.1 Tspan8敲除質(zhì)粒的構(gòu)建 在NCΒI網(wǎng)站（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）查詢并拷貝Tspan8的基因序列（Gene ID: 7103），使用規(guī)律呈簇的間隔短回文重復(fù)/CRISPR相關(guān)核酸酶9（clustered regularly interspaced short palindromic repeat/CRISPR-associated nuclease 9,CRISPR/Cas9）在線設(shè)計(jì)工具網(wǎng)站（http://crispr.mit.edu），設(shè)計(jì)針對(duì)Tspan8的3個(gè)單向?qū)NA（single guide RNA,sgRNA）序列，見表1。根據(jù)sgRNA序列，得到三對(duì)單鏈sgRNA引物，見表2。將其退火形成二聚體，通過Gibson無(wú)縫連接試劑盒與經(jīng)限制性內(nèi)切酶ΒsmΒⅠ酶切的lenti-CRISPR v2載體連接。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到stbl3感受態(tài)細(xì)胞中，經(jīng)氨芐青霉素抗性平板篩選，提取質(zhì)粒后進(jìn)行單克隆測(cè)序。

表1 針對(duì)Tspan8的三條sgRNA序列Table 1 Three sgRNA sequences targeting Tspan8

1.2.2.2 Tspan8慢病毒的制備 取HEK293T細(xì)胞接種于培養(yǎng)皿，按照LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑盒說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染，36 h后離心取上清液備用。

1.2.2.3 Tspan8基因敲除細(xì)胞株的構(gòu)建 取SW480細(xì)胞接種于6孔板，加入1 ml的慢病毒毒液和2 μl的聚凝胺（8 mg/ml），48 h后用嘌呤霉素（2 μg/ml）篩選，7 d后收集細(xì)胞，提取蛋白進(jìn)行敲除效果驗(yàn)證。

1.2.2.4 Western blot法檢測(cè)Tspan8基因敲除效果 收集待測(cè)細(xì)胞，加入RIPA裂解液冰上裂解，12000 r/min，4℃離心15 min，取少量上清液，按照說明書進(jìn)行各組蛋白濃度測(cè)定。配置10%SDSPAGE電泳，PVDF膜進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，5%脫脂牛奶封閉，TΒST洗膜，一抗（Anti-Tspan-8抗體、β-TubulinMouse mAb）4℃孵育過夜，次日加入二抗（Goat Anti-Rabbit IgG（H+L））室溫孵育1 h，TΒST洗膜，涂勻ECL發(fā)光液，并用JS-M6P化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)進(jìn)行顯影。Image J軟件分析各蛋白條帶的灰度值，Tspan8表達(dá)水平=Tspan8條帶灰度值/內(nèi)參條帶灰度值。

1.2.3IC50的測(cè)定

取SW480細(xì)胞，以5×104個(gè)/孔接種于96孔板，貼壁后用安羅替尼（0、0.25、0.5、1、2、4、8、16、32、64和128 μmol/L）處理（24、48和72 h），每孔加入20 μl MTT（5 mg/ml）孵育4 h，150 μl DMSO震蕩15 min，在570 nm波長(zhǎng)的多功能酶標(biāo)儀中測(cè)量各孔的光密度（optical density,OD）值，并計(jì)算半數(shù)抑制濃度（half maximal inhibitory concentration,IC50）。細(xì)胞增殖抑制率（%）=[（1-OD值實(shí)驗(yàn)組）/OD值對(duì)照組]×100%，每組設(shè)置5個(gè)復(fù)孔。

1.2.4 實(shí)驗(yàn)分組

對(duì)照組（SW480細(xì)胞用完全培養(yǎng)基培養(yǎng)）、安羅替尼組（SW480細(xì)胞用14 μmol/L安羅替尼處理）、Tspan8敲除組（SW480-KO-Ⅲ細(xì)胞用完全培養(yǎng)基培養(yǎng)）和聯(lián)合組（SW480-KO-Ⅲ細(xì)胞用14 μmol/L安羅替尼處理）。

1.2.5 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖能力

細(xì)胞以5×104個(gè)/孔接種于96孔板，貼壁后根據(jù)實(shí)驗(yàn)分組進(jìn)行處理，采用MTT法測(cè)定0、1、2、3和4 d各組OD值，并繪制生長(zhǎng)曲線，每組設(shè)置5個(gè)復(fù)孔。

1.2.6 克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞成活能力

細(xì)胞以2.5×106個(gè)/孔接種于6孔板，貼壁后根據(jù)實(shí)驗(yàn)分組處理24 h，后消化重懸細(xì)胞并以1×103個(gè)/孔接種于新的6孔板孵育，直至出現(xiàn)肉眼可見的細(xì)胞集落時(shí)終止培養(yǎng)，每孔加入4%多聚甲醛固定液1.5 ml固定30 min，0.1%結(jié)晶紫1.5 ml染色30 min后洗滌、風(fēng)干、拍照，并對(duì)50個(gè)細(xì)胞以上的細(xì)胞集落進(jìn)行計(jì)數(shù)，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。

1.2.7 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移能力

細(xì)胞以1×106個(gè)/孔接種于6孔板，貼壁后用200 μl槍頭進(jìn)行劃痕，根據(jù)實(shí)驗(yàn)分組處理細(xì)胞0、24和48 h，并用倒置熒光顯微鏡（×100倍鏡）觀察和拍攝，Image J軟件測(cè)定劃痕寬度，并計(jì)算細(xì)胞劃痕遷移率。細(xì)胞劃痕遷移率=[（0 h的劃痕寬度-24或48 h的劃痕寬度）/0 h的劃痕寬度]×100%。各組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。

1.2.8 Transwell小室法檢測(cè)細(xì)胞遷移和侵襲能力

根據(jù)實(shí)驗(yàn)分組制備單細(xì)胞懸液（均不含F(xiàn)ΒS），以8×105個(gè)/孔接種到上室，下室加入600 μl含15%FΒS的完全培養(yǎng)基，48 h后用棉簽擦去上室殘留細(xì)胞，4%多聚甲醛固定液600 μl固定30 min，0.1%結(jié)晶紫600 μl染色30 min后洗滌、風(fēng)干，在正置熒光顯微鏡（×100倍鏡）隨機(jī)選取5個(gè)視野觀察細(xì)胞形態(tài)并計(jì)數(shù)。

Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)：提前將Matrigel基質(zhì)膠從-20℃冰箱取至4℃冰箱備用，于冰上用高糖DMEM培養(yǎng)基以1:50比例配制成稀釋液，取100 μl稀釋液包被到上室底面，待基質(zhì)膠凝固后，制備單細(xì)胞懸液并以1.6×106個(gè)/孔接種于上室，后續(xù)操作同上述Transwell遷移實(shí)驗(yàn)。

1.2.9 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡水平

細(xì)胞以2.5×106個(gè)/孔接種于6孔板，貼壁后根據(jù)實(shí)驗(yàn)分組處理48 h，按照FITC偶聯(lián)Annexin-V凋亡檢測(cè)試劑盒說明書進(jìn)行操作，并于1 h內(nèi)上機(jī)檢測(cè)。

1.2.10 Western blot法檢測(cè)安羅替尼對(duì)SW480細(xì)胞Tspan8表達(dá)水平的影響

取SW480細(xì)胞，以2.5×106個(gè)/孔接種到6孔板中，貼壁后分別加入安羅替尼（14 μmol/L）和完全培養(yǎng)基，48 h后檢測(cè)Tspan8的表達(dá)水平，方法同1.2.2.4。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用Image J軟件進(jìn)行圖像分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示；采用SPSS25.0和GraphPad Prism 8軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析；多組比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Tspan8敲除質(zhì)粒的構(gòu)建

挑選轉(zhuǎn)染成功的耐藥陽(yáng)性克隆菌株，菌液PCR鑒定后擴(kuò)大培養(yǎng)，提取陽(yáng)性單克隆質(zhì)粒lentil CRISPR-sgTspan8-Ⅰ、lentil CRISPR-sgTspan8-Ⅱ和lentil CRISPR-sgTspan8-Ⅲ進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果見圖1。說明3條目的Tspan8 sgRNA序列分別已經(jīng)正確插入載體，證明用于Tspan8基因敲除的3個(gè)重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。

圖1 三種Tspan8敲除質(zhì)粒的序列比對(duì)圖及測(cè)序峰圖Figure 1 Sequence alignment and sequencing peaks of three Tspan8 knockout plasmids

2.2 Tspan8穩(wěn)定敲除結(jié)腸癌SW480細(xì)胞珠的篩選

Western blot結(jié)果顯示，結(jié)腸癌SW480-WT、SW480-KO-Ⅰ、SW480-KO-Ⅱ和SW480-KO-Ⅲ細(xì)胞中Tspan8的表達(dá)水平分別為0.89±0.06、0.78±0.02、0.42±0.04和0.17±0.03。與SW480-WT、SW480-KO-Ⅰ、SW480-KO-Ⅱ細(xì)胞相比，SW480-KO-Ⅲ細(xì)胞中Tspan8的表達(dá)量顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），見圖2。因此選擇敲除效率最高的結(jié)腸癌SW480-KO-Ⅲ細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖2 Western blot法檢測(cè)慢病毒感染結(jié)腸癌SW480細(xì)胞后Tspan8的表達(dá)Figure 2 Western blot was used to detect Tspan8 expression in colon cancer SW480 cells infected with lentivirus

2.3 MTT法檢測(cè)各組細(xì)胞的增殖能力

MTT法結(jié)果顯示，與0 μmol/L組比較，不同濃度的安羅替尼均能抑制結(jié)腸癌SW480細(xì)胞的增殖（均P＜0.01），細(xì)胞增殖抑制率呈濃度-時(shí)間依賴性，見圖3。安羅替尼對(duì)結(jié)腸癌SW480細(xì)胞24、48和72 h的IC50值分別為25.24±6.16、14.41±3.58和8.41±1.97 μmol/L。因后續(xù)實(shí)驗(yàn)時(shí)間需要觀察48 h，故而選擇14 μmol/L為實(shí)驗(yàn)濃度。

圖3 不同濃度和不同時(shí)間安羅替尼作用后對(duì)結(jié)腸癌SW480細(xì)胞抑制率Figure 3 Inhibitory rate of colon cancer SW480 cells treated with different anlotinib concentrations at different times

進(jìn)一步檢測(cè)各組結(jié)腸癌細(xì)胞在不同時(shí)間（0、1、2、3和4 d）的增殖能力發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，安羅替尼組、Tspan8敲除組和聯(lián)合組在1、2、3和4 d的細(xì)胞增殖速度明顯下降（P＜0.01）；且聯(lián)合組細(xì)胞在2、3和4 d的增殖速度明顯低于安羅替尼組（P＜0.01），但在1 d時(shí)兩組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），而聯(lián)合組細(xì)胞的增殖速度整體低于Tspan8敲除組，但除了在1 d和2 d時(shí)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義以外（P＜0.01），3 d和4 d兩組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見圖4。

圖4 各組結(jié)腸癌SW480細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線Figure 4 Growth curves of colon cancer SW480 cells in each group

2.4 克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組細(xì)胞貼壁后的成活能力

克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，對(duì)照組、安羅替尼組、Tspan8敲除組和聯(lián)合組的克隆形成數(shù)分別為84.33±7.23、47.33±15.04、10.00±6.08和1.33±0.58。與對(duì)照組相比，安羅替尼組、Tspan8敲除組和聯(lián)合組的克隆形成數(shù)目明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），且聯(lián)合組的克隆形成數(shù)目整體少于安羅替尼組（P＜0.01）和Tspan8敲除組（P＞0.05），見圖5。結(jié)果表明安羅替尼聯(lián)合Tspan8敲除對(duì)結(jié)腸癌SW480細(xì)胞的克隆形成能力具有明顯抑制作用。

圖5 各組克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果Figure 5 Results of clonal formation experiment in each group

2.5 劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell小室遷移法檢測(cè)各組細(xì)胞的遷移能力

對(duì)照組、安羅替尼組、Tspan8敲除組和聯(lián)合組的24 h細(xì)胞劃痕遷移率分別為（20.92±8.30）%、（13.76±5.77）%、（8.62±1.97）%和（7.47±3.82）%；48 h細(xì)胞劃痕遷移率分別為（48.40±11.98）%、（20.39±5.17）%、（15.94±3.27）%和（13.01±4.85）%。與對(duì)照組相比，安羅替尼組、Tspan8敲除組和聯(lián)合組24 h和48 h的細(xì)胞劃痕遷移率均明顯減小，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。且聯(lián)合組24 h和48 h的細(xì)胞劃痕遷移率明顯低于安羅替尼組（P＜0.01）和Tspan8敲除組（P＜0.01），見圖6。結(jié)果表明安羅替尼聯(lián)合Tspan8敲除對(duì)結(jié)腸癌SW480細(xì)胞的遷移能力具有明顯抑制作用。

圖6 各組劃痕修復(fù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果Figure 6 Results of scratch repair experiment in each group

對(duì)照組、安羅替尼組、Tspan8敲除組和聯(lián)合組的遷移細(xì)胞數(shù)分別為72.00±13.07、60.04±15.27、45.33±8.47和21.09±7.25個(gè)。與對(duì)照組相比，安羅替尼組、Tspan8敲除組和聯(lián)合組的遷移細(xì)胞數(shù)明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），且聯(lián)合組的遷移細(xì)胞數(shù)明顯少于安羅替尼組（P＜0.01）和Tspan8敲除組（P＜0.01），見圖7。結(jié)果表明安羅替尼聯(lián)合Tspan8敲除對(duì)結(jié)腸癌SW480細(xì)胞的遷移能力具有明顯抑制作用。

圖7 各組Transwell小室遷移結(jié)果Figure 7 Results of Transwell compartment migration in each group

2.6 Transwell小室侵襲法檢測(cè)各組細(xì)胞的侵襲能力

對(duì)照組、安羅替尼組、Tspan8敲除組和聯(lián)合組的侵襲細(xì)胞數(shù)分別為52.14±8.35、24.07±4.36、21.26±6.43和14.31±4.33個(gè)。與對(duì)照組相比，安羅替尼組、Tspan8敲除組和聯(lián)合組的侵襲細(xì)胞數(shù)明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），且聯(lián)合組的侵襲細(xì)胞數(shù)明顯少于安羅替尼組（P＜0.01）和Tspan8敲除組（P＜0.01），見圖8。結(jié)果表明安羅替尼聯(lián)合Tspan8敲除對(duì)結(jié)腸癌SW480細(xì)胞的侵襲能力具有明顯抑制作用。

圖8 各組Transwell小室侵襲結(jié)果Figure 8 Results of Transwell compartment invasion in each group

2.7 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組細(xì)胞的凋亡水平

對(duì)照組、安羅替尼組、Tspan8敲除組和聯(lián)合組細(xì)胞的早期凋亡率分別為（2.42±0.96）%、（6.48±1.51）%、（7.48±0.35）%和（17.78±3.00）%。與對(duì)照組相比，安羅替尼組、Tspan8敲除組和聯(lián)合組細(xì)胞的早期凋亡率明顯提高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），且聯(lián)合組的早期凋亡率明顯高于安羅替尼組（P＜0.01）和Tspan8敲除組（P＜0.01），見圖9。結(jié)果表明安羅替尼聯(lián)合Tspan8敲除能夠明顯促進(jìn)結(jié)腸癌SW480細(xì)胞發(fā)生凋亡。

圖9 各組流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果Figure 9 Results of flow cytometry in each group

2.8 安羅替尼對(duì)SW480細(xì)胞Tspan8表達(dá)水平的影響

對(duì)照組和安羅替尼組結(jié)腸癌SW480細(xì)胞中Tspan8蛋白的表達(dá)水平分別為0.92±0.01和0.49±0.15。與對(duì)照組相比，安羅替尼組Tspan8蛋白的表達(dá)量顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），見圖10。結(jié)果表明安羅替尼作用后可明顯抑制結(jié)腸癌SW480細(xì)胞中Tspan8的表達(dá)。

圖10 Western blot法檢測(cè)對(duì)照組和安羅替尼組SW480細(xì)胞中Tspan8的表達(dá)水平Figure 10 Western blot was used to detect the expression of Tspan8 in SW480 cells of control group and anlotinib group

3 討論

結(jié)腸癌的臨床表現(xiàn)不典型，大多數(shù)病例被發(fā)現(xiàn)時(shí)已處于中晚期。目前結(jié)腸癌臨床治療采取多學(xué)科綜合治療模式，強(qiáng)調(diào)個(gè)體化原則，中晚期以手術(shù)為主，輔以放化療、靶向治療等[17-18]。然而由于手術(shù)效果不滿意、放化療敏感度差等因素，導(dǎo)致結(jié)腸癌患者的預(yù)后較差，嚴(yán)重危害著人類健康。因此，尋找更為有效的治療方案迫在眉睫。

研究發(fā)現(xiàn)，安羅替尼可通過作用于VEGFR、PDGFR、FGFR、c-Kit等靶點(diǎn)，阻斷PI3K/AKT、AKT/ERK、EGFR/MET/AΒCΒ1以及VEGFR/JAK2/STAT3等信號(hào)通路，抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲和血管生成，并誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡，從而發(fā)揮抗增殖、抗轉(zhuǎn)移、抗血管生成以及抗多重耐藥等作用[19-22]。Tspan8作為腫瘤相關(guān)抗原，在腫瘤組織和腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)水平明顯高于正常組織和正常細(xì)胞，上調(diào)Tspan8的表達(dá)可明顯增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移、放化療抵抗，而外源性沉默Tspan8的表達(dá)，可顯著抑制腫瘤細(xì)胞的增殖生長(zhǎng)、遷移侵襲，并增加腫瘤細(xì)胞對(duì)放化療的敏感度。以上作用主要與MAPK/ERK/MEK、AKT/ERK、PI3K/AKT以及MAPK/AKT等信號(hào)通路相關(guān)[23-27]。根據(jù)上述研究結(jié)果，安羅替尼和Tspan8敲除均具有顯著的抗腫瘤作用，且通過相似信號(hào)通路產(chǎn)生影響。所以我們猜想，安羅替尼與Tspan8敲除兩者聯(lián)合可能具有協(xié)同抑制腫瘤細(xì)胞活性的能力，但目前尚無(wú)相關(guān)研究數(shù)據(jù)支持。因而，本實(shí)驗(yàn)探究了安羅替尼與Tspan8敲除聯(lián)合作用對(duì)結(jié)腸癌SW480細(xì)胞惡性生物學(xué)行為的影響，結(jié)果顯示，與對(duì)照組比，安羅替尼或Tspan8敲除均能夠明顯抑制結(jié)腸癌SW480細(xì)胞的增殖、克隆形成、遷移、侵襲能力，誘導(dǎo)結(jié)腸癌SW480細(xì)胞發(fā)生凋亡，且兩者聯(lián)合時(shí)上述作用更強(qiáng)。此外，與安羅替尼單獨(dú)作用相比，聯(lián)合組細(xì)胞的早期凋亡率明顯提高，細(xì)胞增殖速度、克隆形成數(shù)目、劃痕愈合率和Transwell遷移及侵襲數(shù)目顯著減小。而與Tspan8敲除單獨(dú)作用相比，聯(lián)合組細(xì)胞僅在早期凋亡、劃痕愈合、Transwell遷移和侵襲方面的差異明顯，而在細(xì)胞增殖方面，如生長(zhǎng)曲線和克隆形成，雖然聯(lián)合組的總體水平低下，但兩者差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這可能與Tspan8敲除明顯抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖有關(guān)。

本研究還發(fā)現(xiàn)，與安羅替尼單獨(dú)作用相比，Tspan8敲除組的結(jié)腸癌SW480細(xì)胞在增殖、克隆形成、遷移侵襲方面的整體水平較低，而凋亡水平略高。結(jié)合安羅替尼作用后，能夠明顯降低結(jié)腸癌SW480細(xì)胞中Tspan8的表達(dá)水平。故推測(cè)Tspan8的表達(dá)可能受到安羅替尼的影響。根據(jù)現(xiàn)有研究證據(jù)，Tspan8的轉(zhuǎn)錄與ERK/MEK信號(hào)通路的激活有關(guān)[28]，而安羅替尼可通過抑制ERK/MEK信號(hào)通路發(fā)揮抑癌作用。所以此表型很有可能與ERK/MEK信號(hào)通路相關(guān)。

結(jié)合上述結(jié)果，我們推測(cè)安羅替尼聯(lián)合Tspan8敲除主要通過抑制ERK/MEK信號(hào)通路發(fā)揮協(xié)同抗結(jié)腸癌作用，且安羅替尼也可通過抑制ERK/MEK通路影響Tspan8的表達(dá)，具體機(jī)制尚待進(jìn)一步研究證實(shí)。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)不僅首次證明了安羅替尼聯(lián)合Tspan8敲除具有協(xié)同抑制結(jié)腸癌SW480增殖轉(zhuǎn)移的作用，而且還首次發(fā)現(xiàn)了安羅替尼可明顯降低結(jié)腸癌SW480細(xì)胞中Tspan8的表達(dá)水平，同時(shí)探討了其可能相關(guān)的機(jī)制。后續(xù)本課題組將進(jìn)行安羅替尼聯(lián)合Tspan8敲除在結(jié)腸癌SW480細(xì)胞中具體機(jī)制、信號(hào)通路及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方面的研究，以期為結(jié)腸癌臨床治療提供一個(gè)新的思路。