陳宇，宋紫燁，高陽，蔡紅兵

0 引言

宮頸癌是全球女性第四大惡性腫瘤，其中85%的病例發(fā)生在發(fā)展中國(guó)家，盡管實(shí)施了有效的篩查和疫苗接種計(jì)劃，其總發(fā)病率有所下降，但在這些國(guó)家，宮頸癌的發(fā)病率和死亡率仍然較高，且宮頸癌是女性癌癥死亡的主要原因之一[1-2]。大多數(shù)早期宮頸癌通過手術(shù)切除治愈，對(duì)于局部晚期宮頸癌，同步放化療是首選的治療方法[3-4]。然而，30%的局部晚期宮頸癌患者在根治性同步放化療后仍會(huì)出現(xiàn)復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移[5-6]。因此，需更深入的研究揭示新的治療靶點(diǎn)。上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化序列2（epithelial cell transformation sequence 2,ECT2）是人類ECT2基因編碼的鳥嘌呤核苷酸交換因子，與癌癥的發(fā)生直接相關(guān)[7]，在非小細(xì)胞肺癌、乳腺癌和結(jié)直腸癌等多種腫瘤中發(fā)揮促癌作用[7-9]。ECT2對(duì)宮頸癌的影響目前尚不清楚，因此，本研究擬觀察ECT2對(duì)人宮頸癌細(xì)胞增殖的影響，并探究其機(jī)制，以期為ECT2基因作為宮頸癌治療的新靶點(diǎn)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

人宮頸癌細(xì)胞系C33A、SiHa和HeLa（湖北省腫瘤生物學(xué)行為研究所細(xì)胞庫(kù)提供），DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清（美國(guó)Hyclone公司），細(xì)胞轉(zhuǎn)染試劑Lipo2000（南京諾維贊生物公司），qPCR引物（北京擎科生物科技有限公司），ECT2干擾質(zhì)粒siRNA和陰性對(duì)照質(zhì)粒（上海吉瑪制藥有限公司），ECT2過表達(dá)慢病毒及空載病毒（廣州Gene-Copoeia生物公司），Anti-GAPDH、Anti-CDK1、Anti-CyclinΒ1、羊抗兔、羊抗鼠二抗和兔抗羊二抗（武漢三鷹技術(shù)有限公司），Anti-ECT2、Anti-Cdc42和Anti-Rac1（美國(guó)Abcam公司），細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒（上海碧云天公司），倒置相差顯微鏡和熒光顯微鏡（日本奧林巴斯公司），化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)（美國(guó)Βio-Rad公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 將C33A、SiHa和HeLa用含10%FΒS的DMEM完全培養(yǎng)基置于5%CO2、37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)。將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HeLa細(xì)胞按1×105個(gè)/孔接種于24孔板內(nèi)，用ECT2過表達(dá)慢病毒轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞，用2 μg/ml的嘌呤霉素進(jìn)行篩選構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)實(shí)驗(yàn)組（HeLa-ECT2組），用空載體慢病毒轉(zhuǎn)染構(gòu)建陰性對(duì)照組（HeLa-NC組）。將C33a和SiHa細(xì)胞按4×105個(gè)/孔接種于六孔板內(nèi)，用ECT2 siRNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞，構(gòu)建實(shí)驗(yàn)組（SiHa-siRNA組和C33a-siRNA組），用陰性對(duì)照質(zhì)粒構(gòu)建陰性對(duì)照組（SiHa-NC組和C33a-NC組）。

1.2.2 MTT實(shí)驗(yàn) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的各組細(xì)胞接種于96孔板中，加入10 μl MTT試劑，置于恒溫培養(yǎng)箱繼續(xù)孵育4 h，棄上清液，每孔加入150 μl DMSO置搖床上低速振蕩10 min，充分溶解結(jié)晶，用酶標(biāo)儀測(cè)量490 nm波長(zhǎng)處的吸光度值。

1.2.3 流式細(xì)胞術(shù) 用不含EDTA的胰酶消化離心收集細(xì)胞至1.5 ml EP管中，無水乙醇固定過夜，1000 r/min離心5 min，利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)碘化丙啶（PI）染色后的細(xì)胞懸液。

1.2.4 細(xì)胞免疫熒光 取各組細(xì)胞單細(xì)胞懸液于蓋玻片上，4%的多聚甲醛固定，細(xì)胞膜穿孔后，加入山羊血清封閉，加入羊抗人ECT2抗體（1:500）、兔抗人CDK1抗體（1:100），4℃孵育過夜，加入熒光標(biāo)記的二抗（1:100）于37℃孵育1 h，加入DAPI染色，最后用熒光顯微鏡觀察。

1.2.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 提取細(xì)胞RNA，用RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)。GAPDH上游引物序列為：5’-CTGTTCG ACAGTCAGCCGCATC-3’，下游引物序列為：5’-GCGCCCAATACGACCAAATCCG-3’；ECT2上游引物序列為：5’-TGTAGTCACGGACTTTC AGGA-3’，下游引物序列為：5’-GTACAATAC AACGGGCGACAT-3’；Rac1上游引物序列為：5’-ATGTCCGTGCAAAGTGGTATC-3’，下游引物序列為：5’-CTCGGATCGCTTCGTCAAACA-3’；Cdc42上游引物序列為：5’-CCATCGGAATATGTA CCGACTG-3’，下游引物序列為：5’-CTCAGCGG TCGTAATCTGTCA-3’；CDK1上游引物序列為：5’-TTGGGGACATTGGTAACAAAGTC-3’，下游引物序列為：5’-ATAGGCTCAGGCGAAAGTTT TT-3’；CyclinΒ1上游引物序列為：5’-TTGGGGA CATTGGTAACAAAGTC-3’，下游引物序列為：5’-ATAGGCTCAGGCGAAAGTTTTT-3’。

1.2.6 Western blot實(shí)驗(yàn) 提取各組細(xì)胞總蛋白，利用ΒCA法進(jìn)行蛋白定量，在制好的凝膠板孔中進(jìn)行電泳，而后依次轉(zhuǎn)膜、5%脫脂牛奶封閉，分別用羊抗人ECT2抗體（1:1500）、兔抗人CDK1、Cdc42、CyclinΒ1抗體（1:2000）和鼠抗人GAPDH、Rac1抗體（1:2000）4℃孵育過夜，室溫下二抗（1:5000）孵育2 h，最后利用化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)進(jìn)行ECL顯影。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

用GraphPadPrism9.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ECT2敲降和過表達(dá)效率

在宮頸癌細(xì)胞中轉(zhuǎn)染siRNA或過表達(dá)ECT2后，用qPCR檢測(cè)ECT2在宮頸癌細(xì)胞中敲降和過表達(dá)效率，結(jié)果表明ECT2在C33a和SiHa細(xì)胞的干擾效率分別為70%（P＜0.001）和50%（P＜0.0001），在HeLa細(xì)胞中過表達(dá)ECT2后，ECT2的表達(dá)量為陰性對(duì)照組的2倍（P＜0.0001），見圖1。

圖1 qPCR檢測(cè)ECT2敲降(A,Β)和過表達(dá)(C)效率Figure 1 Construction of ECT2 knockdown(A,Β) or overexpression(C) of cervical cancer cell lines detected by qPCR

2.2 ECT2對(duì)宮頸癌細(xì)胞增殖的影響

MTT檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，SiHa-siRNA組細(xì)胞增殖速度顯著低于SiHa-NC組（P＜0.001），見圖2A，C33a-siRNA組細(xì)胞增殖速度顯著低于C33a-NC組（P＜0.001），見圖2Β，敲低ECT2細(xì)胞增殖速度減慢，說明ECT2促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞增殖。

圖2 MTT法檢測(cè)ECT2對(duì)宮頸癌SiHa細(xì)胞(A)和C33a細(xì)胞(Β)增殖的影響Figure 2 Effect of ECT2 on viability of SiHa(A) and C33a(Β) cell lines detected by MTT method

2.3 ECT2對(duì)宮頸癌細(xì)胞周期的影響

流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果提示，與SiHa-NC組細(xì)胞相比，SiHa-siRNA組細(xì)胞G2/M期細(xì)胞比例上升而G1期細(xì)胞比例下降，見圖3A；與C33a-NC組細(xì)胞相比，C33a-siRNA組細(xì)胞G2/M期細(xì)胞比例上升而G1期細(xì)胞比例顯著下降，見圖3Β；與陰性對(duì)照組相比，HeLa-ECT2組細(xì)胞更多的由G2/M期進(jìn)入G1期，見圖3C。因此可知，ECT2可通過調(diào)控G2/M期向G1期轉(zhuǎn)化來調(diào)控細(xì)胞增殖。

圖3 ECT2對(duì)宮頸癌細(xì)胞周期的影響Figure 3 Effect of ECT2 on cell cycle of cervical cancer cells

2.4 ECT2與CDK1的關(guān)系

通過生物信息學(xué)通路分析軟件（Ingenuity Pathway Analysis,IPA），我們發(fā)現(xiàn)ECT2可能與周期蛋白依賴性激酶1（cyclin dependent kinase 1,CDK1）存在相互作用。進(jìn)一步的細(xì)胞免疫熒光結(jié)果顯示見圖4A、Β，CDK1（綠色）與ECT2（紅色）共定位，融合色為黃色，ECT2主要分布于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核。敲降ECT2后，核內(nèi)標(biāo)記ECT2和CDK1蛋白的熒光強(qiáng)度均出現(xiàn)下降。而CDK1和磷酸化細(xì)胞周期蛋白Β1（CyclinΒ1）共同調(diào)節(jié)細(xì)胞周期G2/M期，qPCR及Western blot結(jié)果顯示，敲降ECT2后CDK1、CyclinΒ1的mRNA及蛋白表達(dá)水平顯著降低，見圖4C、D。

圖4 ECT2與CDK1的關(guān)系Figure 4 Relationship between ECT2 and CDK1

2.5 ECT2對(duì)Rac1、Cdc42的mRNA及蛋白水平的影響

為研究ECT2是否通過作用于下游Rho GTP酶調(diào)控宮頸癌細(xì)胞的增殖，我們?cè)趯m頸癌細(xì)胞中敲降及過表達(dá)ECT2后，檢測(cè)了Rho GTP酶Rac1和Cdc42 mRNA及蛋白水平的變化，qPCR及Western blot結(jié)果顯示，SiHa和C33a細(xì)胞敲降ECT2后，Rac1、Cdc42 mRNA及蛋白水平均較對(duì)照組顯著降低，見圖5A～Β，而HeLa細(xì)胞過表達(dá)ECT2后，Rac1、Cdc42 mRNA及蛋白水平均較對(duì)照組顯著增加，見圖5C。

圖5 ECT2對(duì)Rac1、Cdc42 mRNA及蛋白表達(dá)的影響Figure 5 Effect of ECT2 on Rac1 and Cdc42 mRNA and protein expression

3 討論

ECT2在肺癌、乳腺癌、胃癌和胰腺癌等腫瘤中發(fā)揮原癌基因的功能[10-13]，其機(jī)制主要通過激活RhoA-ERK信號(hào)通路，促進(jìn)VEGF和MMP9的表達(dá)，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲、遷移，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤的發(fā)展[14]。此外，ECT2還通過增強(qiáng)有氧糖酵解和抑制NK細(xì)胞和T細(xì)胞的功能促進(jìn)M2巨噬細(xì)胞的極化[15]。本研究發(fā)現(xiàn)，敲降ECT2后，宮頸癌細(xì)胞增殖速度降低，且伴隨G2期阻滯；而過表達(dá)ECT2后，宮頸癌細(xì)胞增殖速度增加，同時(shí)更多細(xì)胞從G2/M轉(zhuǎn)化為G1期。上述結(jié)果提示了ECT2可能作為促癌基因促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞增殖。

ECT2定位于癌細(xì)胞的細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中，且其致癌能力與Rac1活化相關(guān)[16-17]。ECT2通過激活RAC靶向RhoA來調(diào)節(jié)細(xì)胞的分裂，在細(xì)胞分裂間期，ECT2/Cdc42通路控制著絲粒處組蛋白變體CENP-A的摻入，而ECT2/Rac1可以促進(jìn)核糖體DNA（rDNA）轉(zhuǎn)錄[18]。位于非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）細(xì)胞核仁的大量ECT2，與核糖體DNA啟動(dòng)子區(qū)域上的轉(zhuǎn)錄因子上游結(jié)合因子1（UΒF1）結(jié)合，募集并激活小GTP酶Rac1到rDNA，這反過來刺激活性Rac1與核磷蛋白（NPM）的結(jié)合，以驅(qū)動(dòng)rDNA轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)和體內(nèi)肺腫瘤形成[17,19]。有研究發(fā)現(xiàn)，同為鳥嘌呤核苷酸交換因子的鳥嘌呤核苷酸交換因子T可以通過激活Rac1/Cdc42通路抑制橫紋肌肉瘤細(xì)胞的凋亡并加速橫紋肌肉瘤的生長(zhǎng)和肺轉(zhuǎn)移[20]。本研究發(fā)現(xiàn)，敲降/過表達(dá)ECT2后，Rac1/Cdc42通路核心基因Rac1、Cdc42的mRNA及蛋白水平發(fā)生降低/增加，提示ECT2可能通過調(diào)控Rac1/Cdc42信號(hào)通路進(jìn)而調(diào)控細(xì)胞周期。另一方面，ECT2可能通過與CDK1的蛋白互作實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞周期的調(diào)控。CyclinΒ1及其催化伙伴CDK1是調(diào)節(jié)細(xì)胞從G2期到有絲分裂進(jìn)程的基本激酶，CyclinΒ1/CDK1磷酸化決定了細(xì)胞是否能進(jìn)入有絲分裂，其特征是核膜破裂、紡錘體形成和染色質(zhì)凝聚[21]。CyclinΒ1/CDK1復(fù)合物是G2/M期DNA損傷檢查點(diǎn)的重要調(diào)節(jié)劑，華蟾素和高三尖杉酯堿通過負(fù)調(diào)節(jié)CDK1/CyclinΒ1復(fù)合物使細(xì)胞周期停滯在G2/M期來抑制惡性黑色素瘤細(xì)胞增殖[22-23]。本研究發(fā)現(xiàn)，在宮頸癌細(xì)胞中敲降ECT2可以使CDK1和CyclinΒ1的表達(dá)降低，過表達(dá)ECT2使Rac1、Cdc42 mRNA及蛋白表達(dá)顯著增加，說明ECT2可能通過正向調(diào)節(jié)CDK1/CyclinΒ1調(diào)控G2/M期向G1期轉(zhuǎn)化，促進(jìn)細(xì)胞增殖。

綜上所述，ECT2作為促癌基因促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化，可能通過下游Cdc42/Rac1信號(hào)通路，同時(shí)與CDK1在宮頸癌細(xì)胞內(nèi)共定位調(diào)控細(xì)胞周期（G2/M期），促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞增殖。ECT2基因可能在宮頸癌靶向治療中具有一定的臨床價(jià)值。