白銀陽(yáng)，熊 芳，張 昀，汪 敏，陳 潔

(無(wú)錫市婦幼保健院生殖醫(yī)學(xué)中心，無(wú)錫 214002)

在人類(lèi)輔助生殖技術(shù)中，卵母細(xì)胞給予胞漿內(nèi)精子注射(intracytoplasmic sperm injection,ICSI)后仍存在受精失敗、胚胎卵裂率低、胚胎發(fā)育阻滯等問(wèn)題，這主要與卵母細(xì)胞的激活失敗密切相關(guān)[1-2]。細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Ca2+大量釋放(即鈣震蕩)是激活卵母細(xì)胞的關(guān)鍵[3]。對(duì)于激活失敗的卵母細(xì)胞,外源性補(bǔ)充Ca2+載體能提高受精率，促進(jìn)胚胎卵裂和囊胚形成[4-7]。既往研究多將Ca2+載體應(yīng)用于ICSI受精失敗的患者。然而臨床上有部分ICSI助孕患者，即使能正常受精，胚胎卵裂過(guò)程中仍出現(xiàn)發(fā)育緩慢甚至阻滯、無(wú)可移植胚胎的問(wèn)題。目前關(guān)于Ca2+載體在這類(lèi)患者中應(yīng)用的研究較少。本研究募集行ICSI助孕中出現(xiàn)胚胎發(fā)育緩慢或阻滯，囊胚形成率低的患者60例，再次ICSI助孕時(shí)卵母細(xì)胞給予Ca2+載體A23817進(jìn)行激活，觀(guān)察A23817對(duì)患者的受精率、胚胎卵裂率、囊胚形成率以及妊娠結(jié)局的影響。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象 募集2019年1月至2021年7月于無(wú)錫市婦幼保健院生殖醫(yī)學(xué)中心行ICSI助孕治療的患者60例，再次ICSI助孕時(shí)，卵母細(xì)胞給予Ca2+載體A23817進(jìn)行激活，進(jìn)行前后兩周期的自身對(duì)照研究。入選標(biāo)準(zhǔn)：(1)女方年齡22～36歲；(2)不孕原因?yàn)槟蟹絿?yán)重少弱精子癥或梗阻性無(wú)精子癥；(3)已行ICSI助孕治療1個(gè)周期以上;(4)既往ICSI周期中曾出現(xiàn)胚胎發(fā)育緩慢或停滯、囊胚形成率低等現(xiàn)象。本研究經(jīng)無(wú)錫市婦幼保健院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。患者均簽訂知情同意書(shū)。

1.2 研究方法

1.2.1 促排卵 采用溫和刺激方案，主要促排卵藥物為克羅米芬(法地蘭高特制藥)和尿促性素(HMG,麗珠制藥)，B超示4枚主導(dǎo)卵泡直徑達(dá)到17mm或3枚主導(dǎo)卵泡直徑達(dá)到18mm。予絨促性素(HCG，麗珠制藥)1萬(wàn)IU扳機(jī)，HCG應(yīng)用后34～36h取卵。

1.2.2 囊胚冷凍 對(duì)照組MⅡ期卵母細(xì)胞按常規(guī)ICSI流程處理，激活組MⅡ期卵母細(xì)胞行ICSI注射后立刻置于30μL含Ca2+載體A23817的激活液微滴(GM508 Cult-Active，Gynemed，德國(guó))，37℃、6%CO2培養(yǎng)箱中孵育15min。培養(yǎng)液洗滌3次，置常規(guī)胚胎培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。每天觀(guān)察卵裂情況，按形態(tài)學(xué)標(biāo)準(zhǔn)評(píng)價(jià)胚胎級(jí)別至D3，如有可移植胚胎，D3冷凍2枚胚胎，其余胚胎囊胚培養(yǎng)至D5或D6，觀(guān)察囊胚形成情況，并行囊胚冷凍。

1.2.3 凍胚移植 患者卵巢大小及內(nèi)分泌激素恢復(fù)正常后行人工周期準(zhǔn)備內(nèi)膜，首選囊胚移植，如無(wú)囊胚，則移植卵裂期胚胎，黃體支持采用本科室標(biāo)準(zhǔn)方案至孕10周。

1.2.4 妊娠測(cè)定 胚胎移植后12d檢測(cè)血清β-HCG≥5IU/L定義為HCG陽(yáng)性，胚胎移植后30d B超檢測(cè)見(jiàn)宮內(nèi)孕囊診斷臨床妊娠。

1.2.5 觀(guān)察指標(biāo) 受精率(2PN率)=正常受精卵數(shù)(2PN數(shù))/ICSI注射數(shù)×100%；胚胎卵裂率=卵裂胚胎數(shù)/2PN數(shù)×100%；可移植胚胎率=可移植胚胎數(shù)/2PN數(shù)×100%；優(yōu)質(zhì)胚胎率=優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)/2PN數(shù)×100%；囊胚形成率=囊胚形成數(shù)/養(yǎng)囊胚胎數(shù)×100%；種植率=孕囊數(shù)/移植胚胎數(shù)×100%；血HCG陽(yáng)性率=HCG陽(yáng)性周期數(shù)/移植周期數(shù)×100%；臨床妊娠率=臨床妊娠周期數(shù)/移植周期數(shù)×100%，流產(chǎn)率=流產(chǎn)周期數(shù)/臨床妊娠周期數(shù)×100%，活產(chǎn)率=活產(chǎn)周期數(shù)/移植周期數(shù)×100%。

2 結(jié) 果

2.1 患者一般情況 患者在前后兩個(gè)周期中的體質(zhì)量指數(shù)(body mass index,BMI)、基礎(chǔ)內(nèi)分泌(bFSH、bLH、bE2以及AMH比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),見(jiàn)表1。

表1 患者基本資料

2.2 患者的胚胎發(fā)育情況 患者在兩個(gè)周期的平均MⅡ卵數(shù)和受精率無(wú)顯著差異(P>0.05)。A23187組的胚胎卵裂率、可移植胚胎率、優(yōu)質(zhì)胚胎率及囊胚形成率均顯著高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.01)，見(jiàn)表2。

表2 兩組胚胎發(fā)育情況比較

2.3 患者妊娠結(jié)局比較 對(duì)照組中33例患者有可移植胚胎，其中1例胚胎解凍時(shí)退化，32例進(jìn)行胚胎移植。A23187組中52例有可移植胚胎均進(jìn)行胚胎移植。A23187組的胚胎種植率、血HCG陽(yáng)性率、臨床妊娠率及活產(chǎn)率均明顯高于對(duì)照組，流產(chǎn)率明顯低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.01)。A23187組臨床妊娠患者中有2例為雙胎妊娠，其中1例孕早期一胎胚胎停育，轉(zhuǎn)為單胎，1例雙胎分娩，最終分娩25例活嬰，產(chǎn)后隨訪(fǎng)均未發(fā)現(xiàn)新生兒出生缺陷。對(duì)照組臨床妊娠患者均為單胎妊娠，無(wú)分娩者。見(jiàn)表3。

表3 兩組妊娠結(jié)局比較

3 討 論

Ca2+是人類(lèi)細(xì)胞中最主要的信號(hào)傳遞介質(zhì)之一。細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Ca2+大量釋放和胞外Ca2+內(nèi)流，胞內(nèi)Ca2+濃度急劇升高(即鈣震蕩)是激活卵母細(xì)胞的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Ca2+儲(chǔ)存池的脈沖式釋放是Ca2+的主要來(lái)源，這一過(guò)程主要通過(guò)精子特異性磷脂酶Cζ(PLCζ)誘導(dǎo)的三磷酸肌醇(inositol 1,4,5-triphosphate，IP3)通路完成的[8]。細(xì)胞外Ca2+主要通過(guò)跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，Ca2+載體對(duì)于這一膜轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程發(fā)揮重要的作用[9]。當(dāng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Ca2+儲(chǔ)存池內(nèi)鈣缺乏時(shí)，卵母細(xì)胞不能正常激活，導(dǎo)致受精失敗，此時(shí)需補(bǔ)充外源性Ca2+來(lái)彌補(bǔ)胞內(nèi)鈣缺乏。Ca2+載體通過(guò)細(xì)胞外Ca2+的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)，誘導(dǎo)卵母細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度迅速升高(即鈣震蕩)，激活卵母細(xì)胞，維持受精[3,9]。

既往大多數(shù)研究將Ca2+載體激活應(yīng)用于低受精率或受精失敗的ICSI助孕患者，并且一致認(rèn)為Ca2+載體能顯著提高受精率，改善患者妊娠結(jié)局[4-7]。然而在排除受精因素后，Ca2+載體激活能否促進(jìn)胚胎發(fā)育，提高胚胎質(zhì)量仍存爭(zhēng)議。本研究發(fā)現(xiàn)，在受精率正常、胚胎發(fā)育緩慢和阻滯的ICSI助孕患者，Ca2+載體能明顯改善胚胎質(zhì)量，促進(jìn)囊胚形成，改善患者的臨床妊娠結(jié)局，提高活產(chǎn)率。這些臨床結(jié)果與國(guó)外一項(xiàng)前瞻性多中心研究一致。該研究募集胚胎發(fā)育緩慢或阻滯的ICSI助孕患者，并排除了受精率小于30%的患者，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Ca2+載體激活后患者的胚胎卵裂率和囊胚形成率顯著提高，而受精率無(wú)顯著差異[10]。但該研究為多中心研究數(shù)據(jù)，不能排除患者促排卵方案和胚胎培養(yǎng)環(huán)境的差異。本研究對(duì)象均為本中心ICSI助孕患者，患者前后兩個(gè)周期的促排卵方案及胚胎培養(yǎng)環(huán)境基本相同。盡管這樣，仍不能完全摒除患者自身狀況在Ca2+載體激活前后兩個(gè)周期間的微小差異和外源性干擾因素的潛在影響。近期研究進(jìn)一步證實(shí)，Ca2+載體激活促進(jìn)細(xì)胞周期分裂的同步性，提高囊胚利用率[11]。但也有研究顯示，在前次ICSI助孕D5囊胚質(zhì)量差的患者中,Ca2+載體激活并不能改變受精率和囊胚的質(zhì)量，但患者例數(shù)太少(19例)，未進(jìn)一步觀(guān)察Ca2+載體激活對(duì)妊娠結(jié)局的影響[12]。

除正常受精外，鈣震蕩還影響胚胎后期的發(fā)育和基因表達(dá)[11]。研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)于同時(shí)存在胚胎卵裂率低或胚胎質(zhì)量差的ICSI受精失敗患者，給予卵母細(xì)胞人工輔助激活不僅提高受精率，還能明顯改善后期胚胎卵裂和囊胚的形成[13]。Ca2+載體在胚胎發(fā)育阻滯、緩慢以及囊胚形成率低的患者中有顯著作用，推測(cè)Ca2+載體激活可能參與卵母細(xì)胞活化早期事件的啟動(dòng)和完成，但可能長(zhǎng)期促進(jìn)胚胎發(fā)育。盡管Ca2+震蕩是在卵母細(xì)胞ICSI受精后立即產(chǎn)生的[3]，Ca2+載體能維持胚胎后期發(fā)育過(guò)程中所需要的充足的鈣供應(yīng)。在細(xì)胞有絲分裂阻滯或Ca2+通道缺乏的細(xì)胞周期中，應(yīng)用Ca2+載體能明顯改善細(xì)胞分裂，并且Ca2+載體在細(xì)胞分裂的初始階段即發(fā)揮至關(guān)重要的作用[14]。此外，Ca2+震蕩波還能促使成熟卵母細(xì)胞進(jìn)行正常減數(shù)分裂。研究發(fā)現(xiàn)，卵母細(xì)胞的減數(shù)分裂阻滯大多是由Ca2+通道缺失引起的[15]。因此，Ca2+載體對(duì)于細(xì)胞有絲分裂和減數(shù)分裂中任何階段阻滯均具有改善作用。在生理性或病理性鈣缺乏的ICSI助孕患者中易發(fā)生胚胎卵裂阻滯的問(wèn)題[16]，進(jìn)一步證實(shí)Ca2+在胚胎卵裂過(guò)程中的重要作用。本研究發(fā)現(xiàn)，在胚胎發(fā)育阻滯或緩慢的患者中，Ca2+載體能明顯促進(jìn)胚胎的卵裂和囊胚的形成，改善胚胎質(zhì)量。然而未發(fā)現(xiàn)Ca2+載體對(duì)受精率的顯著影響，分析原因可能為本研究募集的是ICSI注射后能正常受精的患者，受精過(guò)程不需要外源性鈣離子進(jìn)行輔助激活，因此其對(duì)受精的影響作用不明顯。由此推測(cè)，除導(dǎo)致受精失敗外，卵母細(xì)胞激活過(guò)程中Ca2+信號(hào)不足還可能影響后期的胚胎卵裂，導(dǎo)致胚胎質(zhì)量差，囊胚形成率低等問(wèn)題。

引起胚胎發(fā)育緩慢或阻滯的原因較復(fù)雜，除精源性因素外，還有可能是卵母細(xì)胞自身的異常。研究發(fā)現(xiàn)，Ca2+載體激活能顯著提高年輕及卵巢功能正?；颊叩氖芫?、囊胚形成率和囊胚質(zhì)量，并不能改善高齡或卵巢儲(chǔ)備低下患者的受精和胚胎質(zhì)量[7]。老年女性的卵母細(xì)胞進(jìn)行Ca2+內(nèi)流的能力嚴(yán)重受損，但卵母細(xì)胞裝載正常精子和PLCζ誘導(dǎo)的Ca2+振蕩特性的能力幾乎不受影響。因此可能是卵母細(xì)胞激活失敗以外的因素，如與年齡相關(guān)的卵母細(xì)胞非整倍體，線(xiàn)粒體DNA損傷以及線(xiàn)粒體功能障礙等均影響著胚胎發(fā)育和胚胎質(zhì)量[17]。因此，本研究募集的人群是年輕(22～36歲)且卵巢功能正常者，盡可能減少卵源性因素對(duì)受精和胚胎的潛在影響。此外，本研究采用自身對(duì)照，為避免前后兩個(gè)周期的個(gè)體變化，盡量縮短受試對(duì)象前后兩個(gè)周期助孕的間隔時(shí)間，并且再次ICSI助孕時(shí)受試對(duì)象重新接受體重、卵巢功能等指標(biāo)的評(píng)估，這些指標(biāo)在前后兩個(gè)周期中均無(wú)顯著差異。為減少外源性因素對(duì)胚胎結(jié)局的影響，本研究募集的患者在激活前后兩個(gè)周期均采用以克羅米芬和尿促性素為主要促排卵藥物的溫和刺激方案，激活周期根據(jù)患者前次助孕的反應(yīng)性?xún)H做藥物劑量微小的調(diào)整。由于克羅米芬的抗雌激素效應(yīng)，其對(duì)子宮內(nèi)膜容受性有一定的負(fù)面影響，因此患者全部采用凍胚移植,并且凍胚移植周期均采用人工周期方案準(zhǔn)備內(nèi)膜。盡管玻璃化冷凍及胚胎復(fù)蘇操作對(duì)胚胎的影響較小，但仍不能完全排除其對(duì)胚胎潛在影響。

隨著Ca2+載體在輔助生殖領(lǐng)域的不斷應(yīng)用，其作為一項(xiàng)新技術(shù)，其安全性也成了人們關(guān)注的焦點(diǎn)。研究發(fā)現(xiàn)，Ca2+載體不會(huì)影響卵母細(xì)胞減數(shù)分裂中染色體的正常分離[18]。有關(guān)Ca2+載體激活出生的兒童健康隨訪(fǎng)研究發(fā)現(xiàn)，Ca2+載體激活后出生兒童的體重、性別比、出生缺陷率及類(lèi)型，智力發(fā)育、語(yǔ)言和社會(huì)行為能力等方面均與常規(guī)ICSI出生的兒童無(wú)顯著差異[19-20]。本研究隨訪(fǎng)Ca2+載體激活組患者分娩的25例新生兒，均未發(fā)現(xiàn)新生兒出生缺陷。目前的數(shù)據(jù)尚未發(fā)現(xiàn)Ca2+載體對(duì)子代的不良影響，但由于研究樣本量較少，觀(guān)察周期的時(shí)限性等問(wèn)題，Ca2+載體對(duì)子代的安全性問(wèn)題還需大樣本的研究和長(zhǎng)期的隨訪(fǎng)觀(guān)察進(jìn)一步論證。

總之，Ca2+載體對(duì)胚胎發(fā)育阻滯或緩慢患者胚胎卵裂和妊娠結(jié)局有改善作用，是Ca2+載體應(yīng)用領(lǐng)域的新突破，對(duì)于ICSI助孕中反復(fù)出現(xiàn)胚胎結(jié)局不良的年輕患者，Ca2+載體輔助激活帶來(lái)孕育新生命的希望。但目前研究樣本量有限，Ca2+載體對(duì)胚胎發(fā)育的影響及其安全性還需大規(guī)模多中心前瞻性研究進(jìn)行論證。