彭巍，黃榮，舒適，徐尚榮,張君

(青海大學畜牧獸醫(yī)科院，西寧 810016)

牦牛(Bos grunniens)是青藏高原農(nóng)牧民生產(chǎn)生活的主要生產(chǎn)資料，是農(nóng)牧民必須的肉、乳、絨的主要來源。牦牛群主要分布在海拔3000m～6000m的低溫缺氧地區(qū)，惡劣的自然環(huán)境條件為牦牛的生長和繁殖帶來了很多不利因素，目前主要運用體外成熟的卵母細胞進行體外受精、體細胞核移植等胚胎生物技術(shù)來改善繁殖率。在正常的體內(nèi)發(fā)育過程中，卵母細胞處于缺氧環(huán)境中，卵泡液中含有自由基清除劑和抗氧化酶，保護卵母細胞免受氧化損傷[1，2]，但體外培養(yǎng)過程中，卵母細胞、精子和胚胎暴露在高氧環(huán)境下[3]，輸卵管和子宮內(nèi)環(huán)境保護的缺失降低了抗氧化劑的產(chǎn)生，并導致氧化還原失衡[4]。因此，為了提供體外或體內(nèi)胚胎發(fā)育更好的條件，維持細胞內(nèi)氧化還原狀態(tài)的平衡是很重要的[5]。

褪黑素(Melatonin，MT)是由哺乳動物松果體合成并分泌的一種吲哚類激素，松果腺以外的組織中都可產(chǎn)生，包括卵巢、睪丸、子宮、胎盤、皮膚、骨髓、腸道和晶狀體。褪黑激素是一種多功能分子，參與生理過程，如晝夜節(jié)律、生殖、清除自由基、抗炎癥和抗凋亡[6，7]。作為一種有效的自由基清除劑和廣譜抗氧化劑，褪黑素及其代謝物可直接清除ROS并減少細胞氧化損傷[8]。最近的研究表明，牛[9]和豬[10]的卵泡液中存在褪黑激素，在卵母細胞培養(yǎng)過程中補充褪黑激素可以提高受精能力和牛、人、豬的卵母細胞發(fā)育[11，12]。然而體外成熟期間補充褪黑素改善卵母細胞質(zhì)量的潛在機制尚未完全明確。

該項研究探討不同濃度的褪黑素添加到卵母細胞體外成熟液中對體外牦牛卵母細胞成熟的影響。分析褪黑素對牦牛卵母細胞成熟后的卵裂率和囊胚率、線粒體分布、GSH水平的影響，從而進一步闡明褪黑素對牦牛卵母細胞質(zhì)量和隨后IVF胚胎發(fā)育的影響，旨在提高牦牛IVF胚胎的發(fā)育能力，提升牦牛育種及良種推廣途徑，以加快青藏高原牦牛良種推廣力度和覆蓋面。

1 材料與方法

1.1 主要試劑配制

卵母細胞體外成熟液(IVM液)：TCM-199+25mM Hepes+10%FCS+0.2mM丙酮酸鈉+0.2U/ml FSH+1μg/ml+100U/ml青霉素+100μg/ml鏈霉素+0.26mM NaHCO3。G1.5/ G2.5 購買于vitrolife公司，瑞典。BO工作液(Bracket and Oliphant’ s medium)：先配制Stock A和Stock B。Stock A配制方法，稱取NaCl 6.55g，KCl 0.3g，NaH2PO4·H2O 0.113g，CaCl2·2H2O 0.33g，MgCl2·6H2O 0.106g，加入去離子水，定容至100mL。Stock B配制方法，稱取NaHCO3 1.3g，加入去離子水，定容至100mL。取Stock A10mL，Stock B 23.87mL，Na-pyruvate 13.75mg，Gentamicin stock 100μL，Glucose 250mg，加入去離子水，定容至100mL，過濾除菌，4℃保存?zhèn)溆谩Ｖ谱骶游⒌蔚腂O液為含6mg/mL BSA和4.5mg/mL Theophylline的BO工作液。

1.2 牦牛卵母細胞收集和體外成熟

牦牛卵巢采集自西寧市裕泰屠宰場。離體的卵巢迅速保存于16 °C～25 °C的含有青霉素、鏈霉素生理鹽溶液中，放置保溫桶內(nèi)并于4h內(nèi)帶回試驗室；使用12號10mL注射器從直徑3mm～8mm的竇卵泡腔中吸取卵泡液，并在體視顯微鏡下將胞質(zhì)完整均勻、具有完整卵丘細胞的卵丘—卵母細胞復(fù)合體(Cumulus-Oocyte Complex，COCs)檢出。將COCs在成熟液中清洗后，移入含有不同濃度的褪黑素(0、10-7、10-9和10-11M)的4mL卵母細胞體外成熟培養(yǎng)液的培養(yǎng)皿中，在38.5℃，5% CO2、飽和濕度條件下培養(yǎng)。24h后統(tǒng)計第一極體排出率，卵母細胞的成熟率計算以第一極體排出的比率作為標準。

1.3 牦牛卵母細胞的體外受精和體外胚胎培養(yǎng)

牦牛卵母細胞在體外成熟24h后，使用移液槍對卵母細胞輕微吹打，去除其周圍的顆粒細胞，選取胞質(zhì)均勻且排出第一極體的卵母細胞移入提前12h平衡的BO液微滴中，并用石蠟油覆蓋，每滴20～25個卵母細胞。38℃～42℃的溫水中迅速解凍精子，用自制精子針迅速將精液移入含2mLBO液的圓管底部，45度傾斜精子上浮1h，完成精子獲能。吸取液面部分精液，1500 r/min離心5min 后，棄上清，剩余液體與精子混勻后加入到上述含有成熟卵母細胞的微滴中；受精24h后，在含有0.1%牛睪丸透明質(zhì)酸酶的PBS中剝離卵丘細胞和多余的精子，然后在含有5% CO2的95%濕潤空氣中于38.5℃下在G1.5培養(yǎng)液中培養(yǎng)；3d后換液，轉(zhuǎn)入G2.5液中繼續(xù)培養(yǎng)， 培養(yǎng)至7d收集囊胚，并統(tǒng)計卵裂率、桑椹胚率以及囊胚率。所采用的精液取自青海省家畜改良中心，精液為含野牦牛1/2血的大通牦牛凍精。

1.4 牦牛卵母細胞內(nèi)GSH的測定

收集體外成熟24h后的對照組和褪黑素(10-9M)組的卵母細胞，挑出胞質(zhì)均勻且有第一極體的卵母細胞。ThiolTracker TM Violet(T10096，Thermo Fisher Scientific，Massachusetts，USA)用于分析牦牛卵母細胞還原型GSH的水平，對牦牛成熟卵母細胞操作方法按照說明書進行操作。使用熒光顯微鏡(Nikon，Tokyo，Japan)捕獲卵母細胞，使用Image-Pro Plus軟件分析GSH的熒光強度。

1.5 牦牛卵母細胞內(nèi)DNA 損傷的測定

將體外成熟的牦牛卵母細胞在PBS-PVA溶液中沖洗3次，5min/次。將卵母細胞至免疫染色固定液(Beyotime)中固定，室溫下孵育1h；固定后卵母細胞再移至含0.2% Triton X-100的PBS溶液中透化，孵育30 min；通透后的卵母細胞在PBS-PVA溶液中吹洗3次，5min/次；沖洗后的卵母細胞移至免疫染色封閉液(Beyotime)中封閉，4℃條件下孵育12h。封閉后的牦牛卵母細胞與DNA損傷抗體(1：500；Abcam，UK)孵育；洗滌3次后，將卵母細胞與二抗室溫避光孵育2h。卵母細胞用用熒光顯微鏡捕獲，使用Image-Pro Plus軟件分析DNA損傷水平。

1.6 牦牛卵母細胞凋亡水平的測定

Annexin V-FITC凋亡分析試劑盒(Beyotime)用于評估卵母細胞中磷脂酰絲氨酸外化的早期凋亡卵母細胞。將195μL膜聯(lián)蛋白V-FITC結(jié)合溶液，5μL膜聯(lián)蛋白V-FITC和10μL碘化丙啶輕輕混合。將樣品在室溫下在混合物中處理15min。在清洗溶液中洗滌三次后，使用高速共聚焦顯微鏡測量熒光信號。

1.7 牦牛卵母細胞線粒體膜電位的測定

用Mito-Tracker Green(Beyotime)測定牦牛在不同褪黑素濃度(0，10-9M)體外成熟后卵母細胞中線粒體的活性。MII卵母細胞經(jīng)兩次洗滌后，將MII期的卵母細胞與200nM 預(yù)溫育的Mito-Tracker Green染色液，在37℃條件下一起孵育30min。除去染色液，滴加37℃條件下預(yù)溫育M199培養(yǎng)液。將卵母細胞在新鮮的M199培養(yǎng)液中在38.5℃下洗滌15min。置于蓋玻片上，通過熒光顯微鏡捕獲卵母細胞圖像，采用Image-Pro Plus軟件對熒光強度進行分析。

1.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計和分析

采用單因素方差(One-ANOVA)和鄧肯多重比較試驗(Duncan multiple comparison test)分析，并采用SPSS 21.0軟件(SPSS Inc.)進行分析。相關(guān)試驗至少重復(fù)三次，測定數(shù)據(jù)代表所有重復(fù)試驗的平均值。采用t檢驗方法對相關(guān)基因表達的進行了驗證分析，P<0.05認為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 成熟液中添加不同濃度的褪黑素對牦牛卵母細胞體外成熟的影響

各組卵母細胞體外成熟率見表1：與對照組與IVM+10-7組相比，IVM+10-9組(10-9M)和IVM+10-11組(10-11M)卵母細胞的成熟率顯著提高，差異顯著(P<0.05)；當濃度為10-9M時，卵母細胞的極體排出率達到最高。

2.2 成熟液中添加不同濃度褪黑素對牦牛卵母細胞后續(xù)胚胎發(fā)育能力的影響

各濃度處理組中卵裂率和囊胚率見表1：與對照組相比，IVM+10-9組和IVM+10-11組卵裂率和囊胚形成率顯著升高，差異顯著(P<0.05)；對照組與IVM+10-7組相比，卵母細胞的卵裂率及囊胚率不顯著(P>0.05)，研究結(jié)果表明，卵母細胞體外成熟培養(yǎng)液中添加10-9M濃度的褪黑素，有助于提高卵母細胞的成熟率、胚胎卵裂率及囊胚率。

表1 體外成熟中添加不同濃度的褪黑激素對體外胚胎發(fā)育和質(zhì)量的影響

2.3 褪黑素對牦牛卵母細胞體外成熟后氧化應(yīng)激的影響

體外成熟后卵母細胞中GSH的水平如圖1所示，與對照組對比，補充褪黑素組(10-9M)顯著提高牦牛卵母細胞中GSH的相對水平(P<0.05)；體外成熟后卵母細胞中DNA損傷程度如圖2所示，與對照組對比，補充褪黑素組(10-9M)顯著減少牦牛卵母細胞中DNA損傷程度(P<0.05)?？偟膩碚f，添加10-9M濃度的褪黑素有助于提高卵母細胞體外成熟過程中GSH的水平，降低DNA損傷程度，從而降低氧化應(yīng)激水平，提高卵母細胞的體外成熟率。

2.4 褪黑素抑制牦牛卵母細胞早期凋亡

如圖3所示，在對照組中，IVM卵母細胞中清楚地檢測到熒光信號，但在補充褪黑素組(10-9M)中很少觀察到熒光信號。結(jié)果表明，褪黑素顯著降低體外成熟過程中牦牛卵母細胞的早期凋亡水平(P<0.05)，提高卵母細胞體外成熟率。

2.5 褪黑素處理對牦牛卵母細胞IVM過程中線粒體恢復(fù)的影響

如圖4所示，過量的ROS產(chǎn)生會導致線粒體蛋白質(zhì)和DNA的損傷。試驗研究了IVM牦牛卵母細胞中的線粒體活性和分布。熒光強度的定量顯示，與對照組卵母細胞相比，褪黑素處理的卵母細胞中線粒體的信號顯著增加，褪黑素組線粒體正常分布率高于對照組(P<0.05)。研究結(jié)果表明，10-9M濃度的褪黑素降低卵母細胞體外成熟過程中線粒體蛋白質(zhì)和DNA的損傷程度。

3 討論

在卵母細胞體外成熟的過程中，由于培養(yǎng)環(huán)境中氧含量存在差異，體外成熟的卵母細胞會承受更高的氧壓，從而導致ROS產(chǎn)生過量。當 ROS 的產(chǎn)生速度超過其清除速度時會產(chǎn)生氧化應(yīng)激，破壞生物大分子的正常結(jié)構(gòu)，從而對體外成熟效率產(chǎn)生影響[13]。褪黑素作為一種有效的抗氧化劑和自由基清除劑，能夠顯著降低細胞內(nèi)ROS水平，清除自由基，改善卵母細胞的體外成熟與胚胎的體外發(fā)育歷程[14]，進而保護合子和胚胎。近年來，褪黑素在提高體外培養(yǎng)卵母細胞和胚胎發(fā)育方面得到了越來越多的證實，但其對牦牛卵母細胞體外成熟的影響機制還尚未明確。

本研究測定了在不同培養(yǎng)條件下添加不同濃度的褪黑素對牦牛體外成熟過程是否會改善卵母細胞的質(zhì)量。研究發(fā)現(xiàn)，添加10-9M褪黑素的體外培養(yǎng)液可顯著提高牦牛卵母細胞的體外成熟率，進而改善后續(xù)的胚胎發(fā)育能力。除此之外，與對照組相比，當添加10-7M濃度的褪黑素時，卵母細胞的體外成熟并沒有受到顯著的影響。盡管褪黑素在體外卵母細胞成熟和胚胎發(fā)育方面有所改善，但褪黑素的有益作用似乎在綿羊[15]、兔[16]、豬[17]和小鼠[18]等動物上具有特異性和濃度依賴性，特別是在抗氧化保護[19]，增強免疫功能，睡眠和繁殖等方面[20]。

褪黑素作為抗氧化劑和自由基清除劑，通過清除自由基，直接消除ROS，通過該系統(tǒng)起作用，增加編碼抗氧化酶如SOD和GSH的基因的表達，并且抑制促氧化酶的作用以減少細胞氧化應(yīng)激[21，22]。已有研究表明，在牛的體外成熟培養(yǎng)基中添加一定濃度的褪黑素，可以促進細胞器的正常分布、GSH 和ATP含量增加、抗氧化基因表達水平的提高，進而促進卵母細胞受精和發(fā)育能力[12]。在本實驗中，與對照組相比，培養(yǎng)液中添10-9M濃度褪黑素組的成熟卵母細胞內(nèi)GSH的含量更高，凋亡率降低，表明添加10-9M濃度的褪黑素在所述條件下的卵母細胞體外成熟過程直接影響卵母細胞的質(zhì)量，進而提高牦牛體外受精胚胎的囊胚率。

線粒體是正常卵母細胞發(fā)育的關(guān)鍵，并且是卵母細胞和早期胚胎中ATP生產(chǎn)的主要來源[23]。線粒體功能障礙與染色體分離障礙、受精失敗、卵母細胞破碎和線粒體引起的細胞凋亡的減少密切相關(guān)[24]。有研究報道，卵母細胞體外成熟過程中過量產(chǎn)生的ROS會導致線粒體蛋白質(zhì)和DNA的損傷[25，26]。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)在卵母細胞體外成熟過程中用褪黑素處理可以有效緩解氧化應(yīng)激，并且恢復(fù)線粒體的活性。

4 結(jié)論

本研究發(fā)現(xiàn)褪黑素以10-9M的濃度添加到成熟液中可有效提高牦牛卵母細胞的成熟質(zhì)量以及體外胚胎培養(yǎng)過程中囊胚的產(chǎn)生，證實了褪黑素在卵母細胞體外成熟階段對減少細胞氧化應(yīng)激和保護細胞免受凋亡引起的細胞死亡中起重要作用。這些數(shù)據(jù)為胚胎的冷凍保存，以及在冷凍保存的胚胎解凍后將褪黑素添加到培養(yǎng)液中的研究提供了理論依據(jù)。