張旖旎，汪 萌，朱麗霞，楊騏瑜，聶 睿，楊 柳，胡 娟，席青松*，靳 鐳

(1.華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心，武漢 430030；2.復(fù)旦大學(xué)附屬婦產(chǎn)科醫(yī)院，上海 200011)

由新型冠狀病毒(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2,SARS-CoV-2)導(dǎo)致的新型冠狀病毒肺炎(coronavirus disease 2019,COVID-19)被世界衛(wèi)生組織WHO認(rèn)定為“全球大流行”。截止至2021年5月，新型冠狀病毒肺炎疫情已波及了全球220個(gè)國家和地區(qū)，并造成了1700萬人感染和350萬人死亡[1]。SARS-CoV-2主要通過空氣和氣溶膠傳播，因此呼吸系統(tǒng)成為主要的感染靶點(diǎn)。目前血管緊張素轉(zhuǎn)換酶2(angiotensin-converting enzyme 2,ACE2)是公認(rèn)的新型冠狀病毒進(jìn)入靶細(xì)胞的位點(diǎn)，除肺外，卵巢、睪丸、Sertoli細(xì)胞、Leydig細(xì)胞等人類生殖系統(tǒng)器官和細(xì)胞均高表達(dá)ACE2[2-3]。因此，人類生殖系統(tǒng)可能是新型冠狀病毒感染的潛在靶點(diǎn)之一。但關(guān)于新型冠狀病毒是否導(dǎo)致人類生殖系統(tǒng)損傷還存有爭議。有研究表明，新型冠狀病毒感染不會顯著影響女性生育能力。有研究則表明，新型冠狀病毒感染男性患者的精液指標(biāo)發(fā)生改變[4]，血清黃體生成素(luteinizing hormone,LH)升高[5]。也有文獻(xiàn)強(qiáng)調(diào)新型冠狀病毒很大可能會損害精子質(zhì)量和卵巢功能[6-7]。然而，既往研究中對照組樣本的選取可能對結(jié)果造成偏倚。本回顧性研究通過傾向性評分匹配平衡組間樣本數(shù)目和分布的不平衡，驗(yàn)證新型冠狀病毒感染對女性卵巢儲備和卵巢反應(yīng)的影響；同時(shí)通過單臂研究探索新型冠狀病毒感染對感染前后男性精液參數(shù)變化，從而為探討新型冠狀病毒感染是否對男女性生殖功能產(chǎn)生影響提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 研究對象及分組 本研究為單中心回顧性隊(duì)列研究，納入2020年5月到2021年2月于華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心行體外受精-胚胎移植(in vitro fertilization-embryo transfer,IVF-ET)助孕的患者。納入標(biāo)準(zhǔn)：鼻咽拭子檢測新型冠狀病毒RNA陰性。排除標(biāo)準(zhǔn)：重要信息缺失；失訪；供卵周期；部分或全部卵子冷凍。根據(jù)血清新型冠狀病毒抗體檢測結(jié)果，將入組人群分為對照組(新型冠狀病毒抗體陰性)和病例組(新型冠狀病毒抗體陽性)。

1.2 血清新型冠狀病毒抗體檢測和鼻咽拭子新型冠狀病毒RNA檢測 于本中心就診的患者分別在首次就診、促排前和采卵前1周常規(guī)進(jìn)行3次新型冠狀病毒抗體(IgG和IgM)檢測和鼻咽拭子新型冠狀病毒RNA檢測?？贵w檢測采用深圳亞輝龍公司新型冠狀病毒IgG和IgM試劑盒(C86095G,C86095M)，抗體水平≥10AU/mL為檢測陽性[8]。IgG檢測試劑盒的靈敏度為98.5%，特異性為100%，IgM檢測試劑盒的靈敏度為84.3%，特異性為98.5%。RNA檢測采用實(shí)時(shí)熒光PCR(RT-PCR)法，檢測試劑為廣州達(dá)安公司核酸檢測試劑盒(20203400749)。RT-PCR檢測Ct值小于30則為新型冠狀病毒RNA檢測陽性[9]。

1.3 促排卵治療流程 控制性超促排卵(controlled ovarian hyperstimulation,COH)方案主要分為促性腺激素釋放激素(gonadotrophin-releasing hormone,GnRH)激動劑、GnRH拮抗劑和其他方案(包括微刺激方案和黃體期方案)[10]。當(dāng)2～3個(gè)優(yōu)勢卵泡直徑達(dá)18mm時(shí)，肌注重組人絨促性素(human chorionic gonadotrophin,HCG)10000IU，36～38h后進(jìn)行采卵。

1.4 觀察指標(biāo) 抗穆勒激素(anti-Müllerian hormone，AMH)，卵泡刺激素(follicle stimulation hormone,FSH)，竇卵泡數(shù)(antral follicle counting,AFC)，促排期間使用的促性腺激素(gonadotropin，Gn)劑量和應(yīng)用時(shí)間，以及HCG日大卵泡數(shù)等。AMH和FSH檢測均采用羅氏公司的電化學(xué)發(fā)光免疫分析試劑盒，F(xiàn)SH測量精度為0.2～200mIU/mL，AMH測量精度為0.01～23ng/mL。精子質(zhì)量分析采用WHO第五版標(biāo)準(zhǔn)[11]，即精液量≥1.5mL，精液濃度≥15×106/mL，精子總數(shù)≥39×106/mL，精子前向活動力≥32%，精子總活力≥40%，正常形態(tài)精子率≥4%。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用傾向性評分匹配消除樣本間數(shù)量和分布的不平衡。采用最近距離法匹配，匹配比例為1∶4，卡鉗值為0.2。數(shù)據(jù)分析均由SPSS 26.0軟件完成。經(jīng)Kolmogorov-Smirnova或Shapiro-Wilk正態(tài)性檢驗(yàn)檢測，指標(biāo)均為非正態(tài)分布，連續(xù)變量均表示為中位數(shù)(第一四分位數(shù)，第三四分位數(shù))，組間差異采用非參數(shù)秩和檢驗(yàn)(Mann-WhitneyU檢驗(yàn))；分類變量均表示為%(陽性數(shù)/總數(shù))，組內(nèi)差異采用卡方檢驗(yàn)或Fisher精確檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 患者基本情況 根據(jù)血清新型冠狀病毒抗體檢測結(jié)果，抗體陽性120例，其中男性50例，女性70例，中位年齡32(30,36)歲。病例組患者咽拭子RNA檢測均為陰性，且均表現(xiàn)為IgG陽性，3例患者同時(shí)呈IgM陽性，7例患者曾因新型冠狀病毒感染住院。根據(jù)感染嚴(yán)重程度劃分，85例為無癥狀感染者，28例為輕度感染，7例為中度感染。病例組患者均在2020年1月至3月確診，從首次確診到ART治療至少有4個(gè)月間隔期。

2.2 匹配前后兩組女性患者基本情況比較 女性患者，匹配前對照組3973例，病例組70例。相較于對照組，病例組患者BMI更低，經(jīng)歷ART次數(shù)更多，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.034，P=0.021)。經(jīng)傾向性評分匹配后，病例組65例，對照組260例，兩組各項(xiàng)基線均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。兩組樣本間數(shù)量和分布的不平衡均已被消除，見表1。

表1 女性新型冠狀病毒抗體陽性組和對照組基線情況比較[M(Q1,Q3)]

2.3 匹配前后兩組女性患者卵巢儲備和卵巢反應(yīng)比較 卵巢儲備指標(biāo)包括AMH、FSH和AFC，卵巢反應(yīng)指標(biāo)包括促排期間Gn使用劑量、Gn使用時(shí)間以及HCG日大卵泡數(shù)。匹配后兩組間上述指標(biāo)差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表2。

表2 女性新型冠狀病毒抗體陽性組和對照組卵巢功能和卵巢反應(yīng)比較[M(Q1,Q3)]

2.4 感染前后男性患者精液參數(shù)比較 病例組50例男性患者中，26例在感染前后于本中心行精液常規(guī)檢查。感染后正常形態(tài)精子率略低于感染前[4.0(4.0,5.0)vs 6.0(5.0,7.8),P=0.001]，感染前后其他精液指標(biāo)包括精液量、精子總活力、精子前向運(yùn)動力、精子濃度和精子總數(shù)差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表3。

表3 男性感染前后精液參數(shù)比較(n=26)

3 討 論

新型冠狀病毒肺炎疫情大流行對人們正常的活動造成了巨大影響。在疫情初始，美國生殖醫(yī)學(xué)學(xué)會(American Society for Reproductive Medicine，ASRM)和歐洲生殖與胚胎學(xué)會(European Society for Human Reproduction and Embryology，ESHRE)發(fā)布指南建議,除非緊急情況，盡量推遲一切輔助生殖治療。隨著部分國家和地區(qū)疫情的有效控制，這些醫(yī)療學(xué)會建議在保證醫(yī)護(hù)人員安全的前提下，可全面重啟生殖醫(yī)療[12]。然而目前尚未有足夠的數(shù)據(jù)證明親代既往的新型冠狀病毒感染不會對配子或胚胎造成顯著的負(fù)面影響。新型冠狀病毒通過ACE2受體進(jìn)入細(xì)胞，進(jìn)一步被跨膜絲氨酸蛋白酶2(transmembrane protease serine 2，TMPRSS2)酶解激活，從而增殖擴(kuò)增最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡[13]。有研究報(bào)道在人類精子、卵子和胚胎中缺乏這些關(guān)鍵分子[14-15]，因此配子感染幾率較低。部分研究則發(fā)現(xiàn)人類卵巢和睪丸組織中ACE2高表達(dá)，尤其是Sertoli細(xì)胞和Leydig細(xì)胞等[16]。因此不能排除新型冠狀病毒通過間接方式損害生育能力的可能性[17]。

目前新型冠狀病毒是否影響女性生育能力尚不明確。卵巢儲備和卵巢反應(yīng)是反映卵巢功能的常用指標(biāo)。最近的一項(xiàng)橫斷面研究發(fā)現(xiàn)，新型冠狀病毒感染患者和對照組的性激素，包括FSH、LH、AMH等指標(biāo)的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[18]。另一項(xiàng)回顧性研究也發(fā)現(xiàn)，新型冠狀病毒無癥狀感染和輕癥感染女性患者的性激素水平相較于未感染者均無顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異[19]。這與本研究結(jié)果一致，提示新型冠狀病毒感染可能對女性患者生育能力的作用有限。然而，也有文獻(xiàn)表明，新型冠狀病毒感染者的月經(jīng)周期發(fā)生了改變，表現(xiàn)為月經(jīng)量減少、月經(jīng)周期延長，并且這一改變與是否存在新型冠狀病毒肺炎并發(fā)癥相關(guān)[18]。提示生殖醫(yī)生應(yīng)關(guān)注新型冠狀病毒感染患者月經(jīng)周期的改變，以及這一改變對患者心理可能造成的影響。

精液質(zhì)量是評估男性生育力最常用的指標(biāo)之一。本研究共納入50例新型冠狀病毒抗體陽性的男性患者，其中26例在疫情之前至少做過一次精液常規(guī)檢查。通過對比研究感染前后患者的精液常規(guī)參數(shù)指標(biāo)，發(fā)現(xiàn)男性患者的精液量、精子總活力、精子前向運(yùn)動力、精子濃度、精子總數(shù)均無顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。這一結(jié)果與既往報(bào)道的新型冠狀病毒肺炎不會對男性生育功能造成顯著負(fù)面影響的結(jié)果一致[20-21]。然而也有其他研究報(bào)道，新型冠狀病毒感染恢復(fù)后的男性存在精液指標(biāo)受損，表現(xiàn)為無精癥或少精癥等[22]。新型冠狀病毒感染患者的尸檢報(bào)告也發(fā)現(xiàn)，睪丸和附睪中凋亡細(xì)胞比例升高[23]。分析上述研究結(jié)果不一致的原因，可能是疾病嚴(yán)重程度和發(fā)展時(shí)期不同，外周血中病毒載量的差異以及對照組的選取不同也可能造成偏倚從而影響最終的結(jié)局。本研究采用單臂研究，通過自身的前后對照消除了個(gè)體差異和對照組的選擇偏倚造成的影響。本研究結(jié)果提示，新型冠狀病毒感染可能降低正常形態(tài)精子率，雖然這一指標(biāo)在感染后仍在正常范圍內(nèi)(正常精子形態(tài)率>4%)，但是仍值得臨床醫(yī)生注意。其他研究也有報(bào)道,感染后的精液參數(shù)雖發(fā)生了顯著變化，但在正常范圍內(nèi)[4]。既往有研究報(bào)道精子病毒載量與血液病毒載量相關(guān)，只有當(dāng)血液病毒載量達(dá)到一定程度后才會影響精子質(zhì)量[24]。此外,血睪屏障也是防止病原體進(jìn)入睪丸，造成男性生殖系統(tǒng)感染的保護(hù)機(jī)制之一[25]。因此，本研究結(jié)果提示新型冠狀病毒感染可能并不會顯著影響男性生育功能，精液指標(biāo)也均在正常范圍內(nèi)。

本研究結(jié)果顯示，新型冠狀病毒感染可能不會對女性卵巢儲備、卵巢反應(yīng)和男性精液參數(shù)造成顯著影響。新型冠狀病毒肺炎大流行改變了不孕人群對于生育以及輔助生殖治療的態(tài)度[26]。不孕癥的治療對于不孕患者不僅是經(jīng)濟(jì)上的負(fù)擔(dān)，更是心理上的負(fù)擔(dān)[27]。生殖?？漆t(yī)生應(yīng)關(guān)注新型冠狀病毒疫情對不孕癥患者造成的額外的心理壓力。由于疫情的失控，全球范圍內(nèi)多家生殖醫(yī)學(xué)中心關(guān)閉，不孕癥患者的正常診療過程受到了嚴(yán)重影響。一項(xiàng)針對疫情期間育齡期夫婦的問卷調(diào)查報(bào)道，超過三分之一的受試者表示由于疫情帶來的經(jīng)濟(jì)問題和其他問題，他們決定放棄生育[28]。另一項(xiàng)研究也表明，因?yàn)橐咔楸l(fā),受訪的不孕癥女性會推遲懷孕計(jì)劃[29]。作為生殖科醫(yī)生，在給予患者提供治療措施的同時(shí)，也應(yīng)為患者提供足夠的心理支持，以幫助患者實(shí)現(xiàn)生產(chǎn)的愿望[30]。

本研究存在以下不足之處：(1)系單中心回顧性研究，并且樣本量有限，需更大樣本的多中心研究支撐本研究結(jié)論，以消除樣本量和研究設(shè)計(jì)造成的局限性。(2)僅研究了新型冠狀病毒感染對患者卵巢功能和精液參數(shù)的影響，并未觀察新型冠狀病毒感染對IVF結(jié)局，尤其是活產(chǎn)率的影響。后續(xù)需通過對感染患者IVF助孕結(jié)局的追蹤隨訪進(jìn)一步研究新型冠狀病毒感染對輔助生殖技術(shù)的臨床結(jié)局及子代的影響。(3)納入的大部分患者為無癥狀或輕癥患者，因此本研究結(jié)論并不一定適用于所有的新型冠狀病毒感染患者，尤其是重癥患者。

綜上所述，新型冠狀病毒感染對女性卵巢儲備和卵巢反應(yīng)沒有顯著的影響，雖然會降低男性精液正常形態(tài)精子率，但結(jié)果仍在正常范圍，對其他重要精液參數(shù)無顯著影響。作為臨床工作者，應(yīng)關(guān)注新型冠狀病毒感染患者的身心健康，對患者給予足夠的臨床和心理的支持。