張京業(yè),王苗苗,吳克良

[山東大學(xué)生殖醫(yī)學(xué)研究中心(山東大學(xué)附屬生殖醫(yī)院)，濟(jì)南 250012]

隨著輔助生殖技術(shù)在世界范圍內(nèi)的廣泛應(yīng)用，有關(guān)多胎妊娠的報(bào)道逐漸增多。多胎妊娠會(huì)帶來許多問題，包括早產(chǎn)、低出生體重、新生兒死亡和殘疾等的概率顯著增加[1]。提高妊娠率的同時(shí)降低多胎妊娠的發(fā)生，這就需要一種更有效且更嚴(yán)格的移植前胚胎選擇方案。近年來time-lapse(延時(shí)攝像)技術(shù)在一定程度上彌補(bǔ)了傳統(tǒng)胚胎觀察方式無法連續(xù)觀察的局限性，大大提高了人們對(duì)胚胎發(fā)育過程的認(rèn)識(shí)。time-lapse技術(shù)也越來越多地被用于預(yù)測胚胎的發(fā)育潛能和胚胎染色體的整倍性[2-8]。目前，基于time-lapse技術(shù)建立的預(yù)測胚胎發(fā)育潛能的模型有很多。有根據(jù)胚胎著床數(shù)據(jù)(known implantation data，KID)建立的適用于挑選移植胚胎模型[9-12]，也有基于優(yōu)質(zhì)囊胚形成建立的胚胎預(yù)測模型[13-15]，但基于胚胎活產(chǎn)數(shù)據(jù)的預(yù)測模型較少[7]。此外，同一個(gè)模型在不同IVF實(shí)驗(yàn)室的適用性可能存在差異[16]，因各實(shí)驗(yàn)室之間可能有著不同的胚胎培養(yǎng)環(huán)境[17-18]，不同的卵巢刺激方案[19]，以及不同的患者群體[20-22]等。本研究根據(jù)活產(chǎn)胚胎的早期動(dòng)力學(xué)參數(shù)和D3形態(tài)學(xué)評(píng)分，建立一個(gè)新的胚胎預(yù)測模型，為本中心輔助生殖實(shí)驗(yàn)室服務(wù)的同時(shí)，也為類似患者條件以及胚胎培養(yǎng)條件的生殖中心提供新思路。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象 回顧分析2017至2019年在山東大學(xué)附屬生殖醫(yī)院就診的患者。剔除標(biāo)準(zhǔn)：非第一周期，年齡>40歲，嚴(yán)重男性因素，多囊卵巢綜合征(polycystic ovarian syndrome，PCOS)，子宮內(nèi)膜異位癥，身體質(zhì)量指數(shù)(body mass index,BMI)>30kg/m2，胚胎植入前遺傳學(xué)檢測(preimplantation genetic testing，PGT)周期，低反應(yīng)周期和過度刺激周期(成熟數(shù)<5枚或>15枚)。納入標(biāo)準(zhǔn)：助孕方式為常規(guī)體外受精(in-vitro fertilization,IVF)或胞漿內(nèi)單精子注射(intracytoplasmic sperm injection,ICSI)；在time-lapse培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，且有完整的胚胎發(fā)育視頻；正常受精優(yōu)胚數(shù)≥2，第三天移植一枚或兩枚胚胎，且每個(gè)胚胎的活產(chǎn)結(jié)局是已知的。移植一枚胚胎，其結(jié)局為活產(chǎn)或未活產(chǎn)；移植兩枚胚胎，其結(jié)局為兩枚都活產(chǎn)或兩枚都未活產(chǎn)。若移植兩枚胚胎，僅有一枚活產(chǎn)，該數(shù)據(jù)將不被采用。

1.2 胚胎培養(yǎng)與移植 所有胚胎均放入time-lapse培養(yǎng)箱(EmbryoScope,Vitrolife)培養(yǎng)。培養(yǎng)條件37℃、6.0% CO2和5.0% O2，序貫培養(yǎng)液為G1，G2(Vitrolife)。培養(yǎng)箱每隔15min在7個(gè)層面對(duì)胚胎進(jìn)行拍照。D3移植一枚或兩枚優(yōu)質(zhì)胚胎，胚胎移植后常規(guī)行黃體支持。移植后14d檢測血β絨毛膜促性腺激素(β-HCG)，4～6周陰道B超下出現(xiàn)孕囊和胎心為臨床妊娠，并持續(xù)追蹤活產(chǎn)結(jié)局。

1.3 胚胎發(fā)育的評(píng)估 由一位經(jīng)驗(yàn)豐富的胚胎學(xué)家利用Embryo Viewer軟件(Vitrolife)來完成對(duì)胚胎發(fā)育的評(píng)估。t2-tPNf、t3-tPNf、t4-tPNf、t5-tPNf、t8-tPNf分別為從原核消失到胚胎分裂為2細(xì)胞、3細(xì)胞、4細(xì)胞、5細(xì)胞、8細(xì)胞的時(shí)間點(diǎn)。CC2(t3-t2)、CC3(t5-t3)、S2(t4-t3)、S3(t8-t5)以及t5-t2分別為多個(gè)細(xì)胞分裂的持續(xù)時(shí)間。直接分裂(direct cleavage，DC):胚胎在三次同步分裂過程中發(fā)生的異常分裂行為，一個(gè)卵裂球在5h內(nèi)分裂為至少3個(gè)卵裂球。68h胚胎的形態(tài)學(xué)評(píng)分，依據(jù)本中心一直采用的Puissant評(píng)分體系，將胚胎分為1～4分，4分胚胎的標(biāo)準(zhǔn)為卵裂球形態(tài)大小正常均一，沒有或幾乎沒有碎片[23-24]。

1.4 預(yù)測模型的建立、評(píng)估與驗(yàn)證 根據(jù)活產(chǎn)胚胎與非活產(chǎn)胚胎動(dòng)力學(xué)參數(shù)的差異，篩選出與胚胎活產(chǎn)相關(guān)的參數(shù)。進(jìn)一步通過各個(gè)參數(shù)四分位數(shù)范圍和對(duì)應(yīng)的活產(chǎn)率來最終確定用于建立模型的參數(shù)。結(jié)合形態(tài)學(xué)評(píng)分建立一個(gè)基于決策樹的模型。繪制受試者工作特征曲線(receiver operating characteristic,ROC)，并用曲線下面積(Area Under the Curve,AUC)來確定模型的預(yù)測價(jià)值。通過五倍交叉驗(yàn)證法來檢驗(yàn)上述預(yù)測模型的魯棒性。將所有移植胚胎隨機(jī)分成5份，其中4/5胚胎組成校準(zhǔn)組，按建立模型流程圖建立新的模型，剩余1/5胚胎為驗(yàn)證組，驗(yàn)證該模型的有效性。校準(zhǔn)-驗(yàn)證運(yùn)行五次，統(tǒng)計(jì)每次運(yùn)行的動(dòng)力學(xué)參數(shù)以及校準(zhǔn)組和驗(yàn)證組的AUC。

1.5 兩種胚胎挑選模型的定義 KIDScore模型[12]：該模型是一種廣泛使用的模型，旨在避免低植入潛能胚胎而不是選擇高植入潛能胚胎。Embryo Viewer軟件根據(jù)胚胎發(fā)育過程中的多個(gè)發(fā)育節(jié)點(diǎn)，可自動(dòng)對(duì)每個(gè)胚胎進(jìn)行1～5分的評(píng)分。Liu模型[11]：利用定性參數(shù)DC、RC、ICCP(在4-細(xì)胞末期，卵裂球之間小于6個(gè)細(xì)胞間接觸點(diǎn))和定量參數(shù)T5_PNF和S2將胚胎分為F、E、D、C、B、A、A+共七個(gè)等級(jí)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行連續(xù)性參數(shù)、比值性參數(shù)之間的比較以及動(dòng)力學(xué)參數(shù)四分位數(shù)的劃分，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。采用MedCalc軟件進(jìn)行二元邏輯回歸分析以及AUC的比較，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 患者基本信息 共納入434例患者(IVF患者384例，ICSI患者50例)?；颊叩钠骄挲g(31.2±4.0)歲,平均獲卵數(shù)(10.3±2.0)個(gè)?；町a(chǎn)組177例患者，其中173例移植兩枚胚胎均獲得活產(chǎn)，4例移植一枚胚胎且獲得活產(chǎn)，活產(chǎn)胚胎共350枚。非活產(chǎn)組257例患者，其中238例移植兩枚胚胎均沒有活產(chǎn)，19例移植一枚胚胎且沒有活產(chǎn)，非活產(chǎn)胚胎共495枚。因此本研究共納入已知活產(chǎn)結(jié)局的胚胎845枚。

2.2 預(yù)測模型的建立 非活產(chǎn)組的異常分裂DC比例顯著高于活產(chǎn)組，見表1。因此，胚胎發(fā)育過程中是否有DC發(fā)生可作為篩選胚胎的重要前提。將發(fā)生DC的103枚胚胎剔除后，分析兩組的定量參數(shù)。結(jié)果顯示，兩組的t3-tPNf、t4-tPNf、t5-tPNf以及t8-tPNf四個(gè)參數(shù)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。t4-tPNf、t5-tPNf的前三個(gè)四分位數(shù)Q1、Q2和Q3所對(duì)應(yīng)的活產(chǎn)率高于最后一個(gè)四分位數(shù)Q4，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。t8-tPNf的前兩個(gè)四分位數(shù)Q1和Q2所對(duì)應(yīng)的活產(chǎn)率高于后兩個(gè)四分位數(shù)Q3和Q4，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。綜合考慮下，t4-tPNf和t8-tPNf被用來構(gòu)建胚胎預(yù)測模型。根據(jù)胚胎發(fā)育過程是否有異常分裂(DC)，兩個(gè)定量參數(shù)t4-tPNf和t8-tPNf，以及形態(tài)學(xué)評(píng)分建立了胚胎預(yù)測模型，見圖1。該模型將所有移植胚胎分為1～4分，分?jǐn)?shù)高低代表了胚胎的活產(chǎn)潛能。

表1 兩組胚胎定性參數(shù)DC和定量參數(shù)t3-tPNf、t4-tPNf、t5-tPNf、t8-tPNf的比較

表2 定量參數(shù)t3-tPNf、t4-tPNf、t5-tPNf、t8-tPNf的四分位數(shù)范圍和對(duì)應(yīng)的活產(chǎn)率

2.3 預(yù)測模型評(píng)估 根據(jù)預(yù)測模型評(píng)分繪制ROC曲線，AUC為0.664，見圖2。五倍交叉驗(yàn)證法驗(yàn)證后發(fā)現(xiàn)建立預(yù)測模型的兩個(gè)參數(shù)t4-tPNf和t8-tPNf未發(fā)生大的偏差，且校準(zhǔn)組與驗(yàn)證組的AUC非常穩(wěn)定，與預(yù)測模型的AUC無顯著差異，見表3。這證明了該預(yù)測模型的魯棒性。

表3 五倍交叉驗(yàn)證法驗(yàn)證預(yù)測模型

2.4 預(yù)測模型與外部模型的比較 將兩個(gè)廣泛應(yīng)用的胚胎植入預(yù)測模型應(yīng)用到本研究的845枚胚胎中，結(jié)果顯示，3種模型的AUC存在顯著差異，見圖3。KIDScore模型和Liu模型對(duì)本中心活產(chǎn)數(shù)據(jù)的預(yù)測能力低于本研究的預(yù)測模型。

3 討 論

基于time-lapse技術(shù)的胚胎模型有很多，一個(gè)成熟的胚胎預(yù)測模型在某個(gè)實(shí)驗(yàn)室可能需要做出調(diào)整或根本不適用。因此，每個(gè)實(shí)驗(yàn)室可根據(jù)KID數(shù)據(jù)制定自己的胚胎挑選模型。本研究借鑒了多個(gè)模型[9-12]的建模思路和參數(shù)，綜合分析影響胚胎活產(chǎn)的動(dòng)力學(xué)參數(shù)，結(jié)合D3形態(tài)學(xué)評(píng)分，建立一個(gè)新的胚胎預(yù)測模型。

DC作為一種常見的異常分裂現(xiàn)象，被認(rèn)為會(huì)顯著降低胚胎的著床率[9,25]。本研究中活產(chǎn)組和非活產(chǎn)組的DC比例存在顯著差異。因此，DC被用作挑選胚胎重要的定性參數(shù)。定量參數(shù)在不同模型中差異較大，Meseguer模型采用了t5、S2(t4-t3)和CC2(t3-t2)。Liu模型采用t5-PNF、S2以及68h時(shí)是否達(dá)到8細(xì)胞。KIDScore模型采用t3-tPNF、t3、t5-t3/t5-t2以及66h時(shí)是否達(dá)到8細(xì)胞。本研究中，上述定量參數(shù)在兩組中不存在顯著差異;而兩個(gè)新參數(shù)t4-tPNf和t8-tPNf表現(xiàn)出了顯著差異，且有著最合適的四分位數(shù)范圍和對(duì)應(yīng)的活產(chǎn)率。本研究選擇t4-tPNf、t8-tPNf代替t4和t8，是考慮到不同胚胎之間精卵結(jié)合的時(shí)間可能存在差異。如IVF和ICSI兩種授精方式造成的差異，卵子成熟度不同造成的差異，以及ICSI操作中第一個(gè)卵子和最后一個(gè)卵子精子注射時(shí)間的差異等。為避免這些可能存在的差異對(duì)結(jié)果的影響，我們采用了原核消失時(shí)間來代替授精時(shí)間。本研究將形態(tài)學(xué)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)納入了模型，并作為模型的最高評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)。這是因?yàn)樵谌粘９ぷ髦惺褂胻ime-lapse技術(shù)做移植胚胎的最終決定時(shí)，形態(tài)學(xué)評(píng)分占很高的比重。事實(shí)上，目前形態(tài)學(xué)評(píng)分仍在胚胎挑選時(shí)有著重要的作用[26]。此外，胚胎形態(tài)學(xué)評(píng)分也是Liu模型的一個(gè)篩選條件[11]。

本研究中患者挑選非常嚴(yán)格，盡量排除了影響胚胎著床的其它因素，真正體現(xiàn)了胚胎本身發(fā)育潛能對(duì)妊娠結(jié)局的影響。患者的平均年齡為31.2歲，低于多篇已發(fā)表文章中的患者年齡，34.5歲[11]和38.0歲[10]等。體現(xiàn)在臨床結(jié)局上則為活產(chǎn)率(41.4%)，高于這些文章中的臨床妊娠率。因此，本研究的預(yù)測模型可以為患者平均年齡較低的生殖中心提供一定的指導(dǎo)意義。已發(fā)表的胚胎預(yù)測模型，對(duì)D3胚胎植入的預(yù)測能力往往低于對(duì)囊胚形成的預(yù)測能力，它們預(yù)測植入的AUC值都相對(duì)溫和，處于0.6～0.7之間[27,7,12,10]。這可能是因?yàn)橄啾扔谀遗咝纬桑咛ブ踩肷婕暗礁嗖豢煽匾蛩?。而本研究的模型則為活產(chǎn)能力預(yù)測模型，它比植入預(yù)測模型有著更多的不可控性;AUC為0.664，表明本研究的預(yù)測模型有著正常的預(yù)測水準(zhǔn)。

KIDScore模型是一種取消選擇的模型，它旨在避免植入低潛能胚胎而不是選擇高植入潛能胚胎的算法。因此評(píng)分為5分組包含很大比例的胚胎，將最后移植或凍結(jié)的選擇權(quán)留給胚胎學(xué)家。盡管5分組的胚胎如此之多，其著床率仍顯著高于其它幾組。此模型采用來自24家生殖中心的龐大數(shù)據(jù)，利用3275枚已知著床結(jié)局(KID)的胚胎建立模型，并用11218枚胚胎進(jìn)行了模型驗(yàn)證。因此是一種有著普遍適用性的模型。Liu模型是一種選擇導(dǎo)向性模型，其評(píng)分為A+胚胎的比例很少，但其著床率是所有模型中最高的。該模型能很好地幫助胚胎學(xué)家挑選他們所需要的胚胎。此外Liu模型的形態(tài)學(xué)評(píng)分F評(píng)分在本文中不適用。Liu模型的0.622和KIDScore模型的0.618在本文中的數(shù)據(jù)中表現(xiàn)出的預(yù)測能力不佳，可能與患者年齡、培養(yǎng)環(huán)境、用藥方案等有關(guān)。這進(jìn)一步表明每個(gè)實(shí)驗(yàn)室應(yīng)制定自己的胚胎預(yù)測模型。

綜上所述，本研究建立的胚胎預(yù)測模型，可為類似患者條件以及胚胎培養(yǎng)條件的生殖中心提供借鑒意義。本文的局限性在于，該預(yù)測模型未經(jīng)前瞻性的數(shù)據(jù)驗(yàn)證，其有效性也未經(jīng)外部數(shù)據(jù)驗(yàn)證。接下來的研究方向?yàn)榻㈦S機(jī)對(duì)照臨床試驗(yàn)，進(jìn)一步驗(yàn)證該模型的適用性。