董曉莉，王進(jìn)京，姚 晉，楊 婧，鄭 洪

(遵義醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院病理科，遵義 563003)

卵巢癌是嚴(yán)重危害女性生命健康的婦科惡性腫瘤。目前，手術(shù)聯(lián)合鉑類/紫杉醇化療為主的綜合治療方式，使大多數(shù)患者獲得了臨床緩解，但由于部分患者耐藥以及70%的高復(fù)發(fā)傾向，其治療效果仍不理想，5年生存率僅25%～30%[1-2]。流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，未產(chǎn)、不孕者卵巢癌發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)較高，多產(chǎn)、母乳喂養(yǎng)、口服避孕藥等則可降低卵巢癌的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)[3]，表明孕激素對(duì)卵巢癌的發(fā)生具有保護(hù)作用。隨著激素療法在乳腺癌、子宮內(nèi)膜癌臨床治療中的廣泛應(yīng)用[4]，孕激素及孕激素受體成為了卵巢癌靶向治療研究的重要方向。但是，孕激素在卵巢癌治療中的應(yīng)用仍有爭(zhēng)議，這可能與孕激素作用后獨(dú)特的微環(huán)境難以控制有關(guān)，如孕激素的量、激酶活性、共刺激因子或PR-A/PR-B比率等[5]。蛋白酶體抑制劑(proteasome inhibitor,MG132)是一種有效、可逆、特異的26S蛋白酶體抑制劑。研究表明，MG132對(duì)多種腫瘤具有增殖抑制和促進(jìn)凋亡的作用[6-9]。本文擬探討醋酸甲羥孕酮(Medroxyprogesterone acetate,MPA)、MG132單獨(dú)及聯(lián)合應(yīng)用對(duì)不同孕激素受體(progesterone receptor,PR)表達(dá)卵巢癌細(xì)胞增殖、凋亡的影響及其可能機(jī)制，旨在為卵巢癌的臨床治療提供新的治療思路和實(shí)驗(yàn)證據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 人卵巢漿液性囊腺癌H0-8910、SKOV3細(xì)胞系購自南京凱基生物公司；MPA、MG132購自美國(guó)Selleck.cn公司；胎牛血清購自美國(guó)Hyclone公司；CCK-8試劑盒及Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購自南京凱基；二步法免疫組化試劑盒購自北京中杉金橋；兔抗人PR抗體(ab32085)購自美國(guó)Abcam公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)與分組 HO-8910、SKOV3細(xì)胞均采用含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基，添加1%雙抗，置37℃、5% CO2及100%濕度孵箱培養(yǎng)，2～3d更換一次培養(yǎng)液。細(xì)胞生長(zhǎng)良好且鋪滿瓶底達(dá)80%時(shí)進(jìn)行消化傳代。細(xì)胞分組：(1)單獨(dú)用藥組：MPA(0、1、20、50、100μmol/L)、MG132(0、1、2.5、5、10μmol/L)均作用24～72h；(2)聯(lián)合用藥組：對(duì)照組(0μmol/L)、MG132組(5μmol/L)、MPA組(100μmol/L)、MG132+MPA組(5μmol/L+100μmol/L)均作用24h。

1.2.2 CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖活性 按2×105細(xì)胞/孔接種于96孔板，12h后按分組加入藥物。單獨(dú)用藥組分別于24、48、72h取出，聯(lián)合用藥組于24h取出，加CCK-8溶液10μL/孔，置培養(yǎng)箱孵育2～3h，用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)處測(cè)定每孔光密度(OD)值。

1.2.3 倒置顯微鏡觀察各組細(xì)胞的生長(zhǎng)形態(tài) 將細(xì)胞置于25cm2培養(yǎng)瓶培養(yǎng)，待細(xì)胞鋪面瓶底60%左右時(shí)，按分組加入藥物，置培養(yǎng)箱24h后，用倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)情況并攝片。

1.2.4 AnnexinV-FITC/PI雙染法檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡率 收集各組細(xì)胞，用不含EDTA的胰酶消化并收集各組細(xì)胞，2000r/min,4℃離心5min。按細(xì)胞凋亡試劑盒操作說明書檢測(cè)凋亡情況。

1.2.5 免疫組化法檢測(cè)細(xì)胞中PR表達(dá) 收集各組細(xì)胞，4%多聚甲醛固定20min，0.3% TritonX-100細(xì)胞膜打孔20min，3% H2O2封閉內(nèi)源性過氧化物酶，室溫10min，10%動(dòng)物血清封閉，室溫20min，去血清，加一抗(稀釋比1∶150)，37℃孵育1～2h，陰性對(duì)照組一抗用PBS取代，滴加辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液37℃孵育20min，PBS 2min×3次洗滌，滴加二抗37℃孵育30min，PBS 2min×3次洗滌，DAB顯色15min，蘇木素復(fù)染30s，75%、80%、95%、100%酒精依次脫水5min，二甲苯透明20min并晾干，中性樹膠封片。在光學(xué)顯微鏡下觀察各組細(xì)胞PR表達(dá)情況，每張切片隨機(jī)選取5個(gè)區(qū)域，在200倍視野下，采用Olympus顯微鏡進(jìn)行拍照，將所得圖片輸入計(jì)算機(jī)，應(yīng)用Image-ProPlus圖像軟件(Version 6.0)(IPP6.0)進(jìn)行圖像分析檢測(cè)陽性信號(hào)的平均光密度(Mean Optical Density,MOD)。

1.2.6 Western blot檢測(cè)PR-A、PR-B表達(dá) 提取各組細(xì)胞總蛋白，BCA蛋白定量法定量。配膠、上樣、電泳、切膠及電轉(zhuǎn)，于5% 脫脂奶粉中封閉2h，加一抗PR(1∶2000)、GAPDH(1∶1000)，4℃孵育過夜。TBST溶液10min×3次洗膜。加二抗孵育2h，TBST充分洗膜。采用ECL化學(xué)發(fā)光法曝光顯影。

2 結(jié) 果

2.1 MPA對(duì)HO-8910、SKOV3細(xì)胞的增殖抑制作用 CCK-8檢測(cè)結(jié)果顯示，MPA濃度為20～100μmol/L時(shí)，細(xì)胞存活率呈劑量和時(shí)間依賴性下降。在相同濃度和處理時(shí)間下，MPA對(duì)H0-8910細(xì)胞的增殖抑制作用強(qiáng)于SKOV3細(xì)胞。HO-8910細(xì)胞24、48h和72h的IC50分別為184.20、76.21μmol/L和35.33μmol/L，而SKOV3細(xì)胞24、48h和72h的IC50分別為1732.00、877.80μmol/L和207.20μmol/L(圖1)。100μmol/L MPA作用24h時(shí)，對(duì)HO-8910和SKOV3細(xì)胞的增殖抑制率分別為37%和15%。因此，本實(shí)驗(yàn)選擇100μmol/L、24h進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2 MG132對(duì)HO-8910和SKOV3細(xì)胞的增殖抑制作用 CCK-8檢測(cè)結(jié)果顯示，MG132濃度為1～10μmol/L時(shí)，細(xì)胞存活率呈劑量和時(shí)間依賴性下降。HO-8910細(xì)胞24、48h和72h的IC50分別為19.02、8.31μmol/L和4.26μmol/L。SKOV3細(xì)胞24、48h和72h的IC50分別為14.44、6.74μmol/L和2.05μmol/L(圖2)。5μmol/L MG132作用24h時(shí)，MG132對(duì)HO-8910和SKOV3細(xì)胞的增殖抑制率分別為29%和24%。因此，本實(shí)驗(yàn)選擇5μmol/L、24h進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.3 MG132與MPA聯(lián)合對(duì)HO-8910和SKOV3細(xì)胞的增殖抑制作用 MPA+MG132聯(lián)合處理后H0-8910細(xì)胞的存活率與MPA單獨(dú)作用組相比無顯著差異(P>0.05)(圖3A)，MPA+MG132聯(lián)合處理后SKOV3細(xì)胞的存活率與MPA單獨(dú)作用組相比顯著降低(P<0.05)(圖3B)。兩藥聯(lián)合可增強(qiáng)MPA對(duì)SKOV3細(xì)胞的增殖抑制作用，但對(duì)HO-8910細(xì)胞無影響。

2.4 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察 Control組HO-8910和SKOV3細(xì)胞呈典型的上皮樣細(xì)胞特征，以類橢圓形及長(zhǎng)梭形為主，鋪路石樣生長(zhǎng)，細(xì)胞排列規(guī)則緊湊；MG132組細(xì)胞數(shù)目減少，細(xì)胞間隙增大，視野內(nèi)見較多漂浮細(xì)胞，部分細(xì)胞體積縮小、核質(zhì)比增加。部分細(xì)胞體積變大，細(xì)長(zhǎng)，出現(xiàn)刺狀突起；MG132+MPA組細(xì)胞數(shù)目減少更明顯，視野內(nèi)見大量漂浮細(xì)胞，部分細(xì)胞體積縮小，呈圓形，核質(zhì)比增加。部分細(xì)胞體積增大，伸長(zhǎng)，有刺狀突起；MPA組兩種細(xì)胞形態(tài)差異較明顯，HO-8910細(xì)胞MPA組細(xì)胞形態(tài)變化與MG132組相似，而SKOV3細(xì)胞MPA組數(shù)量略有減少，細(xì)胞排列較緊密(圖4)。

2.5 免疫組化結(jié)果 PR于胞核表達(dá)豐富，胞漿也可見表達(dá)，HO-8910細(xì)胞中PR表達(dá)高于SKOV3細(xì)胞。兩種細(xì)胞中MG132組、MG132+MPA組PR表達(dá)相似，且均高于Control組(P<0.05)，而MPA組PR表達(dá)與Control組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(圖5、6)。

2.6 流式細(xì)胞結(jié)果 SKOV3細(xì)胞：MPA組凋亡率僅為6.25%，MPA+MG132組凋亡率26.79%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。HO-8910細(xì)胞：MPA組凋亡率為21.76%，MPA+MG132組凋亡率為22.37%，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)果表明，MG132可增強(qiáng)MPA誘導(dǎo)SKOV3細(xì)胞凋亡的能力，但在H0-8910細(xì)胞中無此作用(圖7)。

2.7 Western blot結(jié)果 HO-8910、SKOV3細(xì)胞中PR-B表達(dá)明顯高于PR-A。MG132組、MG132+MPA組PR-A、PR-B表達(dá)相似，且均高于Control組(P<0.05)，而MPA組PR-A、PR-B表達(dá)與Control組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(圖8)。

3 討 論

鉑類和紫杉醇類廣泛用于卵巢癌術(shù)后的聯(lián)合治療，但化療耐藥嚴(yán)重影響患者療效。因此，尋找新的治療策略或輔助藥物以改善卵巢癌患者預(yù)后至關(guān)重要。

MPA屬于第一代人工合成的孕激素，是臨床常用的避孕、激素治療以及絕經(jīng)后的孕激素替代藥物，且有研究支持MPA可抑制卵巢癌細(xì)胞生長(zhǎng)。孕激素發(fā)揮作用的經(jīng)典通路為與孕激素受體PR-A、PR-B結(jié)合，以二聚體形式與孕激素反應(yīng)元件(Progesterone response element,PRE)相結(jié)合，通過募集共激活子、普通轉(zhuǎn)錄因子和共抑制子與PRE啟動(dòng)子相結(jié)合而啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄，激活靶細(xì)胞內(nèi)調(diào)節(jié)基因的表達(dá)從而產(chǎn)生生物學(xué)效應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，MPA對(duì)PR高表達(dá)卵巢癌細(xì)胞的增殖抑制作用更明顯,進(jìn)一步證實(shí)孕激素主要通過與激素受體結(jié)合發(fā)揮作用。

MG132是一種合成的醛基肽類蛋白酶體抑制劑，具有價(jià)格低廉、作用迅速、可逆的優(yōu)點(diǎn)，其可通過干擾蛋白酶體的活性來抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，是具有潛力的抗癌藥[10-13]。本研究發(fā)現(xiàn)，MG132可抑制HO-8910、SKOV3細(xì)胞的增殖并誘導(dǎo)其凋亡，呈劑量和時(shí)間依賴性下降。這與郭娜等[14]研究一致，MG132可上調(diào)凋亡因子caspase-3、Bim、Bax和自噬基因Beclin-1表達(dá)，下調(diào)凋亡抑制因子Bcl-2表達(dá)，通過促進(jìn)凋亡程序和自噬性死亡的方式來抑制SKOV3細(xì)胞生長(zhǎng)。Zhu等[15]研究發(fā)現(xiàn)，MG132可導(dǎo)致Bik/BNK蛋白家族的積累誘導(dǎo)SKOV3等多種惡性腫瘤細(xì)胞的凋亡。另有研究[16]表明，過表達(dá)的caspase-3可增加MG132誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞凋亡的敏感性。

MG132具有抑制卵巢癌細(xì)胞生長(zhǎng)的作用，其與STAT3信號(hào)通路抑制劑聯(lián)合應(yīng)用時(shí)，可顯示出協(xié)同的抗增殖和誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞凋亡的作用[17]。Li等[18]研究發(fā)現(xiàn)，在3種耐藥的卵巢癌細(xì)胞系中，MG132可顯著提高順鉑的治療作用。本研究發(fā)現(xiàn)，SKOV3細(xì)胞中MG132可明顯增強(qiáng)MPA增殖抑制及誘導(dǎo)凋亡的作用，而在HO-8910細(xì)胞中不存在此作用。Departamento等[19]研究發(fā)現(xiàn)，發(fā)情期大鼠腦袋中PR可通過泛素蛋白酶體途徑(ubiquitin proteasome pathway，UPS)降解且該過程可被MG132抑制。乳腺癌中，CUEDC2通過UPS介導(dǎo)PR降解，抑制由PR介導(dǎo)的MAPK通路的活性，終止了孕激素對(duì)乳腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)的影響[20]。越來越多的證據(jù)表明，PR的表達(dá)可受UPS調(diào)節(jié)，而MG132則可抑制該過程中PR的降解。本研究還發(fā)現(xiàn)，MG132可提升卵巢癌中PR、PR-A、PR-B表達(dá)，進(jìn)一步表明卵巢癌中PR表達(dá)也受UPS的調(diào)節(jié)。因此，推測(cè)在PR低表達(dá)卵巢癌細(xì)胞株SKOV3中，MG132可通過提升PR表達(dá)增強(qiáng)PR所介導(dǎo)的MPA抑制增殖及誘導(dǎo)凋亡的作用，而在PR高表達(dá)細(xì)胞株HO-8910中，由于其本身PR表達(dá)豐富已達(dá)到MPA作用的閾值，故PR表達(dá)雖有上升，仍不影響其對(duì)HO-8910細(xì)胞的作用。

綜上所述，MG132與MPA聯(lián)合用藥可明顯提升MPA對(duì)PR低表達(dá)卵巢癌細(xì)胞SKOV3增殖抑制及誘導(dǎo)凋亡的作用，而其具體機(jī)制則與PR、PR-A、PR-B表達(dá)升高有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)為蛋白酶體抑制劑與孕激素聯(lián)合應(yīng)用于卵巢癌的臨床治療提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。