劉昕 李圓圓 劉紅 李艷 潘靜華 王少君 趙宏艷

中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心 北京市中醫(yī)藥防治重大疾病基礎(chǔ)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100700

破骨細(xì)胞是骨骼系統(tǒng)疾病、骨代謝疾病等研究的常用細(xì)胞。破骨細(xì)胞的培養(yǎng)方法有多種，其中采用小鼠單核巨噬細(xì)胞RAW264.7誘導(dǎo)破骨細(xì)胞的方法，因操作簡(jiǎn)單，誘導(dǎo)形成的破骨細(xì)胞數(shù)目多、均一性好、雜質(zhì)少，且具有良好的骨吸收能力被廣泛應(yīng)用。課題組在文獻(xiàn)研究[1-5]及實(shí)驗(yàn)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，采用小鼠單核巨噬細(xì)胞RAW264.7誘導(dǎo)分化的破骨細(xì)胞表面可見(jiàn)大量未分化細(xì)胞，這影響了破骨細(xì)胞形態(tài)的觀察及功能的檢測(cè)。通過(guò)對(duì)文獻(xiàn)的分析及課題組的前期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)基可能影響小鼠單核巨噬細(xì)胞RAW264.7誘導(dǎo)分化破骨細(xì)胞的過(guò)程?；诖?，本研究擬探討了培養(yǎng)基對(duì)小鼠單核巨噬細(xì)胞RAW264.7誘導(dǎo)生成破骨細(xì)胞的影響。

1 材料和方法

1.1 材料

小鼠單核巨噬細(xì)胞RAW264.7(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細(xì)胞資源中心)；核因子κ B受體活化因子配體(RANKL，美國(guó)R&D公司，貨號(hào)462-TEC，批號(hào)CWA2520083 )；抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色試劑盒(美國(guó)SIGMA公司，貨號(hào)387A-1KT，批號(hào)SLBZ5562)；高糖DMEM培養(yǎng)基(美國(guó)GIBCO公司，貨號(hào)C11885500BT，批號(hào)8121231)；α-MEM培養(yǎng)基(國(guó)家實(shí)驗(yàn)細(xì)胞資源共享服務(wù)平臺(tái)，貨號(hào)202000001，批號(hào)20200102)；二甲基亞砜(DMSO，美國(guó)Sigma公司，貨號(hào)D2660-100 mL，批號(hào)RNBK1994)；牛骨片(美國(guó)IDS公司，貨號(hào)DT-1BON1000-96，批號(hào)J44137)；SYBR Fast qPCR Mix(日本Takara公司，貨號(hào)RR430A，批號(hào)AJF2238A)；PrimeScript RT Master Mix(日本Takara公司，貨號(hào)RR036A，批號(hào)AJ90850A)。

1.2 方法

1.2.1文獻(xiàn)檢索和篩選要求：檢索中國(guó)知網(wǎng)數(shù)據(jù)庫(kù)(CNKI)、萬(wàn)方數(shù)據(jù)庫(kù)、Pub Med數(shù)據(jù)庫(kù)，檢索年限為2011年12月至2021年12月。以“RAW264.7”、“破骨細(xì)胞”、“RANKL”為中文檢索詞，以“RAW264.7”、 “Osteoclast”、“RANKL”為英文檢索詞，使用布爾邏輯“AND”進(jìn)行檢索，分析小鼠單核巨噬細(xì)胞RAW264.7細(xì)胞向破骨細(xì)胞分化的常用培養(yǎng)基。

文獻(xiàn)的納入標(biāo)準(zhǔn)：①納入對(duì)照研究，不限制分組方法；②小鼠單核巨噬細(xì)胞RAW264.7使用RANKL誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞模型。文獻(xiàn)的排除標(biāo)準(zhǔn)：①腺病毒感染、轉(zhuǎn)染后的小鼠單核巨噬細(xì)胞RAW264.7；②共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)；③重復(fù)發(fā)表的文獻(xiàn)只保留一篇；④數(shù)據(jù)報(bào)告不完整；⑤相同培養(yǎng)基文獻(xiàn)數(shù)量少于10篇；⑥會(huì)議論文。

通過(guò)檢索共獲得704篇文獻(xiàn)，排除348篇文獻(xiàn)，最終納入356篇文獻(xiàn)，其中英文153篇，中文203篇。文獻(xiàn)檢索流程見(jiàn)圖1。其中使用DMEM培養(yǎng)基的文獻(xiàn)為225篇；采用DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)、24 h貼壁后改用α-MEM培養(yǎng)基誘導(dǎo)分化的文獻(xiàn)為45篇；采用α-MEM培養(yǎng)基的文獻(xiàn)為86篇。

圖1 文獻(xiàn)檢索流程圖Fig.1 The flow chart of literature search

1.2.2細(xì)胞培養(yǎng)方法及分組：小鼠單核巨噬細(xì)胞RAW264.7用含10 %胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基或含10 %胎牛血清的α-MEM培養(yǎng)基，在37 ℃、5 % CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。待細(xì)胞狀態(tài)良好后，按上述文獻(xiàn)檢索的結(jié)果將本實(shí)驗(yàn)分為3組：DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)和誘導(dǎo)分化組(DMEM組)、DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，24 h貼壁后改用α-MEM培養(yǎng)基誘導(dǎo)分化組(DMEM/α-MEM組)、α-MEM培養(yǎng)基培養(yǎng)和誘導(dǎo)分化組(α-MEM組)。將細(xì)胞分別以2×103個(gè)/孔接種于96孔板、6×104個(gè)/孔接種于6孔板，24 h貼壁后更換為相應(yīng)的含50 ng/mL RANKL的分化培養(yǎng)基，隔天換液一次。

1.2.3破骨細(xì)胞形態(tài)觀察及計(jì)數(shù)方法[6]：TRAP是破骨細(xì)胞的特異性標(biāo)志酶，按上述方法培養(yǎng)至第5 d，采用TRAP染色方法鑒定破骨細(xì)胞。TRAP染色陽(yáng)性且細(xì)胞核大于3個(gè)以上者認(rèn)定為破骨細(xì)胞，在倒置相差顯微鏡下觀察破骨細(xì)胞的形態(tài)并計(jì)數(shù)。

1.2.4破骨細(xì)胞功能的檢測(cè)方法[7]：按上述方法以2×103個(gè)/孔接種于提前放置無(wú)菌骨片的96孔板中，24 h后更換為50 ng/mL RANKL的分化培養(yǎng)基，隔天換液。培養(yǎng)11 d后取出骨片在0.25 mol/L氫氧化銨中超聲清洗5 min，去除骨片表面的細(xì)胞，然后用1 %甲苯胺藍(lán)染色10 min，用蒸餾水沖洗3次。在顯微鏡下觀察骨陷窩形態(tài)并拍照，使用Image pro plus軟件對(duì)骨吸收面積進(jìn)行分析。

1.2.5破骨細(xì)胞分化相關(guān)轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子(NFATc-1、c-Fos、TRAF-6)的表達(dá)：按上述方法以6×104個(gè)/孔密度接種于6孔板中，按上述方法培養(yǎng)5 d后收集各組細(xì)胞。加入Trizol裂解液提取各組RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，采用實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 方法檢測(cè)NFATc-1、c-Fos、TRAF-6 mRNA的表達(dá)。以 GAPDH為內(nèi)參基因，根據(jù)2-△△CT值相對(duì)定量樣本中目的基因表達(dá)水平。引物由上海生工生物工程有限公司設(shè)計(jì)，目的基因引物序列具體見(jiàn)表1。

表1 目的基因引物序列Table 1 Target gene primer sequences

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 不同培養(yǎng)基對(duì)破骨細(xì)胞分化的影響

小鼠單核巨噬細(xì)胞RAW264.7為貼壁細(xì)胞，形態(tài)較小，增殖快。經(jīng)RANKL刺激后，細(xì)胞逐漸聚集成團(tuán)，第3 d開(kāi)始各不同培養(yǎng)基組均可見(jiàn)少量較小的多核細(xì)胞，第5 d均可見(jiàn)大小不等的多核細(xì)胞，形態(tài)不規(guī)則，有的呈煎蛋形、有的呈圓形等，且在多核細(xì)胞表面均可見(jiàn)不同程度未分化細(xì)胞，見(jiàn)圖2。

注：紅色箭頭標(biāo)記的為破骨細(xì)胞。

2.2 不同培養(yǎng)基對(duì)破骨細(xì)胞分化的影響

培養(yǎng)第5 d后，各組均可以觀察到典型的TRAP+破骨細(xì)胞。DMEM組TRAP+破骨細(xì)胞大小不均一，有細(xì)胞脫落的痕跡。此外，在破骨細(xì)胞表面有大量成團(tuán)塊狀的染色呈黑紫色的未分化細(xì)胞。DMEM/α-MEM組和α-MEM組TRAP+破骨細(xì)胞分布較均勻，未見(jiàn)有細(xì)胞脫落的痕跡，且未分化細(xì)胞較少(圖3A)。與DMEM組相比，DMEM/α-MEM組、α-MEM組TRAP+破骨細(xì)胞數(shù)量明顯增加(P<0.01)，DMEM/α-MEM與α-MEM組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖3B)。

注：與DMEM組比較，**P<0.01。

2.3 不同培養(yǎng)基對(duì)破骨細(xì)胞骨吸收功能的影響

骨陷窩可以反映破骨細(xì)胞的骨吸收功能。培養(yǎng)11 d后各組均可以觀察到明顯的骨吸收陷窩，但骨吸收陷窩形態(tài)略有不同。DMEM組骨陷窩邊界不清晰，形態(tài)多為圓形、橢圓形，陷窩染色淡呈紫色，陷窩大小不一，有的可見(jiàn)較大的單個(gè)骨吸收陷窩。DMEM/α-MEM組骨陷窩邊界清楚，呈小圓形，陷窩染色深呈深紫色，單個(gè)骨陷窩面積小，零散分布。α-MEM組骨陷窩邊界清楚，呈小圓形、卵圓形，陷窩染色深呈藍(lán)紫色，單個(gè)骨陷窩面積不大，多個(gè)陷窩聚焦成堆(圖4A)。與DMEM組和DMEM/α-MEM組相比，α-MEM組骨陷窩面積明顯增加(P<0.01)(圖4B)。

注：A ：紅色箭頭標(biāo)記的為骨吸收陷窩；B：與DMEM組比較，**P<0.01；與DMEM/α-MEM組比較，##P<0.01。

2.4 不同培養(yǎng)基對(duì)破骨細(xì)胞分化因子的影響

不同培養(yǎng)基組均可以檢測(cè)到破骨細(xì)胞分化相關(guān)轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子NFATc-1、c-Fos、TRAF-6 mRNA的表達(dá)。與DMEM組相比，α-MEM組NFATc-1、c-Fos和TRAF-6 mRNA表達(dá)顯著增加(P<0.01，P<0.05)；DMEM/α-MEM組與DMEM組相比，NFATc-1 mRNA表達(dá)顯著增加(P<0.01)，c-Fos和TRAF-6 mRNA表達(dá)有增加的趨勢(shì)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。α-MEM組與DMEM/α-MEM組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖5)。

3 討論

小鼠單核巨噬細(xì)胞RAW264.7誘導(dǎo)分化為破骨細(xì)胞受多種因素的影響[8-10]，如傳代次數(shù)、接種濃度、RANKL 濃度、誘導(dǎo)時(shí)間、培養(yǎng)基等。在諸多影響因素中，培養(yǎng)基是最容易被忽視的一個(gè)環(huán)節(jié)。通過(guò)文獻(xiàn)研究我們發(fā)現(xiàn)，使用最多的是高糖DMEM培養(yǎng)基、其次是α-MEM培養(yǎng)基，還有的文獻(xiàn)采用高糖DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)、24 h貼壁后改用α-MEM培養(yǎng)基分化。通過(guò)本研究，我們證實(shí)在RANKL 存在的條件下，以上3種培養(yǎng)基均可誘導(dǎo)小鼠單核巨噬細(xì)胞RAW264.7分化成破骨細(xì)胞，但破骨細(xì)胞形態(tài)、破骨細(xì)胞分化因子的表達(dá)水平及破骨細(xì)胞骨吸收功能不盡相同。與高糖DMEM培養(yǎng)基相比，α-MEM分化培養(yǎng)基中成熟的破骨細(xì)胞數(shù)量及破骨細(xì)胞分化相關(guān)因子明顯的表達(dá)增加、破骨細(xì)胞骨吸收功能也明顯增強(qiáng)。這與曾汝君等[11]研究結(jié)果一致，但是研究中具有典型的破骨細(xì)胞形態(tài)的細(xì)胞減少，且沒(méi)有做破骨細(xì)胞骨吸收功能的檢測(cè)。形態(tài)差異的原因可能與細(xì)胞傳代次數(shù)、接種濃度等因素有關(guān)。

通過(guò)文獻(xiàn)研究我們發(fā)現(xiàn)，小鼠單核巨噬細(xì)胞RAW264.7誘導(dǎo)分化破骨細(xì)胞使用最多的是高糖DMEM培養(yǎng)基，這可能與美國(guó)模式培養(yǎng)物保藏所(ATCC)推薦高糖DMEM培養(yǎng)基為該細(xì)胞培養(yǎng)基有關(guān)。許丹等[12]研究也表明用α-MEM培養(yǎng)基培養(yǎng)小鼠單核巨噬細(xì)胞RAW264.7時(shí)，會(huì)出現(xiàn)細(xì)胞貼壁不牢的現(xiàn)象；且與低糖型 DMEM 相比，用高糖DMEM 培養(yǎng)的小鼠單核巨噬細(xì)胞RAW264.7 傳代后貼壁更快，細(xì)胞生長(zhǎng)速度更快。所以較多研究采用高糖 DMEM 培養(yǎng)小鼠單核巨噬細(xì)胞RAW264.7。但也有文獻(xiàn)采用α-MEM培養(yǎng)基，這可能與培養(yǎng)目的有關(guān)。當(dāng)小鼠單核巨噬細(xì)胞RAW264.7 用于誘導(dǎo)破骨細(xì)胞實(shí)驗(yàn)時(shí)，α-MEM培養(yǎng)基比高糖DMEM培養(yǎng)基更適合。高糖DMEM培養(yǎng)基(葡萄糖濃度為25 mmol/L)與α-MEM培養(yǎng)基(葡萄糖濃度為5.6 mmol/L)在成份上最主要的差別是葡萄糖濃度的不同。Karner 等[13]研究表明，當(dāng)葡萄糖濃度為5 mmol/L時(shí)，破骨細(xì)胞生成效果最佳，而高濃度的葡萄糖，雖然可以最大程度地刺激了細(xì)胞增殖，但其破骨細(xì)胞生成效果較低。

本研究也發(fā)現(xiàn)采用高糖DMEM培養(yǎng)基不僅抑制了破骨細(xì)胞的分化，還導(dǎo)致小鼠單核巨噬細(xì)胞RAW264.7 過(guò)快的增殖，這些增殖的細(xì)胞粘附于破骨細(xì)胞表面，從而影響了破骨細(xì)胞的分化及功能。DMEM/α-MEM組雖然破骨細(xì)胞形態(tài)與未分化細(xì)胞數(shù)量介于DMEM與α-MEM組之間，但是骨吸收功能明顯弱于α-MEM組，可能是培養(yǎng)基的突然更換，雖然對(duì)破骨細(xì)胞形態(tài)影響不明顯，但分化因子的表達(dá)及骨吸收功能仍未達(dá)到α-MEM組水平。本研究結(jié)果表明，在采用小鼠單核巨噬細(xì)胞RAW264.7 誘導(dǎo)分化破骨細(xì)胞的研究中，α-MEM比高糖DMEM更適合做為破骨細(xì)胞的分化培養(yǎng)基。