黃景文 李生強(qiáng) 陳玄 謝麗華 陳賽楠 黃小彬 葛繼榮

福建省中醫(yī)藥科學(xué)院，福建 福州 350001

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis，OP)與腎精虧虛、脾氣虛弱有相當(dāng)密切的關(guān)系[1-2]，因此中醫(yī)理論指導(dǎo)下，課題組選用續(xù)苓健骨方來治療骨質(zhì)疏松癥。本方主要出自于《中醫(yī)傷科學(xué)講義》續(xù)骨活血湯和《古今醫(yī)鑒》清熱調(diào)血湯，具有補(bǔ)腎壯骨、健脾益氣、活血止痛的功效，其臨床療效明確[3]，前期研究已確定部分機(jī)制[4-6]，但主要作用機(jī)制尚不明確。因此，課題組通過對OP大鼠模型進(jìn)行體內(nèi)研究，利用基因表達(dá)譜芯片篩選各組間差異表達(dá)基因，尋找相關(guān)的作用靶點(diǎn)和信號通路，為續(xù)苓健骨方治療OP提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

SPF級雌性SD大鼠15只，6月齡，由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動物有限責(zé)任公司提供，實(shí)驗(yàn)動物許可證號：SCXK(滬)2007-0005。飼養(yǎng)于福建省中醫(yī)藥科學(xué)院比較醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心，合格證號：SYXK(閩)2009-000。

1.2 藥品與試劑

續(xù)苓健骨方由 12 味中藥組成(續(xù)斷、白術(shù)、紅花、陳皮、赤芍等)，購自福建省鷺燕醫(yī)藥有限公司，傳統(tǒng)方法熬制，每劑中藥含量為1.5 g/mL，取汁81.33 mL，4 ℃保存。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器

NanoDrop ND-1000(上?？党缮镉邢薰?；Agilent DNA Microarray Scanner(part number G2505C)(上?？党缮镉邢薰?。

1.4 模型制備

參考文獻(xiàn)[7-8]方法，配制4 %戊巴比妥鈉，根據(jù)體重以0.22 mL/100 g進(jìn)行腹腔注射麻醉，腹部開口，切除大鼠雙側(cè)卵巢，造模后連續(xù)3 d使用青霉素預(yù)防感染。假手術(shù)組同法但是不切除卵巢。

1.5 分組與給藥

隨機(jī)將15只大鼠分為假手術(shù)組、模型組和續(xù)苓健骨方組，每組5只。造模后1周后開始灌胃給藥，給藥周期為連續(xù)13周，根據(jù)體重調(diào)整給予藥物量，續(xù)苓健骨方組灌胃1 mL/100 g，每日1次；假手術(shù)組和模型組按1 mL/100 g灌胃生理鹽水，每日1次。

1.6 樣本制備

13周后，所有大鼠腹腔注射10 %水合氯醛麻醉后，取雙側(cè)股骨，生理鹽水浸濕紗布并包裹左側(cè)股骨保存于-20 ℃，實(shí)驗(yàn)前取出，低溫下研磨加入TRIZOL于液氮速凍后放-80 ℃保存，備用。

1.7 RNA提取及測序

將3組樣本，共15個樣本，送至上海康成生物有限公司進(jìn)行RNA提取、基因表達(dá)譜芯片掃描和差異表達(dá)基因分析及功能分析。

1.8 差異表達(dá)基因分析

樣品處理，利用Agilent Feature Extraction軟件(v11.0.1.1) 讀取芯片圖獲得原始數(shù)據(jù)。使用GeneSpring GX v12.1軟件(Agilent Technologies)對原始數(shù)據(jù)進(jìn)行Quantile標(biāo)準(zhǔn)化和隨后的數(shù)據(jù)處理。原始數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化后經(jīng)過篩選高質(zhì)量探針(某探針在15個樣品中至少有5個被標(biāo)記為Detected)進(jìn)行進(jìn)一步分析。樣品間具有統(tǒng)計學(xué)意義的差異表達(dá)基因通過火山圖篩選。設(shè)置丨log2 Fold change丨≥1，q<0.05篩選組間差異表達(dá)基因。使用R腳本進(jìn)行層次聚類。使用標(biāo)準(zhǔn)的富集計算方法進(jìn)行GO分析和Pathway分析。

2 結(jié)果

2.1 基因表達(dá)芯片分析結(jié)果

實(shí)驗(yàn)共掃描15 828個表達(dá)基因，模型組(OVX組)相比假手術(shù)組(Sham)通過顯著性分析獲得1 336個表達(dá)差異的基因(丨log2 Fold change丨≥1，q<0.05)，其中上調(diào)623個基因，下調(diào)713個基因。實(shí)驗(yàn)組(XU組)相比模型組共篩選出1 673個差異表達(dá)的基因，上調(diào)1 060個基因，下調(diào)613個基因，見圖1、圖2。

注：紅色為基因表達(dá)上調(diào)，綠色為基因表達(dá)下調(diào)；A：Sham組與OVX組差異表達(dá)熱圖，B：XU組與OVX組差異表達(dá)熱圖。

注：紅色代表基因表達(dá)上調(diào)，綠色代表基因表達(dá)下調(diào)；橫坐標(biāo)為基因的差異倍數(shù)，縱坐標(biāo)為差異表達(dá)的顯著性水平。A：Sham組和OVX組對比；B：OVX組和XU組對比。

2.2 組間差異表達(dá)基因GO分析

通過將Sham組和OVX組的差異表達(dá)基因與OVX組和XU組的差異表達(dá)基因進(jìn)行分析(丨log2 Fold change丨≥1，q<0.05)，篩選出10個造模后表達(dá)顯著降低但是用藥后顯著提高的基因，218個造模后表達(dá)顯著提高但是用藥后表達(dá)顯著降低的基因。將篩選的228個基因進(jìn)行GO分析，發(fā)現(xiàn)差異表達(dá)基因與生物過程相關(guān)的GO條目有326條，主要集中在應(yīng)激反應(yīng)和細(xì)胞間通訊上，細(xì)胞組分有29條，主要集中在細(xì)胞連接和質(zhì)膜轉(zhuǎn)運(yùn)功能上，分子功能有66條，主要集中在跨膜活性上。表達(dá)基因結(jié)果顯示生物過程(表1)、細(xì)胞組分(表2)、分子功能(表3)取前10的富集項(xiàng)，如圖3。

表1 GO分析生物過程富集結(jié)果前十Table 1 top ten biological process enrichment results of GO analysis

表2 GO分析細(xì)胞組分富集結(jié)果前十Table 2 top ten cell component enrichment results of GO analysis

表3 GO分析分子功能富集結(jié)果前十Table 3 top ten molecular functional enrichment results of GO analysis

注：橫坐標(biāo)為GO富集項(xiàng)，縱坐標(biāo)為富集顯著性。

2.4 差異表達(dá)基因的KEGG富集分析

對228個差異基因進(jìn)行KEGG富集分析，差異表達(dá)基因富集到36條通路，主要參與癌癥通路、PI3K-Akt信號通路、長效抑制過程、軸突引導(dǎo)、生熱作用等通路(見圖5)。文獻(xiàn)檢索發(fā)現(xiàn)其中PI3K-Akt通路與骨質(zhì)疏松癥密切相關(guān)。

2.5 組間差異表達(dá)基因分析

將228個差異表達(dá)基因進(jìn)一步進(jìn)行篩選(丨log2 Fold change丨≥2，q<0.01)，共選出4個顯著差異基因，4個均為造模后表達(dá)顯著提高但是用藥后表達(dá)顯著降低的基因，見表5。

表4 與骨質(zhì)疏松癥密切相關(guān)的顯著性富集通路Table 4 Significant enrichment pathways closely related to osteoporosis

表5 組間差異表達(dá)基因Table 5 differentially expressed genes between groups

注：橫坐標(biāo)為富集顯著性，縱坐標(biāo)為KEGG通路名稱。

3 討論

課題組利用基因表達(dá)譜芯片對骨質(zhì)疏松癥模型組、假手術(shù)組和使用續(xù)苓健骨方治療的實(shí)驗(yàn)組股骨組織進(jìn)行測序，結(jié)果分析表明，Sham組和OVX組有1 336個差異表達(dá)基因(丨log2 Fold change丨≥1，q<0.05)，其中上調(diào)623個基因，下調(diào)713個基因。OVX組和XU組有1 673個差異表達(dá)基因，其中上調(diào)基因有1 060個，下調(diào)基因有613個。將各組間芯片結(jié)果進(jìn)行分析，篩選出10個造模后表達(dá)顯著降低但是用藥后顯著提高的基因，218個造模后表達(dá)顯著提高但是用藥后表達(dá)顯著降低的基因。將篩選的228個基因進(jìn)行GO分析，發(fā)現(xiàn)差異表達(dá)基因在生物過程中、應(yīng)激反應(yīng)、細(xì)胞間通訊所占比例最多；在細(xì)胞組分中，主要與細(xì)胞連接、神經(jīng)元突觸功能組成相關(guān)；在分子功能中，主要參與跨膜活性功能。將KEGG富集分析到的前十通路進(jìn)行分析，與骨質(zhì)疏松癥密切相關(guān)的顯著性富集通路有PI3K-Akt通路等。其中通路主要相關(guān)基因有MAPK3、MYC、TP53等。PI3K-Akt信號通路被認(rèn)為是包括軟骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞等細(xì)胞分化的關(guān)鍵途徑。體內(nèi)外研究均表明PI3K-Akt細(xì)胞信號通路在治療骨質(zhì)疏松癥中的主要功能是促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖、分化和骨形成[9]。MAPK3有研究表明其參與的MAPK通路被證實(shí)參與骨代謝調(diào)節(jié)過程。MYC蛋白有延緩衰老的功能，其治療骨質(zhì)疏松癥的機(jī)制主要在于同時能促進(jìn)成骨分化，抑制破骨分化[10]。TP53編碼的P53可以通過miRNA信號通路影響骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的功能來影響成骨細(xì)胞，敲低P53能部分反轉(zhuǎn)骨密度的降低[11]。課題組前期實(shí)驗(yàn)表明續(xù)苓健骨方可以上調(diào)骨形成基因的表達(dá)，促進(jìn)成骨細(xì)胞MC3T3-E1的成骨能力，但作用通路不明確[5]，本芯片研究發(fā)現(xiàn)續(xù)苓健骨方治療骨質(zhì)疏松癥的機(jī)制可能與PI3K-Akt信號通路促進(jìn)成骨分化相關(guān)，因此基因表達(dá)譜芯片實(shí)驗(yàn)對前期實(shí)驗(yàn)的通路不明進(jìn)行了補(bǔ)充，為后續(xù)進(jìn)一步深入研究提供了方向。

在差異表達(dá)基因分析中，Dnajb6是熱休克蛋白超家族之一，其參與線粒體凋亡途徑，與肌肉營養(yǎng)不良[12]、食管癌細(xì)胞增殖生長[13]等能量代謝相關(guān)疾病密切相關(guān)；LOC102548682是組蛋白H4相關(guān)的編碼基因，功能主要與控制細(xì)胞周期相關(guān)[14]；Rplp0參與多種生理和病理的過程，包括腫瘤的發(fā)生發(fā)展等[15]；Cnpy2可作為肝癌的治療靶點(diǎn)[16]；目前以上4個基因暫時還沒發(fā)現(xiàn)有與骨質(zhì)疏松癥相關(guān)的報道。但是文獻(xiàn)挖掘發(fā)現(xiàn)有研究[17]表明Rplp0的缺失能導(dǎo)致活性氧(ROS)的積累，激活MAPK1/ERK2信號通路，有大量研究[18]表明MAPK1/ERK2的激活能促進(jìn)成骨基因表達(dá)和成骨細(xì)胞的增殖，同時也有研究[19]發(fā)現(xiàn)Cnpy2的過表達(dá)能激活A(yù)kt/GSK3β通路，降低GSK3β的表達(dá)，有研究[20]發(fā)現(xiàn)抑制Akt/GSK3β通路，促進(jìn)GSK3β表達(dá)能調(diào)控促進(jìn)骨髓基質(zhì)細(xì)胞的增殖，對成骨細(xì)胞凋亡產(chǎn)生抑制。因此綜上所述，Rplp0和Cnpy2其有可能是OP相關(guān)靶點(diǎn)之一，且也可能是續(xù)苓健骨方治療OP的關(guān)鍵基因。

傳統(tǒng)中藥歷史悠久，越來越多的臨床文獻(xiàn)報道中藥治療骨質(zhì)疏松具有療效明顯且不良反應(yīng)相對較少的特點(diǎn)，但是中藥治療骨質(zhì)疏松癥的治療機(jī)制和骨質(zhì)疏松癥的具體發(fā)病機(jī)制都較為復(fù)雜。隨著芯片技術(shù)在基因表達(dá)水平研究上的普及，研究疾病機(jī)制和藥物治療機(jī)制有了新的手段。雖然本研究樣本量較少，有一定的局限性，需要進(jìn)一步進(jìn)行驗(yàn)證，但是分析結(jié)果為今后的研究提供了新的思路。