楊博辰 付學(xué)敬 朱琳

河南中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院骨傷科，河南 鄭州 450000

膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎(knee osteoarthritis, KOA)是臨床上常見的一種慢性、退行性骨關(guān)節(jié)疾病，主要病理特征為骨質(zhì)疏松、滑膜炎癥以及軟骨退化變性、軟骨細(xì)胞凋亡等[1]，研究[2]表明KOA發(fā)病率與致殘率隨全球老齡化程度加深，呈上升趨勢，嚴(yán)重威脅人們的生命健康以及生活質(zhì)量。KOA發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，遺傳、創(chuàng)傷、肥胖以及年齡等都能夠?qū)е翶OA的發(fā)生[3]。目前相關(guān)研究[4]認(rèn)為炎癥反應(yīng)以及軟骨重建異常等在KOA的發(fā)生發(fā)展中起著關(guān)鍵作用。絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)信號通路包括ERK、c-Jun-N末端激酶(c-Jun-N-terminal kinase, JNK)以及p38 MAPK信號通路，其能夠參與調(diào)控炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激、細(xì)胞分化與凋亡等多種生理病理過程[5-6]，但JNK/p38 MAPK信號通路對軟骨重建的影響尚不清晰。紫云英苷是一種黃酮類化合物，是中藥杜仲的主要活性成分，具有神經(jīng)保護(hù)、抗菌、抗炎以及抗氧化作用，目前紫云英苷臨床上被用于多種疾病的治療[7]。研究[8]表明，紫云英苷能夠抑制膠原纖維形成，改善小鼠關(guān)節(jié)炎以及抑制滑膜細(xì)胞的炎癥反應(yīng)和骨破壞。本研究通過建立KOA模型，探究紫云英苷對KOA大鼠的保護(hù)作用以及對JNK/p38 MAPK信號通路的影響，為臨床治療KOA提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動物：90只SD雌性大鼠，6周齡，體質(zhì)量(180±20)g，購于北京科宇動物養(yǎng)殖中心，許可證號為SCXK(京)2018-0010。

1.1.2實(shí)驗(yàn)藥物與試劑：紫云英苷(YRZ019, 成都儀睿生物科技有限公司)；塞來昔布(B14201006862, 輝瑞制藥有限公司)；IL-1β(SP12225)、IL-6(SP12279)、TNF-α(SP12250)ELISA試劑盒(武漢賽培生物科技有限公司)；HE染色試劑盒(G1120, 北京索萊寶生物技術(shù)有限公司)；TGF-β1 ELISA試劑盒(ER013-96, 上海依科賽生物科技有限公司)；MMP-3 ELISA試劑盒(ER1164, 武漢菲恩生物科技有限公司)；p-JNK(ab124956)、JNK(ab179461)、p-p38 MAPK(ab4822)、p38 MAPK(ab170099)一抗、羊抗兔IgG(HRP, ab205718)(英國Abcam公司)。

1.1.3實(shí)驗(yàn)儀器：游標(biāo)卡尺(上海輔澤商貿(mào)有限公司)；PV-200足趾容積儀(成都泰盟軟件有限公司)；NB2000生物顯微鏡(南京先納光學(xué)儀器有限公司)；QuickGel 6100凝膠成像系統(tǒng)(北京必吉生物科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1模型建立與分組給藥：90只SD大鼠按照隨機(jī)數(shù)字表法分為假手術(shù)組、模型組、塞來昔布組、紫云英苷低、中、高劑量組，每組15只。參照文獻(xiàn)[9]采用改良Huith法建立KOA模型：麻醉大鼠，仰臥位固定備皮，消毒后在右側(cè)膝關(guān)節(jié)髕骨旁內(nèi)側(cè)開一2 cm左右小口，暴露關(guān)節(jié)腔，將膝關(guān)節(jié)前交叉、內(nèi)側(cè)副韌帶依次剪斷，摘除半月板，清洗消毒后逐層縫合，注意造模過程中不要傷及其他組織與軟骨。假手術(shù)組僅打開關(guān)節(jié)腔，不做上述處理。術(shù)后連續(xù)1周注射青霉素，之后開始驅(qū)趕大鼠活動，驅(qū)趕4周后開始給藥。塞來昔布組灌胃18 mg/kg塞來昔布膠囊水溶液[10]，紫云英苷低、中、高劑量組分別灌胃25、50、100 mg/kg紫云英苷[11]，每日1次，連續(xù)灌胃6周。模型組與假手術(shù)組給予相同劑量的蒸餾水。

1.2.2各組大鼠膝關(guān)節(jié)直徑及足趾容積的測量：給藥結(jié)束后用游標(biāo)卡尺對大鼠膝關(guān)節(jié)直徑進(jìn)行測量；運(yùn)用足趾容積儀對大鼠足趾容積進(jìn)行測量。每個指標(biāo)測量3次，取平均值作為最終結(jié)果。

1.2.3各組大鼠血清中IL-1β、IL-6、TNF-α水平的檢測：實(shí)驗(yàn)結(jié)束后麻醉大鼠，取尾靜脈血約2 mL，離心分離血清，嚴(yán)格按照ELISA試劑盒說明書進(jìn)行操作，檢測各組大鼠血清中IL-1β、IL-6、TNF-α水平。

1.2.4各組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織病理變化的觀察：每組取5只大鼠，處死后分離膝關(guān)節(jié)軟骨組織，置于4 %多聚甲醛中固定，采用15 % EDTA溶液進(jìn)行脫鈣處理，脫鈣3周后經(jīng)常規(guī)脫水、石蠟包埋、切片、脫蠟、透明等操作后，采用HE染色，光鏡下觀察組織病理學(xué)變化。

1.2.5各組大鼠軟骨組織中TGF-β1、MMP-3水平的檢測：每組取5只大鼠，處死后取膝關(guān)節(jié)軟骨組織制備組織勻漿備用。按照試劑盒說明書操作檢測各組大鼠軟骨組織中TGF-β1、MMP-3水平。

1.2.6各組大鼠軟骨組織中JNK/p38 MAPK信號通路相關(guān)蛋白的表達(dá)：處死剩余大鼠分離膝關(guān)節(jié)軟骨組織，加入蛋白裂解液提取總蛋白，采用BCA法測定總蛋白濃度，取30 μg蛋白上樣進(jìn)行電泳、轉(zhuǎn)膜；加入5 %脫脂牛奶封閉1 h，清洗后加入p-JNK、JNK、p-p38 MAPK、p38 MAPK一抗，4 ℃孵育過夜，清洗后加入二抗，室溫孵育2 h，清洗后采用ECL發(fā)光液顯色，凝膠成像系統(tǒng)拍照，以β-actin為內(nèi)參，分析條帶灰度值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 紫云英苷對KOA大鼠膝關(guān)節(jié)直徑與足趾容積的影響

與假手術(shù)組比較，模型組大鼠膝關(guān)節(jié)直徑與足趾容積明顯變大(P<0.05)；與模型組比較，塞來昔布組與紫云英苷各劑量組大鼠膝關(guān)節(jié)直徑與足趾容明顯縮小(P<0.05)，紫云英苷各劑量組間具有劑量效應(yīng)(P<0.05)，紫云英苷高劑量組與塞來昔布組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)果見圖1。

圖1 各組大鼠膝關(guān)節(jié)直徑與足趾容積的比較(*P<0.05)Fig.1 Comparison of knee joint diameter and toe volume of rats in each group (*P<0.05)

2.2 紫云英苷對KOA大鼠血清中IL-1β、IL-6、TNF-α水平的影響

與假手術(shù)組比較，模型組大鼠血清中IL-1β、IL-6、TNF-α水平顯著升高(P<0.05)；與模型組比較，塞來昔布組與紫云英苷各劑量組大鼠血清中IL-1β、IL-6、TNF-α水平顯著降低(P<0.05)，紫云英苷各劑量組間具有劑量效應(yīng)(P<0.05)；與塞來昔布組比較，紫云英高劑量組大鼠血清中IL-1β、IL-6、TNF-α水平變化差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)果見圖2。

圖2 各組大鼠血清中IL-1β、IL-6、TNF-α含量的比較(*P<0.05)Fig.2 Comparison of serum IL-1β, IL-6 and TNF-α contents among all groups (*P<0.05)

2.3 紫云英苷對KOA大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織病理變化的影響

HE染色結(jié)果顯示，假手術(shù)組大鼠軟骨細(xì)胞形態(tài)正常、排列有序，細(xì)胞核完整，未見病變；模型組大鼠軟骨組織表面被破壞，組織層變薄，細(xì)胞數(shù)量減少且排列紊亂，潮線被大量破壞；與模型組比較，塞來昔布組與紫云英苷各劑量組軟骨細(xì)胞數(shù)量增加，組織層增厚，部分潮線被破壞，軟骨組織表面逐漸恢復(fù)。紫云英苷各劑量組隨著劑量增加，軟骨組織病變逐漸減輕。結(jié)果見圖3。

圖3 各組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織病理變化(HE, 400×)Fig.3 Pathological changes of knee cartilage in each group (HE, 400×)

2.4 紫云英苷對KOA大鼠軟骨組織中TGF-β1、MMP-3水平的影響

與假手術(shù)組比較，模型組大鼠軟骨組織中TGF-β1、MMP-3水平顯著升高(P<0.05)；與模型組比較，塞來昔布組與紫云英苷各劑量組大鼠軟骨組織中TGF-β1、MMP-3水平顯著降低(P<0.05)；紫云英苷各劑量組間具有劑量效應(yīng)(P<0.05)，紫云英苷高劑量組與塞來昔布組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)果見圖4。

圖4 各組大鼠軟骨組織中TGF-β1、MMP-3含量的比較(*P<0.05)Fig.4 Comparison of TGF-β1 and MMP-3 contents in cartilage tissues of rats in each group (*P<0.05)

2.5 紫云英苷對KOA大鼠軟骨組織中JNK/p38 MAPK信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

與假手術(shù)組比較，模型組大鼠軟骨組織中p-JNK/JNK、p-p38 MAPK/p38 MAPK比值顯著升高(P<0.05)；與模型組比較，塞來昔布組與紫云英苷各劑量組大鼠軟骨組織中p-JNK/JNK、p-p38 MAPK/p38 MAPK比值顯著降低(P<0.05)；隨著紫云英苷劑量增加，上述指標(biāo)逐漸降低(P<0.05)，紫云英苷高劑量組與塞來昔布組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)果見圖5。

圖5 各組大鼠軟骨組織中JNK、p-JNK、p38MAPK、p-p38MAPK蛋白表達(dá)(*P<0.05)Fig.5 Protein expressions of JNK, P-JNK, p38MAPK and P-P38MAPK in cartilage tissues of rats in each group (*P<0.05)

3 討論

KOA多發(fā)于中老年，因其較高的發(fā)病率與致殘率受到了國內(nèi)外醫(yī)學(xué)界的廣泛關(guān)注，目前臨床上對于KOA的治療效果不夠理想，因此尋找更有效的KOA防治手段成為近年來的研究熱點(diǎn)。越來越多的研究[12-13]證實(shí)，KOA主要病理表現(xiàn)為關(guān)節(jié)軟骨進(jìn)行性退變，由于關(guān)節(jié)磨損導(dǎo)致軟骨細(xì)胞分化異常，引起炎性因子分泌過多，誘導(dǎo)關(guān)節(jié)軟骨組織以及血液中炎癥反應(yīng)過度。本研究結(jié)果顯示，KOA模型大鼠軟骨組織表面被破壞，組織層變薄，細(xì)胞數(shù)量減少且排列紊亂，潮線被大量破壞，大鼠膝關(guān)節(jié)直徑與足趾容積變大，提示KOA模型建立成功，血清中IL-1β、IL-6、TNF-α水平顯著升高，提示炎癥反應(yīng)持續(xù)發(fā)生，誘導(dǎo)膝關(guān)節(jié)軟骨退變。另外研究[14]發(fā)現(xiàn)，MMPs能夠通過刺激軟骨細(xì)胞外基質(zhì)蛋白分解酶表達(dá)，促進(jìn)軟骨代謝，加重KOA損傷。TGF-β1在KOA的發(fā)生發(fā)展中也起到加速降解軟骨細(xì)胞外基質(zhì)蛋白降解的功能，誘導(dǎo)單核細(xì)胞和成纖維細(xì)胞分化，在KOA中發(fā)揮關(guān)鍵作用[15]。這與本研究結(jié)果一致，KOA大鼠軟骨組織中TGF-β1、MMP-3水平升高，提示KOA大鼠體內(nèi)發(fā)生炎癥反應(yīng)，軟骨細(xì)胞外基質(zhì)蛋白被分解，軟骨重建受阻，KOA損傷加劇。

中藥價格低廉、不良反應(yīng)小，在KOA的治療中具有明顯的優(yōu)勢，紫云英苷作為一類黃酮類化合物，具有廣泛的藥理活性，對于多種疾病均具有理想的治療效果[16]，在炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激以及組織纖維化過程中發(fā)揮重要的藥理特性[17-18]，其能夠顯著抑制炎性因子釋放，減輕細(xì)胞凋亡。本研究中，低、中、高劑量紫云英苷干預(yù)后的KOA大鼠軟骨組織受損減輕，大鼠膝關(guān)節(jié)直徑與足趾容積縮?。谎逯醒仔砸蜃铀揭约败浌墙M織中TGF-β1、MMP-3水平逐漸降低，表明紫云英苷能夠有效改善KOA大鼠軟骨細(xì)胞損傷，減輕炎癥反應(yīng)，促進(jìn)潤谷重建，保護(hù)KOA大鼠軟骨組織。塞來昔布是臨床上緩解骨關(guān)節(jié)炎、治療急性疼痛的一種口服藥[19]，本研究中塞來昔布作為紫云英苷的陽性藥物，表明紫云英苷在治療KOA中與其效果一致。

MAPK蛋白家族在細(xì)胞中通過調(diào)控多種基因轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)，參與細(xì)胞分化、增殖與凋亡等生理病理過程[20]。JNK是MAPK蛋白家族的一員，在細(xì)胞中參與炎性反應(yīng)、氧化應(yīng)激以及免疫平衡等[21]。研究[22]表明，JNK與p38 MAPK在KOA的發(fā)生與發(fā)展中發(fā)揮重要作用。本研究結(jié)果顯示，KOA模型大鼠軟骨組織中p-JNK/JNK、p-p38 MAPK/p38 MAPK比值升高，提示JNK/p38 MAPK通路被激活，軟骨組織損傷加重。而不同劑量紫云英苷干預(yù)后KOA大鼠軟骨組織中p-JNK/JNK、p-p38 MAPK/p38 MAPK比值降低，說明紫云英苷能夠下調(diào)JNK、p38 MAPK磷酸化蛋白表達(dá)，抑制JNK/p38 MAPK通路激活，從而改善KOA大鼠軟骨組織損傷。

綜上所述，紫云英苷改善軟骨組織病變，抑制炎癥反應(yīng)，促進(jìn)軟骨重建，發(fā)揮KOA大鼠保護(hù)作用，可能與抑制JNK/p38 MAPK通路激活有關(guān)。紫云英苷對于臨床治療KOA具有潛在的可能性，但由于其在KOA中的應(yīng)用仍處于探索階段，具體機(jī)制還需要進(jìn)一步深入研究。