努爾孜亞·亞力買買提，羅 影，郝敬喆，祁顥萱，裴龍英，孫春花,賈文捷，賈培松

(1. 新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所/農(nóng)業(yè)部西北荒漠綠洲作物有害生物綜合治理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，烏魯木齊 830091；2. 新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)，烏魯木齊 830091；3. 新疆理工學(xué)院，新疆阿克蘇 843000；4.青河縣農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣中心，新疆阿勒泰 836200)

0 引 言

【研究意義】阿魏菇(Pleurotusferulae) 具有極高的食藥用價(jià)值，是一種有良好市場(chǎng)前景的野生食用菌[1]。我國(guó)阿魏菇野生資源僅分布在新疆北疆地區(qū)的戈壁阿魏灘上，生長(zhǎng)在阿魏屬植物根莖部，分布量稀少[2-3]。近些年阿魏屬植物分布面積極度萎縮[4-5]，以阿魏屬植物為營(yíng)養(yǎng)的野生阿魏菇，亟待保護(hù)[6-7]。目前，阿魏菇雖已大量栽培，但是由于國(guó)內(nèi)人工栽培時(shí)間較久，商品阿魏菇存在種性不穩(wěn)定、菌種退化等問題[8]，加強(qiáng)對(duì)阿魏菇新品種進(jìn)行選育、種質(zhì)資源的保護(hù)迫在眉睫?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】當(dāng)前核心問題是怎樣提純復(fù)壯菌種[9]。優(yōu)化培養(yǎng)基法、出菇組織再分離法是傳統(tǒng)的菌種提純復(fù)壯方式。其中，優(yōu)化培養(yǎng)基法操作簡(jiǎn)單、耗費(fèi)時(shí)間短，但效果不明顯；出菇組織再分離法效果好，但周期長(zhǎng)、過程復(fù)雜。然而原生質(zhì)體單核化技術(shù)提純復(fù)壯菌絲比上述方式效果更好。原生質(zhì)體技術(shù)是現(xiàn)代農(nóng)業(yè)生物技術(shù)的一個(gè)重要分支[10-11]，原慧等[12]研發(fā)出新疆野生阿魏菇(P.ferulae)的原生質(zhì)體高效分離與再生工藝，所得阿魏菇原生質(zhì)體恢復(fù)能力較強(qiáng)；樊曉琳等[13]通過該技術(shù)成功地對(duì)雙孢蘑菇As2796實(shí)現(xiàn)復(fù)壯；譚琦等[14]將香菇野生種7號(hào)、栽培種Le l當(dāng)做親本，通過此項(xiàng)技術(shù)對(duì)申香8號(hào)展開選育；吳小平等[15]同樣利用改技術(shù)獲得了24個(gè)優(yōu)良的靈芝菌種。江玉姬等[16]證實(shí)，原生質(zhì)體單核化技術(shù)是對(duì)白色金針菇品種具改良作用的新工藝。交配型測(cè)定是控制菌種單孢雜交或單雙雜交的交配、結(jié)實(shí)等關(guān)鍵遺傳過程的決定步驟，2個(gè)異宗聯(lián)合的菌株間交配因子的異同差異，是判別2個(gè)菌株親緣關(guān)系遠(yuǎn)近和遺傳距離的重要指標(biāo)[10]。拮抗現(xiàn)象是反映菌株間遺傳差異以及同緣關(guān)系的主要性狀[17-18]，是物種之間為保持種群遺傳物質(zhì)穩(wěn)定而限制外源基因侵入的本能反應(yīng)，該現(xiàn)象在自然界普遍存在以防止不同個(gè)體間的融合[19]。【本研究切入點(diǎn)】雖然食用菌育種領(lǐng)域已普遍應(yīng)用原生質(zhì)體單核化技術(shù)，但是，目前應(yīng)用原生質(zhì)體單核化技術(shù)對(duì)新疆野生阿魏菇菌種進(jìn)行提純復(fù)壯還缺乏系統(tǒng)深入的研究。需研究利用原生質(zhì)體單核化技術(shù)獲得具有優(yōu)良性狀的阿魏菇(Pleurotusferulae)新菌種。【擬解決的關(guān)鍵問題】研究對(duì)原生質(zhì)體技術(shù)獲得的阿魏菇單核菌株進(jìn)行交配型測(cè)定，分析阿魏菇原生質(zhì)體單核菌株與親本菌株在生長(zhǎng)性狀方面的差異，篩選阿魏菇雜交菌株并進(jìn)行拮抗驗(yàn)證，獲得性狀優(yōu)良的阿魏菇新菌種，為新疆野生阿魏菇新品種的選育及產(chǎn)業(yè)化奠定理論與技術(shù)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材 料

供試的3個(gè)親本野生阿魏菇菌株P(guān)L001、PL176、PL163均由新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所食用菌實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 方 法

1.2.1 供試試劑與培養(yǎng)基

2%Lywallzyme(即溶壁酶，取自廣東微生物研究所)：2%溶壁酶中加入0.6 M無菌甘露醇(mannitol)。

PDA 固體培養(yǎng)基：馬鈴薯 200 g，葡萄糖20 g，瓊脂20 g；

PDA 液體培養(yǎng)基：馬鈴薯 200 g，葡萄糖15 g；

MYG 再生培養(yǎng)基：麥芽糖 10 g，葡萄糖4 g，酵母膏4 g，0.6 M甘露醇，瓊脂粉20 g。。

以上培養(yǎng)基皆用水定容到1 000 mL，酸堿度自然，于121℃下，行20 min滅菌處理，再待用。

1.2.2 原生質(zhì)體制備與再生

將供試菌株分別接種至PDA培養(yǎng)基平板純化，生長(zhǎng)7 d后挑取5×5 (mm)菌塊接種至PDA培養(yǎng)基中央，在25℃、暗環(huán)境中，實(shí)施7 d培養(yǎng)。將新生菌絲挑至PDA液體培養(yǎng)基內(nèi)，25℃靜止培養(yǎng) 7 d，待出現(xiàn)菌絲球后利用篩網(wǎng)過濾菌絲，分別用無菌水、0.6 M甘露醇各沖洗1次，用濾紙吸干水分，放入10 mL離心管中，添加0.6 M甘露醇3 mL，當(dāng)溫度為4℃，轉(zhuǎn)速為3 000 r/min時(shí)，5 min離心處理，棄上清液，將沉淀物加入2%溶壁酶3 mL，30℃水浴1.5～4.5 h，間隔30 min輕輕搖動(dòng)離心管，鏡檢菌絲破壁情況。待酶解停止，將菌絲體混合液移至無菌且配備棉塞的注射器，經(jīng)過濾將斷裂菌絲清理掉，在3 000 r/min速度下，對(duì)濾液實(shí)施10 min離心，吸取上清，同時(shí)將沉淀收集起來，通過0.6 M甘露醇稀釋。借助移液槍將0.1 mL的原生質(zhì)體稀釋液均勻涂布在再生培養(yǎng)基內(nèi)，于25℃下暗培養(yǎng)，得到原生質(zhì)體再生菌落。

1.2.3 單核菌株獲得

利用單孢分離方法[20]，在顯微鏡下挑選菌落小、生長(zhǎng)緩慢的單菌落接種至PDA固體斜面培養(yǎng)基上，等到菌落長(zhǎng)到1 cm，顯微鏡下觀察是否存在鎖狀聯(lián)合，無鎖裝聯(lián)合則為單核菌株。

1.2.4 菌株交配型測(cè)定及單核菌株篩選

選取3株單核菌株為測(cè)試菌株，分別與其它單核菌株進(jìn)行配對(duì)，接種于PDA平板上并于25℃避光培養(yǎng)。7 d后顯微觀察菌絲鎖狀聯(lián)合有無，再根據(jù)交配反應(yīng)結(jié)果進(jìn)行分析。確定交配類型后，根據(jù)各個(gè)單核菌株的生長(zhǎng)速度進(jìn)行篩選，以每個(gè)交配型中生長(zhǎng)速率最快的作為育種材料。

1.2.5 雜交菌株獲得

將不同親本菌株中篩選出的不同交配型的單核菌株進(jìn)行兩兩配對(duì)，在PDA固體培養(yǎng)基上進(jìn)行雜交。挑取有鎖狀聯(lián)合的菌絲接種到 PDA平板上培養(yǎng)2～3 d，挑取新鮮的菌絲進(jìn)行純化，獲得雜交菌株。

1.3 數(shù)據(jù)處理

應(yīng)用Excel 2010、SPSS 19.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理和方差分析(AVNOA)。

2 結(jié)果與分析

2.1 酶解時(shí)間對(duì)原生質(zhì)體產(chǎn)量的影響

研究表明，供試菌株P(guān)L001、PL163和PL176在酶解1.5 h時(shí)均開始釋放原生質(zhì)體，此時(shí)產(chǎn)生的原生質(zhì)體較大，40×單視野中個(gè)數(shù)為(3.1～4.4)×105，數(shù)量較少；2.5 h之后，觀察到體積較小的原生質(zhì)體，此時(shí)單視野中原生質(zhì)體個(gè)數(shù)為(5.9～11.6)×105，隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)，原生質(zhì)體釋放量越來越大。當(dāng)酶解3.5 h時(shí)，40×目鏡單視野中原生質(zhì)體個(gè)數(shù)為(10.8～20.6)×105，原生質(zhì)體釋放量達(dá)到最大。當(dāng)酶解時(shí)間延長(zhǎng)至4.5 h，原生質(zhì)體的再生數(shù)量開始降低，40×單視野中原生質(zhì)體個(gè)數(shù)為(2.9～10.3)×105，隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)，原生質(zhì)體釋放量越來越低。阿魏菇菌絲釋放原生質(zhì)體數(shù)量隨時(shí)間延長(zhǎng)呈先升高后降低的趨勢(shì)，阿魏菇原生質(zhì)體的酶解最佳時(shí)間為3.5 h。圖1

圖1 阿魏菇菌株釋放出原生質(zhì)體Fig.1 The protoplasts released by Pleurotus ferulae

2.2 原生質(zhì)體再生與單核菌株獲得情況

研究表明，獲得了462個(gè)原生質(zhì)體萌發(fā)單菌落，獲得單核菌株50個(gè)。從 PL01菌株原生質(zhì)體中分離獲得156株單個(gè)原生質(zhì)體再生菌株，其中20株無鎖狀聯(lián)合，原生質(zhì)體單核化率為12.8%；從 PL163菌株原質(zhì)體中分離獲得74 株單個(gè)原生質(zhì)體再生菌株，其中20株無鎖狀聯(lián)合，原生質(zhì)體單核化率為27.02% ；從PL176 菌株原生質(zhì)體中分離獲得175株單個(gè)原生質(zhì)體再生菌株，其中13株無鎖狀聯(lián)合，原生質(zhì)體單核化率為12.03%。表1

表1 原生質(zhì)體單核菌株的數(shù)量以及單核獲得比例Table1 The quantity of monocytic strains and the rate of monokaryogenesis

2.3 單核菌株交配型確定及單核菌株篩選

研究表明，在所得2類交配型單核菌株的占比方面，同一親本菌株存在區(qū)別，PL01、PL163這2個(gè)親本菌株的2類交配型的占比皆是1∶3， PL176此親本菌株的2類交配型占比是1∶4。表2

表2 交配型分類結(jié)果Table 2 The classification of mating type

圖2 原生質(zhì)體產(chǎn)量隨不同酶解時(shí)間的變化 (個(gè) /mL)
Fig.2 The production of Ganoderma lucidum protoplast in different time(ind /mL)

不同交配型單核菌株的菌落形態(tài)及生長(zhǎng)速度差異大，親本菌株生長(zhǎng)速度快于單核菌株，親本PL01、PL163和PL176日長(zhǎng)速分別為5.28、6.20和5.99 cm。在長(zhǎng)速上，不同單核菌株之間的生長(zhǎng)速度差異較大，根據(jù)單核菌絲的生長(zhǎng)速度，每種交配型選擇單核菌株 PL01-P16、PL01-P49、PL163-7、PL163-24、PL176-23、PL176-39作為雜交育種材料。表3，圖4

注：A：?jiǎn)魏司z；B：雙核菌絲，可見鎖狀聯(lián)合

圖4 親本菌株與單核菌株菌落形態(tài)Fig.4 Colony morphology of parent strain and monocyte strain

表3 親本菌株與單核菌株的生長(zhǎng)速度Table 3 The growth speed of mononuclear strains

2.4 雜交菌株的獲得與驗(yàn)證

研究表明，共得到12株雜交菌株。在雜交菌株與親本菌株之間出現(xiàn)明顯的隆起拮抗帶，拮抗帶是不同菌株生長(zhǎng)對(duì)抗的典型現(xiàn)象，純化后獲得的雜交菌株與親本菌株是不同的菌株個(gè)體。表4，圖5

表4 雜交菌株編號(hào)Table 4 hybrid strain

圖5 親本菌株與雜交菌株的拮抗實(shí)驗(yàn)Fig.5 Antagonism test between parental strain and hybrid strain

3 討 論

目前利用原生質(zhì)體單核化技術(shù)對(duì)新疆野生阿魏菇菌種進(jìn)行提純復(fù)壯研究較為缺乏。制備原生質(zhì)體的關(guān)鍵是有效去除細(xì)胞壁。然而，由于溶壁酶濃度、酶解時(shí)間、水浴溫度等諸多因素都會(huì)影響原生質(zhì)體制備效率。酶解時(shí)間過短，生成的原生質(zhì)體數(shù)量少但體積大；酶解時(shí)間過長(zhǎng)，則原生質(zhì)體的再生能力減弱。原慧等[12]研發(fā)新疆阿魏菇，35℃條件下酶解3 h，獲得原生質(zhì)體數(shù)量最多，原生質(zhì)體再生能力隨酶解時(shí)間的縮短而增強(qiáng)，但是原生質(zhì)體細(xì)胞壁也隨著酶解時(shí)間的長(zhǎng)短而受到不同程度的降解，因此，確定合適的酶解時(shí)間十分關(guān)鍵。研究發(fā)現(xiàn)，3株野生阿魏菇在酶解3.5 h時(shí)，原生質(zhì)體釋放量最大，濃度達(dá)20.6×105個(gè)/ mL，因此，可將阿魏菇原生質(zhì)體酶解時(shí)間控制在3.5 h。

野生阿魏菇菌齡的培養(yǎng)時(shí)間關(guān)系到原生質(zhì)體獲得率高低，培養(yǎng)時(shí)間短原生質(zhì)體釋放少，培養(yǎng)時(shí)間長(zhǎng)則菌絲細(xì)胞壁難以充分酶解。不同菌類的最佳培養(yǎng)時(shí)間不同[8]，白靈菇最佳培養(yǎng)時(shí)間為4～7 d[7]，原慧等[12]阿魏菇菌絲選擇最佳培養(yǎng)時(shí)間均為8 d，阿魏菇菌絲最佳培養(yǎng)時(shí)間為5～7 d。3株野生阿魏菇菌株共獲得50個(gè)單核菌株。其中親本菌株P(guān) L163、PL01和PL176原生質(zhì)體單核化得率分別為25.68%、12.8%和10.8%，獲得率較低，不同菌株獲得原生質(zhì)體單核化率有著明顯差異，可能與原生質(zhì)體制備時(shí)酶解時(shí)間不同有關(guān)。

研究3株野生阿魏菇菌株獲得2種交配型單核菌株非等比例分配，可能是由2種交配型的再生率不同導(dǎo)致[21]。研究表明，不同單核菌株的生命力強(qiáng)弱、細(xì)胞質(zhì)對(duì)核的選擇作用以及某些與交配型基因連鎖的致死效應(yīng)因子也同時(shí)影響著交配型單核菌株的分配比例[22]，獲得更多樣本量的單核體以及控制好挑取時(shí)間可提高獲得2種交配型單核菌株的數(shù)量[23]。原生質(zhì)體是遺傳轉(zhuǎn)化的廣泛受體之一，是多種植物的基因改造中都被作為接受外源基因的良好受體。原生質(zhì)體單核化方法在研究細(xì)胞融合、突變與篩選等方面的應(yīng)用普遍，利用原生質(zhì)體單核化技術(shù)進(jìn)行基因修飾已成為食用菌育種的有效途徑之一[24]。

4 結(jié) 論

3株野生阿魏菇在酶解3.5 h時(shí)原生質(zhì)體釋放量最大，共獲得50個(gè)再生單核菌株。親本菌株P(guān)L163、PL01、PL176原生質(zhì)體單核化率分別為 25.68%、12.8%、10.8%，3株阿魏菇菌株的原生質(zhì)體再生能力在相同酶解條件下存在差異，獲得率普遍較低。每個(gè)親本菌株與單核菌株在菌絲長(zhǎng)速、菌落形態(tài)方面均具有明顯差異，但無一致規(guī)律。3株親本阿魏菇原生質(zhì)體單核菌株均獲得2種交配型，但獲得比例不同。3株阿魏菇野生菌株在原生質(zhì)體再生單核獲得率、長(zhǎng)速、形態(tài)等方面具有豐富的多樣性，獲得雜交菌株。