李超 趙劍波* 陳俊雅 耿玲 何寧 趙浩東

1. 大理大學第一附屬醫(yī)院創(chuàng)傷骨科，云南 大理 671000； 2. 大理大學，云南 大理，671000

骨質(zhì)疏松(osteoporosis，OP)是常見老年疾病，致殘率高。臨床以低骨量和骨組織微結(jié)構(gòu)破壞為特征，導致骨質(zhì)脆性增加和易于骨折的全身性骨代謝性疾病[1]。而由于OP產(chǎn)生的病理性骨折，是老年人死亡的重要因素。流行病學研究[2]表明，OP與多種因素有關，包括遺傳因素、鈣和維生素D缺乏、雌激素和雄激素分泌不足、老年退化性機制等?，F(xiàn)代藥理研究[3]表明，在骨質(zhì)疏松的發(fā)生發(fā)展中，氧化應激是一個至關重要的初始風險因素?；钚匝踝杂苫?reactive oxide species，ROS)積累和成骨細胞凋亡參與了各種類型OP的發(fā)病機理，因此抗氧化在一定程度上能夠預防骨質(zhì)疏松。

金天格膠囊為人工虎骨粉，具有健骨作用，臨床前研究及臨床研究均發(fā)現(xiàn)其具有一定的促進骨生長的作用[4]，但是對于氧化應激所導致的損傷作用尚不清楚。因此，本研究利用小鼠成骨細胞ME3T3-E1，考察過氧化氫(H2O2)刺激后氧化還原平衡和炎癥基因、炎癥因子變化，并同時考察金天格膠囊對氧化應激損傷的保護作用，對細胞中總超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、丙二醛(malondialdehyde，MDA)、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathion peroxidase，GSH-Px)和過氧化氫酶(catalase，CAT)活力的影響，以及對腫瘤壞死因子alpha(tumor necrosis factor alpha，TNF-α)、白介素1beta(interleukin 1 beta，IL-1β)、白介素6(interleukin 6，IL-6)基因表達和細胞因子分泌的影響，從而明確金天格膠囊對氧化應激損傷的作用。

1 材料和方法

1.1 細胞株

小鼠成骨細胞MC3T3-E1細胞株(北納創(chuàng)聯(lián)生物技術有限公司，中國)，采用含10 %胎牛血清，1 %青-鏈霉素的MEM-α(modified eagle medium-α)完全培養(yǎng)基，置于37 ℃、5 % CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2 藥品與試劑

金天格膠囊，由金花企業(yè)(集團)股份有限公司西安金花制藥廠饋贈。藥物配制：取1.2 g(0.4 g ×3粒)金天格膠囊，無菌條件下用12 mL MEM-α完全培養(yǎng)基溶解，0.22 μm過濾器過濾，即得100 mg/mL金天格膠囊儲備液，4 ℃保存。臨用前用MEM-α完全培養(yǎng)基分別配制成100、50、20、10、0 μg/mL金天格膠囊溶液。脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)購自碧云天生物技術研究所，總RNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒以及擴增試劑盒均購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司。小鼠Ⅰ型前膠原羧基端前肽(procollagen type ⅠC-peptide，PICP)酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)試劑盒和小鼠堿性磷脂酶(alkaline phospholipase，ALP)ELISA試劑盒購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司。小鼠TNF-α ELISA試劑盒、IL-1β ELSA試劑盒、IL-6 ELSA試劑盒，SOD檢測試劑盒、MDA檢測試劑盒、GSH-Px檢測試劑盒、CAT檢測試劑盒和CCK8(Cell Counting Kit-8)試劑均購自碧云天生物技術研究所。青-鏈霉素混合液(100×)和胰酶購自北京索萊寶科技有限公司，MEM-α培養(yǎng)基購自美國HyClone公司，胎牛血清購自杭州四季青生物工程材料有限公司。

1.3 儀器

RT-PCR儀(美國BIO-RAD公司)，多功能酶標儀(美國基因有限公司)，NanoPhotometer(德國Implen公司)，實時熒光定量PCR儀(Life Technologies)。

1.4 細胞培養(yǎng)

MC3T3-E1細胞培養(yǎng)于含10 %胎牛血清、1 %青-鏈霉素混合液的EME-α完全培養(yǎng)基中，置于37 ℃、5 % CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)觀察。

1.5 金天格膠囊對ME3T3-E1細胞增殖、凋亡及ALP、PICP含量影響的測定

1.5.1CCK-8檢測細胞增殖：將100 μL濃度為1×105/mL細胞懸液接種于96孔細胞培養(yǎng)板，分別設為不同濃度金天格膠囊組(100、50、20、10、0 μg/mL金天格膠囊溶液)，空白組加入同體積無血清培養(yǎng)基，每組設6個復孔，置37 ℃、5 % CO2的細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)。24 h后，去除培養(yǎng)液，磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer sulfate，PBS)輕輕洗2次，相應孔中分別加入不同濃度的金天格膠囊溶液或無血清培養(yǎng)基，繼續(xù)置37 ℃、含5 % CO2的細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)。24 h后，每孔加入CCK-8溶液10 μL，置37 ℃、5 % CO2的細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)。避光孵育3 h后，采用酶標儀于450 nm處測定吸光度值。

1.5.2ELISA檢測細胞培養(yǎng)上清中相關因子：將MC3T3-E1細胞以1×106/mL接種于6孔細胞培養(yǎng)板。培養(yǎng)24 h后，吸棄細胞培養(yǎng)上清液，藥物組分別加入含不同濃度金天格膠囊(100、50、20、10、0 μg/mL)的完全培養(yǎng)基，空白組加入同體積無血清培養(yǎng)基，48 h后，收集細胞培養(yǎng)上清液，3 000 r/min、4 ℃離心20 min，收集、分裝上清，-20 ℃保存?zhèn)溆?。根?jù)ELISA試劑盒說明書測定細胞培養(yǎng)上清液中ALP和PICP含量。

1.6 金天格膠囊對H2O2誘導ME3T3-E1細胞損傷保護作用的測定

1.6.1H2O2損傷模型制備及藥物作用下細胞增殖活力測定[5]：按照MC3T3-E1細胞數(shù)量和體積種板。24 h后，吸棄細胞培養(yǎng)上清。藥物組分別加入不同濃度金天格膠囊(100、50、20、10、0 μg/mL)的完全培養(yǎng)基，空白組加入同體積無血清培養(yǎng)基。20 h后，藥物組和損傷組均加入含1 mmol/L H2O2的MEM-α完全培養(yǎng)基共孵育4 h。每孔加入CCK-8溶液10 μL，避光孵育3 h后，采用酶標儀于450 nm處測定吸光度值。

1.6.2細胞中SOD、MDA、GSH-Px和CAT活力測定：以1×105/mL細胞懸液接種于24孔細胞培養(yǎng)板中，24 h后，吸棄細胞培養(yǎng)上清液。藥物組分別加入不同濃度金天格膠囊(100、50、20、10、0 μg/mL)的完全培養(yǎng)基，空白組加入同體積無血清培養(yǎng)基。20 h后，藥物組和損傷組均加入含1 mmol/L H2O2的MEM-α完全培養(yǎng)基共孵育4 h后，按照試劑盒說明書測定細胞中SOD、MDA、GSH-Px和CAT活力。

1.6.3細胞培養(yǎng)上清中TNF-α、IL-1β、IL-6含量測定：按照1×106/mL將MC3T3-E1細胞接種于6孔板中。按照細胞種板及給藥方法，加H2O2孵育4 h后，收集細胞培養(yǎng)上清液，3 000 r/min、4 ℃離心20 min，收集、分裝上清，-20 ℃保存?zhèn)溆?。根?jù)ELISA試劑盒說明書測定細胞培養(yǎng)上清液中炎癥相關因子TNF-α、IL-1β、IL-6含量。

1.6.4細胞中Tnfa、Il-1b、Il-6相對mRNA水平測定按照1×106/mL將MC3T3-E1細胞接種于6孔板中。按照細胞種板及給藥方法，加H2O2孵育4 h后，吸棄細胞培養(yǎng)上清液，PBS輕輕洗1次，收集每孔細胞。采用Trizol試劑從細胞中提取總RNA，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將提取的RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。然后擴增cDNA進行RT-PCR。實驗采用GAPDH作為內(nèi)參基因，結(jié)果采用2-△△CT法進行分析。RT-PCR引物由上海生工生物工程股份有限公司合成，具體引物序列如下：Tnfa5’-3，F(xiàn)：CCCTCACACTCAGATC ATCTTCT，R：GCTACGACGTGGGCTACAG；Il-1b5’-3’，F(xiàn)：GCAACTGTTCCTGAACTCAACT，R：ATCTTT TGGGGTCCGTCAACT；Il-6 5’-3’，F(xiàn)：TAGTCCTT CCTACCCCAATTTCC，R：TTGGTCCTTAGCCACTCC TTC；GAPDH 5’-3，F(xiàn)：AGGTCGGTGTGAACGGAT TTG，R：TGTAGACCATGTAGTTGAGGTCA。

1.7 統(tǒng)計學處理

2 結(jié)果

2.1 不同濃度金天格膠囊作用24 h對MC3T3-E1細胞增殖的作用

與空白組比較，20、50、100 μg/mL金天格膠囊溶液均能夠促進MC3T3-E1細胞增殖，其中100 μg/mL金天格膠囊溶液能顯著促進MC3T3-E1細胞增殖(P<0.01)。結(jié)果見圖1。

注：與空白組比較，**P < 0.01。

2.2 不同濃度金天格膠囊對MC3T3-E1細胞培養(yǎng)上清中ALP和PICP含量的影響

與空白組比較，除10 μg/mL金天格膠囊溶液外，20、50、100 μg/mL金天格膠囊溶液均可明顯提高MC3T3-E1細胞培養(yǎng)上清中ALP和PICP含量，且差異具有統(tǒng)計學意義(P< 0.05，P< 0.01)。結(jié)果見表1。

表1 金天格膠囊提高MC3T3-E1細胞培養(yǎng)上清中ALP和PICP含量

2.3 H2O2誘導下細胞增殖活力測定

與空白組比較，H2O2組MC3T3-E1細胞存活率顯著下降(P< 0.01)，10、20、50 μg/mL金天格膠囊溶液組細胞存活率也明顯下降(P< 0.01)。與H2O2組比較，50、100 μg/mL金天格膠囊溶液能顯著提高H2O2刺激后的細胞存活率(P< 0.01)。結(jié)果見圖2。

注：與空白組比較，*P < 0.05，**P < 0.01；與H2O2組比較，#P < 0.05，##P < 0.01。

2.4 H2O2誘導下SOD、MDA、GSH-Px和CAT活力測定

與空白組比較，H2O2組MC3T3-E1細胞中SOD、CAT活力顯著降低(P< 0.01)，MDA水平顯著上升(P< 0.01)、GSH-Px水平明顯下降(P< 0.05)。與H2O2組比較，100 μg/mL金天格膠囊溶液能顯著提高SOD、CAT活力(P< 0.01)，提高GSH-Px水平(P< 0.05)，顯著降低MDA水平(P< 0.01)。結(jié)果見表2。

表2 H2O2誘導下不同濃度金天格膠囊溶液對MC3T3-E1細胞中SOD、MDA、GSH-Px和CAT活力影響

2.5 H2O2誘導下細胞培養(yǎng)上清中炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6含量測定

與空白組比較，H2O2組MC3T3-E1細胞培養(yǎng)上清中TNF-α、IL-1β、IL-6含量顯著提高(P< 0.01)，10、20、50 μg/mL金天格膠囊溶液組細胞上清中TNF-α、IL-1β、IL-6含量也明顯提高(P< 0.05，P< 0.01)。與H2O2組比較，50、100 μg/mL金天格膠囊溶液能明顯降低MC3T3-E1細胞培養(yǎng)上清中TNF-α、IL-1β、IL-6含量(P< 0.05，P< 0.01)。結(jié)果見表3。

表3 H2O2誘導下不同濃度金天格膠囊溶液對MC3T3-E1細胞中TNF-α、IL-1β和IL-6含量作用

2.6 H2O2誘導下細胞中炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6 mRNA相對表達

與空白組比較，H2O2組和10 μg/mL金天格膠囊溶液組細胞中Tnfa、Il-1b和Il-6 mRNA相對表達明顯提高(P< 0.05，P< 0.01)。與H2O2組比較，50、100 μg/mL金天格膠囊溶液組能顯著降低細胞中Tnfa和Il-6 mRNA相對表達(P< 0.01)。結(jié)果見表4。

表4 H2O2誘導下不同濃度金天格膠囊溶液對MC3T3-E1細胞中Tnfa、Il-1b和Il-6 mRNA相對表達

3 討論

目前，世界上約有2億人正在遭受OP困擾，而受環(huán)境和生活方式等多種因素影響，這一數(shù)據(jù)還在不斷增加[6]。氧化應激被認為是許多疾病狀態(tài)的致病因素之一，包括降低骨密度，即骨量流失[7]。研究表明，抗氧化劑可以作為OP治療的有效手段之一，并且多種抗氧化劑的抗氧化應激作用，如N-乙酰半胱氨酸[8]、綠原酸[9]等，已經(jīng)得到臨床前證明。H2O2體外誘導MC3T3-E1細胞損傷模型，是在成骨細胞中建立骨壞死的常用體外模型。在此模型中，H2O2促進MC3T3-E1細胞凋亡[10]，誘導氧化應激，從而增加過氧化產(chǎn)物MDA水平，下調(diào)GSH-Px水平[11]。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，100 μg/mL金天格膠囊溶液能顯著促進正常MC3T3-E1細胞的增殖，并顯著提高H2O2誘導MC3T3-E1細胞存活率的下降。同時，100 μg/mL金天格膠囊溶液顯著提高了抗氧化相關因子SOD、CAT活力，提高GSH-Px水平，并降低過氧化產(chǎn)物MDA水平。說明金天格膠囊對H2O2誘導的MC3T3-E1細胞氧化應激損傷具有保護作用。

研究發(fā)現(xiàn)，在MC3T3-E1細胞中，H2O2誘導了炎癥因子TNF-α、IL-1β等水平的增加[12]。臨床研究也發(fā)現(xiàn)，金天格膠囊與阿法骨化醇軟膠囊聯(lián)用，對絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥具有較好療效，可減少血液中炎癥因子水平[13]。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，金天格膠囊溶液能降低MC3T3-E1細胞中Tnfa、Il-6、Il-1b基因相對表達，減少細胞培養(yǎng)上清中炎癥因子TNF-α、IL-6、IL-1β的含量。結(jié)果表明，金天格膠囊具有明顯的抗炎作用。

骨質(zhì)疏松(OP)以骨量流失為特征，通常伴隨著骨吸收增加和骨形成減少的發(fā)生。骨的形成與成骨細胞活性有關，堿性磷脂酶(ALP)活性反映了成骨細胞分化程度，其活性越高，成骨細胞的成骨活性越強[14]。I型膠原蛋白約占骨骼有機成分的90 %，骨形成時，Ⅰ型前膠原羧基端前肽(PICP)會隨I型膠原的合成而釋放入血，其水平能反映骨細胞合成骨膠原的能力[15]。實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在體外培養(yǎng)的小鼠成骨細胞MC3T3-E1細胞株中，除10 μg/mL金天格膠囊溶液之外，20、50、100 μg/mL金天格膠囊溶液均可顯著提高MC3T3-E1細胞培養(yǎng)上清中ALP和PICP含量(P< 0.05，P< 0.01)。表明金天格膠囊增強了成骨細胞活性和I型膠原合成能力。

在中成藥治療膝骨關節(jié)炎臨床應用指南(2020年)中，明確指出金天格膠囊可以用于膝骨關節(jié)炎的緩解期和康復期[16]。本研究表明，金天格膠囊能顯著促進小鼠MC3T3-E1正常成骨細胞增殖，并提高H2O2引起的細胞存活率的降低；降低炎癥因子水平；此外，金天格膠囊還能增強成骨細胞活性和I型膠原合成能力。因此，抗氧化應激、抗炎和促進I型膠原合成在金天格膠囊治療OP的過程中可能發(fā)揮重要作用。

本研究著重考察了金天格膠囊在OP體外模型中對氧化應激的調(diào)節(jié)作用，對炎癥因子在RNA和蛋白水平表達增加的抑制作用，提高ALP和PICP增強成骨細胞活性作用。但是，還需要明確在OP臨床樣本和動物模型的不同發(fā)病時間和發(fā)展階段，其氧化應激和炎癥應答各因子水平變化，以及成骨細胞和破骨細胞之間的平衡，進一步探究其可能的發(fā)病機制，并探討金天格膠囊對OP不同階段的作用。