趙子睿，周靜波，張 明，姚建銘

(1. 上海伯豪生物技術(shù)有限公司，上海 201203；2. 安徽林業(yè)職業(yè)技術(shù)學院資源與環(huán)境系，合肥 230031；3. 中國科學研究院等離子體物理研究所，合肥 230031)

山桐子（Idesia polycarpaMaxim.）屬于大風子科山桐子屬落葉喬木，主要分布于我國長江流域、華北和西北南部的17 個省區(qū)。其中，變種毛葉山桐子（I. polycarpaMaxim. var.vestitaDiels）與原種的主要區(qū)別在于小枝、葉柄、葉下面及花序均密生短柔毛[1-3]。毛葉山桐子為陽性速生樹種，生長迅速，主桿挺直，分枝輪生，樹冠圓塔形；果實成熟后呈紅、黃等色，垂于枝頭，是比較理想的城市綠化、美化和造林的優(yōu)良樹種。同時，毛葉山桐子也是一種木本油料樹種，果實和種子都可榨油。毛葉山桐子油主要由亞油酸、油酸、棕櫚酸、棕櫚烯酸、硬脂酸等脂肪酸組成，可以制備生物柴油和潤滑油；經(jīng)深加工的油脂可以用作降低血脂、血壓的藥物[4-6]。然而，毛葉山桐子資源有限，主要以產(chǎn)地劃分，在自然界種子萌發(fā)困難，成片成林的群落較少，這給其廣泛、大面積推廣栽種造成了極大的困難。因此，研究毛葉山桐子的生態(tài)適應性，加快其優(yōu)質(zhì)苗木的選育，提高良種化水平成為當務(wù)之急。

離子束生物技術(shù)是一項新型的生物技術(shù)，其原理是在真空條件下，通過離子注入機高壓電離氣體或金屬物質(zhì)，產(chǎn)生等離體，注入植物材料。通過注入離子的能量傳遞、電荷傳遞、質(zhì)量沉積等多種效應，引起植物體內(nèi)某些物質(zhì)或染色體發(fā)生變化，再通過人工選育的方法得到良種[7]。離子束注入技術(shù)可以產(chǎn)生多種突變性狀，在植株表型變化的突變類型主要包括葉色、葉型、花型、花色、株型、生長周期突變等，從而豐富種質(zhì)資源[8]。目前這項技術(shù)已應用于蔬菜[9]、花卉[10]、小麥[11-12]、水稻[13-15]、玉米[16]、甘草[17]和麻風樹[18]等的催芽、育種和改良作物品質(zhì)等領(lǐng)域，但是離子束生物技術(shù)處理毛葉山桐子種子所產(chǎn)生的生物效應尚鮮見報道。

本研究旨在將氮離子束生物技術(shù)應用到毛葉山桐子的良種培育中，借鑒其在小麥、水稻、蔬菜的催芽和改良品質(zhì)等領(lǐng)域的方法和經(jīng)驗，研究氮離子束注入毛葉山桐子的種子后對種子萌芽和幼苗表型的生物學效應，以期為園林和林業(yè)生產(chǎn)提供優(yōu)質(zhì)苗木、促進安徽省山桐子產(chǎn)業(yè)的良性發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 材料

2016 年10 月采集安徽省舒城萬佛山農(nóng)戶家的毛葉山桐子果實，用相對濕度60%的細沙于5 ℃冰箱中層積沙藏。12 月取出凈種，晾干后放在自封袋中，儲存于5 ℃冰箱中待用。

1.2 方法

1.2.1 發(fā)芽率測定 2017 年3 月，將種子送往武漢中科光谷綠色生物技術(shù)有限公司。微波ECR 離子注入機（IBBe-Device）分別用不同能量的N+離子束20 keV 4×1015、25 keV 4×1015和30 keV 4×1015N+·cm-2（分別簡稱20、25 和30 keV）注入毛葉山桐子種子。采用隨機區(qū)組設(shè)計，以未經(jīng)N+離子束注入的毛葉山桐子種子為對照（0 keV，CK），20、25和30 keV 每種處理100 粒種子，3 次重復。3 月24日，取4 種處理的種子各300 粒，分別用下列方法浸種：用1 g·L-1KMnO4消毒種子1 h，15 g·L-1KH2PO4、200 mg·L-1GA3和0.1 g·L-1的生根粉混合溶液浸種24 h。倒出混合液，洗凈種子，放在紗布上晾干。3 月27 日，將晾干后的種子分別放在12個鋪墊濾紙的培養(yǎng)皿中，每皿100 粒，用水浸濕，定期更換濾紙并加水。蓋上培養(yǎng)皿蓋，在光照培養(yǎng)箱內(nèi)催芽，光照培養(yǎng)箱溫度設(shè)為23 ℃，空氣濕度80%，光強2 500 Lx。早晨6:00 開燈，下午18:00關(guān)燈。觀察記錄發(fā)芽數(shù)，計算發(fā)芽率。

1.2.2 容器苗生長指標測定 4 月25 日，將光照培養(yǎng)箱中催芽苗，定植于口徑×高為12 cm × 10 cm 的營養(yǎng)缽中，從CK、20、25 和30 keV 4 種處理的所有營養(yǎng)缽苗中，各選擇9 株長勢相近的幼苗作為樣本。采用隨機區(qū)組設(shè)計，每種處理栽植3 盆，每盆栽植1 株，3 次重復，放在光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，溫度設(shè)為23 ℃，每天光照12 h。5 月27 日開始，每隔7 d 測定1 次容器苗的株高、冠幅、葉片數(shù)，測定方法參考文獻[19]，地徑用游標卡尺測定，共測定7 次。

1.2.3 葉片全N、全C 含量測定 9 月11 日，分別從CK、20、25 和30 keV 4 種處理容器苗9 株樣本中，剪取葉片，每株從基部開始向上取6 片葉，在水龍頭下沖洗干凈，吸水紙吸干。4 個處理樣本的葉片分別放于9 個牛皮紙信封中，共36 個信封放在電熱鼓風干燥箱中，105 ℃殺青20 min，再于50 ℃烘干96 h；9 月18 日，用高速萬能粉碎機將葉片研成粉狀。9 月20 日使用元素分析儀（EA3000，Vector，Italy）測定全N、全C 的含量。

1.3 數(shù)據(jù)分析

為比較不同能量的N+束對毛葉山桐子種子萌發(fā)和幼苗生長的影響，采用單因素方差分析（One-way ANOVA）進行不同處理間的顯著性檢驗，具有顯著性差異的進一步進行Tukey 多重比較（HSD），統(tǒng)計分析在統(tǒng)計軟件R（4.0.2 版本）進行，加載multcomp、car、agricolae 等軟件包，作圖在Excel 中進行。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同能量N+離子束注入毛葉山桐子種子對其發(fā)芽率的影響

從圖1 可以看出，催芽后的21、22、26 和27 d，30 keV 處理的種子發(fā)芽率與CK 差異都顯著，而20和25 keV 處理的種子發(fā)芽率與CK 差異都不顯著；催芽后的10 ～ 20 d 和23 ～ 25 d，20、25 和30 keV處理的種子發(fā)芽率與CK 的差異都不顯著。結(jié)果表明30 keV N+離子束注入毛葉山桐子種子對發(fā)芽率起顯著增加作用，而20 和25 keV N+離子束注入種子對發(fā)芽率的的作用不顯著。

圖1 不同能量N+離子束注入后對毛葉山桐子種子發(fā)芽率的影響Figure 1 Effects of different energy N+ ion beam exposure on the germination rate of I. polycarpa var. vestita seeds

2.2 不同能量N+離子束注入毛葉山桐子種子對其容器苗生長的影響

2.2.1 不同能量N+離子束注入種子對毛葉山桐子容器苗株高的影響 從圖2 可以看出，20 keV 處理的毛葉山桐子容器苗，在定植47 d 時，株高與對照差異顯著，30 keV 處理的容器苗，在定植61 和68 d時，株高與對照差異顯著，25 keV 處理的容器苗，在47、61 和68 d 時，株高與對照差異都不顯著；定植40、54 和75 d 時，20、25 和30 keV 處理的容器苗，株高與對照差異都不顯著。說明20 和30 keV 的N+離子束注入毛葉山桐子種子，對容器苗的株高增加有一定的促進作用，而30 keV 處理的容器苗株高增長更快一些。

圖2 不同能量N+離子束注入對毛葉山桐子幼苗株高影響Figure 2 Effects of different energy N+ ion beam exposure on the height of I. polycarpa var. vestita seedlings

2.2.2 不同能量N+離子束注入種子對毛葉山桐子容器苗冠幅的影響 從圖3 可以看出，30 keV 處理的毛葉山桐子容器苗，在定植61 d 時，冠幅與對照差異顯著，在定植54、68 和75 d 時，雖然與對照差異不顯著，但是都大于對照，20 keV 處理的容器苗，在定植54、61、68 和75 d 時，冠幅與對照差異不顯著，而且都小于對照；25 keV 處理的容器苗，定植54、61、68 和75 d 時，冠幅與對照差異不顯著，同時都小于30 keV 處理的容器苗；說明30 keV的N+離子束注入毛葉山桐子種子，對容器苗冠幅的增加起一定的作用。

圖3 不同能量N+離子束注入對毛葉山桐子幼苗冠幅影響Figure 3 Effects of different energy N+ ion beam exposure on the crown diameter of I. polycarpa var. vestita seedlings

2.2.3 不同能量N+離子束注入種子對毛葉山桐子容器苗葉片數(shù)的影響 從圖4 可以看出，30 keV 處理的毛葉山桐子容器苗，在定植54 d 時，葉片數(shù)與對照差異顯著，定植61、68 和75 d，雖然與對照差異不顯著，但都是多于對照，20 和25 keV 處理的容器苗，在定植54、61、68 和75 d 時，葉片數(shù)與對照差異都不顯著；說明30 keV 處理對于毛葉山桐子容器苗的葉片增加有一定的促進作用。

圖4 不同能量N+離子束注入對毛葉山桐子幼苗葉片數(shù)的影響Figure 4 Effects of different energy N+ ion beam exposure on the leaf number of I. polycarpa var. vestita seedlings

2.2.4 不同能量N+離子束注入種子對毛葉山桐子容器苗地徑的影響 從圖5 可以看出，在定植47、54、61、68 和75 d 時，30 keV 處理的毛葉山桐子容器苗，地徑雖然與對照差異不顯著，但在數(shù)值上都大于對照，而且有上升的趨勢；20 keV 處理的容器苗，地徑與對照差異都不顯著，只有定植47 d 時，略高于對照，其他都是小于對照；25 keV 處理的容器苗，地徑與對照差異也不顯著，只有定植47 和68 d時，略高于對照，其他也都小于對照。說明30 keV處理對于毛葉山桐子容器苗地徑的增加略有作用。綜上所述，20 keV 處理的N+離子束注入毛葉山桐子種子，對容器苗的株高增加有一定的促進作用，對冠幅、葉片數(shù)、地徑增加沒有顯著的影響；25 keV處理的N+離子束注入毛葉山桐子種子，對容器苗的株高、冠幅、葉片數(shù)、地徑的增加都沒有顯著的影響；30 keV 處理的N+離子束注入毛葉山桐子種子，對容器苗的株高、冠幅、葉片數(shù)的增加都有顯著的影響，對地徑增加影響雖然不顯著，但是從數(shù)值上來看，高于對照。說明30 keV N+離子束注入毛葉山桐子種子，在容器苗定植后，對其株高、冠幅、葉片數(shù)和地徑增加都有促進作用，可以用該法培養(yǎng)株高、冠大、葉片多和地徑粗的容器苗，為園林和林業(yè)生產(chǎn)提供優(yōu)質(zhì)苗木。

圖5 不同能量N+離子束注入對毛葉山桐子幼苗地徑影響Figure 5 Effects of different energy N+ ion beam exposure on the ground diameter of I. polycarpa var. vestita seedlings

2.3 不同能量N+離子束注入種子對容器苗葉片全C、N 含量的影響

從圖6 可以看出，容器苗定植140 d（9 月11日），20、25 和 30 keV 處理的毛葉山桐子葉片中的全氮含量與對照差異都顯著。20 和25 keV 處理葉片中的全碳含量與對照差異顯著；而30 keV 處理的毛葉山桐子葉片中的全碳含量與對照差異不顯著。從圖7 可以看出，20 keV 處理的毛葉山桐子葉片中的C / N 與對照差異不顯著，而25 和30 keV處理與對照差異顯著，都小于對照，30 keV 最小。

圖6 不同能量N+束注入對毛葉山桐子幼苗葉片全碳和全氮含量的影響Figure 6 Effects of different energy N+ ion beam exposure on total C and N contents in the leaves of I. polycarpa var. vestita seedlings

圖7 不同能量N+束注入對毛葉山桐子幼苗葉片碳氮比的影響Figure 7 Effects of different energy N+ ion beam exposure on C/N in the leaves of I. polycarpa var. vestita seedlings

綜上所述，這4 種能量的N+離子束注入毛葉山桐子種子，經(jīng)過催芽、定植，140 d 后的容器苗，其樣本每千克葉片中的含氮量（g）與對照差異都顯著，說明這幾種能量的N+注入毛葉山桐子種子，對種苗生長葉片中的含氮量增加起促進作用，有利于植株的營養(yǎng)生長。這也從氮營養(yǎng)方面說明了30 keV 處理的毛葉山桐子株高、冠幅、葉片數(shù)等營養(yǎng)指標顯著差異于對照的原因，但從圖6 中并沒有看到20、25和30 keV 處理之間每千克葉片含N 量（g）的差異，說明這幾種處理在株高、冠幅、葉片數(shù)、地徑等形態(tài)上的差異可能還有其他內(nèi)因，有待進一步研究。

3 討論與結(jié)論

植物個體發(fā)育的起點從種子萌發(fā)開始，播種后種子能否迅速萌發(fā)，達到早苗、全苗和壯苗，關(guān)系到能否為作物的豐產(chǎn)打下良好的基礎(chǔ)[20]。植物的生長是一種不可逆的體積增加的過程。植物的體積大小（通?？梢杂瞄L度或直徑來代表）可以作為測量植物生長的一個重要指標[21]。植物的株高、冠幅、葉片數(shù)和地徑可以很好地反映植物的生長狀態(tài)。30 keV 注入毛葉山桐子種子，無論在發(fā)芽率，后期容器苗的株高、冠幅、葉片數(shù)等形態(tài)指標，都顯著差異于未處理的對照。20 keV 注入毛葉山桐子種子，其發(fā)芽率與CK 差異不顯著；對容器苗的株高增加有一定的促進作用，對冠幅、葉片數(shù)、地徑增加沒有顯著的影響。25 keV 注入毛葉山桐子種子，其發(fā)芽率與CK 差異不顯著；對容器苗的株高、冠幅、葉片數(shù)、地徑的增加都沒有顯著的影響?；谏鲜鼋Y(jié)果，不難看出30 keV 注入毛葉山桐子種子，顯著提高了種子的發(fā)芽率，促進了株高、冠幅、葉片數(shù)、地徑的生長，是適宜于毛葉山桐子種子的萌發(fā)、植株營養(yǎng)生長的N+離子束注入能量。

代西梅等[22]用能量為30 keV 的N+離子束注入馬齒莧，提高了種子的萌發(fā)速率、發(fā)芽率相一致。周立人等將30 keV 的離子束注入大麥種胚后，不僅對種子本身萌發(fā)能力和M1 代胚根、胚芽細胞的有絲分裂有促進作用，還對胚根根尖細胞和胚芽細胞內(nèi)的核及染色體產(chǎn)生不同程度損傷，表現(xiàn)出核和染色體畸變[23]。黃洪云等年用能量為30 keV 的離子束注入玉米種子，種子電導率和幼苗葉片MDA 含量均較低，對細胞膜的破壞性小[24]。郭建秋等研究采用能量為 30 keV 的氮離子束注入大豆的種子，結(jié)果與航天搭載處理M1 代的出苗率、株高、單株莢數(shù)、單株粒數(shù)無顯著差異[25]。樊繼偉等試驗中氮離子束注入能量只有 1 個水平（30 keV），氮離子束注入后，小麥誘變?nèi)后w氮素利用產(chǎn)生一定變化，影響產(chǎn)量和品質(zhì)[26]。這些研究的結(jié)論與本試驗的結(jié)果一致。

葉片是植物進行光合作用的主要器官，不僅對環(huán)境變化敏感，而且可塑性大。作為植物固碳能力的指標，葉片碳含量是植物適應環(huán)境變化，維持碳平衡的重要參數(shù)。氮是蛋白質(zhì)、核酸、磷脂的主要成分，而這三者又是原生質(zhì)、細胞核和生物膜的重要組成部分，因此，氮在植物生命活動中占首要地位[27]，含氮量影響植株的營養(yǎng)生長。20 keV 處理的毛葉山桐子每kg 樣本葉片中的含C 量和含N 量與對照差異顯著；25 keV 處理的毛葉山桐子葉片含C量和含N 量與對照差異也顯著；30 keV 處理的毛葉山桐子葉片含C 量與對照差異不顯著，但是略高于對照，含N 量與對照差異顯著。說明20 和25 keV處理對毛葉山桐子幼苗葉片的固碳能力有一定的促進作用。葉片中的含碳量在采用N+離子束注入后都有增加，但增加幅度隨N+離子束能量增加而減?。欢扛魈幚砘疽恢拢▓D6），也即是說，隨著N+離子束能量增加，其C/N 比值在減?。▓D7）。熊炳霖等的研究結(jié)果表明，葉綠素含量和碳氮比呈極顯著的負相關(guān)[28]，30 keV 處理的毛葉山桐子葉片C/N 最小，葉綠素含量高，光合效率好，有助于葉片的生長和發(fā)育，這從植物發(fā)育生理上解釋了部分試驗結(jié)果。

本研究采用0、20、25 和30 keV 等4 個不同能量N+離子束注入毛葉山桐子種子進行試驗，篩選出30 keV 4×1015N+·cm-2為適宜注入劑量，顯著增加了種子發(fā)芽率、株高、冠幅、葉片數(shù)和葉片中氮的含量，有利于植株的營養(yǎng)生長。該方法對其他觀賞植物優(yōu)質(zhì)苗木培育也有較大的參考價值。