蔣欣瑜，胡曉渝，呂 藺，胡秋濤，魏涵天，林新春，許永漢*

(1. 安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，合肥 230036；2. 浙江農(nóng)林大學(xué)林業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院，杭州 311300)

氮是作物生長發(fā)育必需的大量營養(yǎng)元素，增施化學(xué)氮肥，是作物生產(chǎn)采取的主要增產(chǎn)措施之一。然而，近20 年來，我國作物氮施用量逐年升高，氮素利用效率趨于下降，而帶來的環(huán)境污染則趨于加重[1]。因此，提高氮素利用率，降低其對環(huán)境的負(fù)面影響，在提高作物產(chǎn)量的同時(shí)兼顧生態(tài)效益，是當(dāng)前我國土壤氮素研究的指導(dǎo)思想[1-2]。研究土壤中氮素營養(yǎng)吸收和轉(zhuǎn)化過程，明確其對植株生長影響效果的規(guī)律及分子機(jī)制，對于合理施用氮肥及保護(hù)生態(tài)環(huán)境具有重要意義。

植株內(nèi)C、N 代謝貫穿整個(gè)生育期。前人研究表明，不同濃度的N 肥對水稻植株生長發(fā)育和C、N 有顯著差異，但對于不同濃度的N 營養(yǎng)在全生育期內(nèi)施于水稻時(shí)，其植株生長發(fā)育和C、N 代謝如何響應(yīng)還沒有系統(tǒng)報(bào)道。鑒于此，作者用含有不同濃度N 營養(yǎng)的培養(yǎng)液對水稻進(jìn)行全生育期水培，分析水稻植株農(nóng)藝性狀、糖代謝（C 代謝）和氨基酸代謝（N 代謝）狀態(tài)、色素合成代謝和N 轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝關(guān)鍵基因的表達(dá)響應(yīng)，以期為水稻生理代謝分子機(jī)制和指導(dǎo)作物施肥提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 水稻全生育期培養(yǎng)條件

所有水稻均在生長箱培養(yǎng)（Thermoline Scientific Equipment Pty. Ltd, Smithfield, Australia）。晝/夜光暗時(shí)間（光/暗條件）比例為13 h/11 h，光照時(shí)間為6:00 到19:00，光照強(qiáng)度為400 μmol·m-2·s-1。晝/夜溫度條件為25 ℃/20 ℃；培養(yǎng)箱維持70%的相對濕度。

水稻基本培養(yǎng)液采用國際水稻所標(biāo)準(zhǔn)配方（IRRI nutrient solution）：1.25 mmol·L-1NH4NO3,0.3 mmol·L-1KH2PO4, 0.35 mmol·L-1K2SO4, 1 mmol·L-1CaCl2.2H2O, 1 mmol·L-1MgSO4·7H2O, 0.5 mmol·L-1Na2SiO3, 20 μmol·L-1NaFeEDTA, 20 μmol·L-1H3BO3, 9 μmol·L-1MnCl2·4H2O, 0.32 μmol·L-1CuSO4·5H2O, 0.77 μmol·L-1ZnSO4·7H2O和0.39 μmol·L-1Na2MoO4·2H2O, pH 5.5。苗期水培營養(yǎng)液每4～5 d 更換1 次，孕穗期開始每3 d 更換1 次。為了抑制硝化作用，營養(yǎng)液添加7 μmol·L-1dicyandiamide （DCDC2H4N4）。

1.2 N 營養(yǎng)配方

N 營養(yǎng)4 種濃度分別為0.05、0.5、2 和5 mmol·L-1, 用NH4NO3作為N 營養(yǎng)源，確保硝態(tài)氮（NO3+）:氨態(tài)氮（NH4+）= 1:1。

1.3 3 種主要的可溶性糖含量測定

水稻材料在拔節(jié)期開始時(shí)取樣。所有水稻植株材料取樣后迅速經(jīng)105 ℃高溫殺青0.5 h，再經(jīng)80 ℃烘12 h 。將干燥后的植株樣品分成根、葉鞘、葉和莖4部分，磨碎。測定主要參照文獻(xiàn)用高壓液相色譜方法（high pressure liquid chromatography，HPLC）測定3種可溶性糖[3-4]。糖分提取操作規(guī)程稍作如下改動：取磨碎后的樣品0.1 g放入5 mL離心管，加2 mL蒸餾水，80 ℃水浴提取10 min，3 000 r·min-1離心5 min，上清液轉(zhuǎn)入10 mL 具刻度試管或容量瓶中，剩余殘?jiān)^續(xù)以蒸餾水溶解離心2 次，確?？扇苄蕴翘崛〕浞?。上清液均轉(zhuǎn)入10 mL 試管中，定容，待測。

1.4 游離氨基酸含量測定

有常用的水合茚三酮法測定游離氨基酸的氨基可與水合茚三酮反應(yīng)，產(chǎn)生藍(lán)紫色化合物，其顏色的深淺與游離氨基酸的含量成正比。

1.5 色素含量測定

葉綠素的測定參照文獻(xiàn)[5]，步驟如下：取新鮮植物葉片或干材料，擦凈表面污物，將葉片剪碎（去掉中脈，寬度1～2 mm），混勻，準(zhǔn)確稱取剪好的葉片0.100 g（重復(fù)3～5 次）分別放到試管中，準(zhǔn)確加入95%乙醇（475 mL 無水乙醇定容到500 mL）20 mL， 塞緊試管塞，置暗處24 h（中間搖一次），然后在470 nm、649 nm 和665 nm 下比色。

由于葉綠體色素在不同溶劑中的吸收光譜有差異，因此，在使用其他溶劑提取色素時(shí)，計(jì)算公式也有所不同。葉綠素a、b 在95%乙醇中最大吸收峰的波長分別為665 nm 和649 nm，類胡蘿卜素為470 nm，可據(jù)此列出以下關(guān)系式：

式中:Ca、Cb分別為葉綠素a 和b 的濃度;Cx·c為類胡蘿卜素的總濃度;OD663、OD646和OD470分別為葉綠體色素提取液在波長663 nm、646 nm 和470 nm 下的光密度。

1.6 基因表達(dá)定量分析

用熒光實(shí)時(shí)定量PCR（quantitative real-time PCR，qRT-PCR）分析基因表達(dá)水平。首先用Rneasy kit（Qiagen）提取水稻各組織的總RNA，將至少2 mg總RNA 用RNase-free Dnase I（Invitrogen）消化DNA后，再用逆轉(zhuǎn)錄酶試劑盒（Promega）反轉(zhuǎn)錄得到cDNA。以O(shè)sACTIN2（Os05g36280）基因作內(nèi)參，內(nèi)參正向引物5′-GTCAATAACTGGGATGACATGGAG-3′和反向引物5′-AGCTTCATGTATGCCAGGAGATTC-3′[3]。其他所用儀器和試劑包括Real-time PCR Detection System （MyiQ Optical Module；Bio-Rad）和SYBR Green master mix（SYBR PremixEx TaqTMII；TaKaRa Biotechnology）。目標(biāo)基因和OsACTIN2樣品均一化稀釋比例分別為1:10、1:100 和1:1 000[6]。

所有基因的表達(dá)實(shí)時(shí)定量PCR 所用引物見表1。

表1 實(shí)時(shí)定量PCR 引物Table 1 Primers for qRT-PCR

2 結(jié)果與分析

為了系統(tǒng)而準(zhǔn)確地探究不同濃度外施N營養(yǎng)條件對水稻植株生長發(fā)育和C、N 代謝的影響效果，本研究選用常規(guī)粳稻品種日本晴作為水稻研究材料。在整個(gè)生育期均用營養(yǎng)液培養(yǎng)水稻植株材料。

從整個(gè)生長過程來看，在0.5 和2 mmol·L-1N營養(yǎng)條件下，水稻植株生長正常，生育期、株高、根系發(fā)育和分蘗數(shù)等性狀均為正常狀態(tài)，其中在2 mmol·L-1N 下，單株平均籽粒數(shù)（260 ?！ぶ?1）相對最接近正常大田的產(chǎn)量（圖 1（a）和（b））。高N 營養(yǎng)條件（5 mmol·L-1）下，株高、根系發(fā)育和結(jié)實(shí)率等性狀均受到抑制，分蘗數(shù)顯著增多，后期實(shí)粒數(shù)幾乎為零，盡管整個(gè)植株的生物量較高；而低N營養(yǎng)條件（0.05 mmol·L-1）下，水稻植株株高和分蘗數(shù)等農(nóng)藝性狀均受到顯著抑制，整個(gè)植株的生物量很低，后期雖然結(jié)實(shí)率不低，但總粒數(shù)和實(shí)粒數(shù)很少，平均每株實(shí)粒數(shù)只有5 粒左右（圖 1（a）和（b））。隨著N 濃度升高，葉片明顯更綠，植株生育期明顯延長，貪青狀態(tài)也更突出（圖 1（a）和（b））。

圖1 4 種濃度N 營養(yǎng)處理后植株的性狀表現(xiàn)Figure 1 Phenotype of rice plants under 4 kinds of N nutrition conditions

2.2 水稻植株內(nèi)主要的可溶性糖含量和代謝分析

光合作用主要合成碳水化合物，這些碳同化產(chǎn)物是植株生長發(fā)育的物質(zhì)和能量基礎(chǔ)[3,7-8]。為了明確外施N肥對水稻植株光合碳同化合成代謝的影響效果，我們在水稻拔節(jié)后測定4 種濃度N 營養(yǎng)處理的水稻各組織3 種主要的可溶性糖含量。結(jié)果表明，葡萄糖和果糖在各組織中的含量與N 營養(yǎng)濃度沒有顯著相關(guān)性；而葉片和莖稈中蔗糖含量變化與N 營養(yǎng)濃度呈現(xiàn)明顯的規(guī)律。正常濃度即0.5 和2 mmol·L-1N 營養(yǎng)條件下，水稻葉片內(nèi)蔗糖含量比高濃度（即5 mmol·L-1）條件下均高出7 倍，莖稈內(nèi)均高出2 倍左右；而在低濃度即0.05 mmol·L-1條件下，葉片和莖稈內(nèi)蔗糖含量更低（圖 2）。

圖2 4 種N 營養(yǎng)條件處理后水稻各組織內(nèi)主要的可溶性糖含量Figure 2 Contents of major soluble sugars in the rice plants under 4 kinds of N nutrition conditions

蔗糖是光合作用最主要的產(chǎn)物，也是光合碳同化產(chǎn)物轉(zhuǎn)運(yùn)的最主要形式[3,7-8]。而葉片為光合作用主要場所，同時(shí)，莖稈是蔗糖長距離運(yùn)輸（long-distance transport of sucrose）主要通道，因此，葉片和莖稈中蔗糖含量變化基本上反映了光合作用合成代謝水平[7-8]。由此可以看出，低N 條件很可能導(dǎo)致植株N 營養(yǎng)缺乏，光合碳同化作用降低，而高N 條件（5 mmol·L-1）則可能高度抑制水稻葉片中的光合作用。

因此，以上結(jié)果表明根吸收的N 營養(yǎng)直接影響到整體的光合作用，N 濃度0.5 和2 mmol·L-1營養(yǎng)條件最有利于水稻植株的光合作用。

2.3 水稻植株內(nèi)氨基酸代謝分析

為了系統(tǒng)地分析以上4 種濃度N 營養(yǎng)條件對水稻植株內(nèi)氨基酸代謝的影響效果，我們測定根、莖、葉鞘和葉等4 種組織中游離氨基酸含量。

表2—表5 數(shù)據(jù)分析清晰地表明，4 種N 濃度處理的根、莖、葉鞘和葉等4 種組織中游離氨基酸含量在0.05 和0.5 mmol·L-1N 條件下相對很低，而在2 和5 mmol·L-1N 條件下含量顯著提高，相較前兩者，至少升高1 倍以上?？傮w上看，大部分游離氨基酸水平隨著外施N 濃度增加而提高，說明N 代謝水平隨著N 營養(yǎng)濃度增加而提高，N營養(yǎng)促進(jìn)N 代謝。

表2 4 種N 營養(yǎng)濃度處理后水稻根內(nèi)游離氨基酸的含量Table 2 Contents of free amino acids in the rice roots under 4 kinds of N nutrition conditions

表3 4 種N 營養(yǎng)濃度處理后水稻莖內(nèi)游離氨基酸的含量Table 3 Contents of free amino acids in the rice stems under 4 kinds of N nutrition conditions

續(xù)表3

表4 4 種N 營養(yǎng)濃度處理后水稻葉鞘內(nèi)游離氨基酸的含量Table 4 Contents of free amino acids in the rice sheaths under 4 kinds of N nutrition conditions

表5 4 種N 營養(yǎng)濃度處理后水稻葉片內(nèi)游離氨基酸的含量Table 5 Contents of free amino acids in the rice leaves under 4 kinds of N nutrition conditions

2.4 水稻植株內(nèi)色素含量和代謝分析

從以上水稻植株表型可以看出，外施N 肥濃度越高，葉色更深綠（圖 1（a））。因此，我們在抽穗期取新鮮葉片，測定3 種色素，葉綠素a、葉綠素b 和類胡蘿卜素的含量。結(jié)果表明，在0.05 mmol·L-1到2 mmol·L-1N 營養(yǎng)范圍內(nèi)，植株內(nèi)3 種色素合成代謝隨著N 營養(yǎng)濃度升高而顯著提高，高N 即5 mmol·L-1N 營養(yǎng)條件并沒有顯著提高色素合成代謝，也就是說，2 mmol·L-1N 條件下色素合成已經(jīng)達(dá)到最高水平（圖 3）；在0.05 mmol·L-1N營養(yǎng)條件下，3 種色素的含量均只有2 mmol·L-1營養(yǎng)條件下的1/3 不到（圖 3）。這與上述植株表型的趨勢完全一致（圖 1），而與以上氨基酸在葉片中含量及蔗糖含量變化趨勢不完全一致（表 2）。

圖3 4 種N 濃度處理后水稻植株葉片中的色素含量Figure 3 Contents of pigments in the leaves of rice plants under 4 kinds of N nutrition conditions

2.5 4 種濃度N 營養(yǎng)對水稻植株內(nèi)一些C、N 代謝關(guān)鍵基因表達(dá)的影響

為了探究水稻植株對N 營養(yǎng)濃度變化響應(yīng)的分子機(jī)制，我們進(jìn)一步分析苗期水稻植株內(nèi)一些C、N代謝關(guān)鍵基因?qū)? 種N 濃度的表達(dá)響應(yīng)。首先是4個(gè)硝態(tài) N 轉(zhuǎn)運(yùn)關(guān)鍵基因，包括OsNRT2.1（Os02g02170）、OsNRT2.2（Os02g02190）、OsNAR2.1a（Os02g38230）和OsNAR2.1b（Os04g40410）。其中，OsNRT2.1和OsNRT2.2硝態(tài)氮轉(zhuǎn)運(yùn)關(guān)鍵基因，是硝態(tài)氮高親和基因，而OsNAR2.1a 和OsNAR2.1b與OsNRT2.1 和OsNRT2.2 蛋白互作，促進(jìn)硝態(tài)氮吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)，因此也參與硝態(tài)氮吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)。有意思的是，OsNRT2.1和OsNRT2.2是串聯(lián)重復(fù)同源基因（圖 4（a））；這些基因的表達(dá)均受硝態(tài)氮誘導(dǎo)[9-10]。OsNIA1和OsNIA2是水稻中重要的硝酸還原酶編碼基因，OsASN1編碼參與天冬酰胺 （asparagine）合成代謝的關(guān)鍵酶[11]。磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（phosphoenolpyruvate carboxylase，PEPC）催化磷酸烯醇式丙酮酸（phosphoeno lpyruvate）和HCO3-生成草酰乙酸和無機(jī)磷酸的不可逆反應(yīng)，參與植物光合碳同化等重要代謝。在植物，尤其是葉片組織細(xì)胞中，PEPC 編碼基因受到多種因素調(diào)控，從而直接影響碳同化效率。在C3 植物中，PEPC 為Lrebs 物質(zhì)循環(huán)補(bǔ)充四碳二羧酸從而調(diào)節(jié)回補(bǔ)反應(yīng)。水稻中共有5個(gè)PEPC編碼基因（Osppc1、Osppc2a、Osppc2b、Osppc3和Osppc4）, 這些PEPC 酶均位于葉綠體，其中Osppc4 是葉肉細(xì)胞中主要的PEPC 酶[12]。

圖4 4 種N 濃度處理后水稻植株4 個(gè)硝態(tài)氮轉(zhuǎn)運(yùn)關(guān)鍵基因在根部的表達(dá)響應(yīng)Figure 4 Expression response of 4 key nitrate N transport genes in root to 4 different N nutrition conditions

我們對30 d 左右的日本晴植株用上述4 種N 濃度營養(yǎng)液處理1 h 后，進(jìn)行熒光實(shí)時(shí)定量PCR（qRT-PCR）分析基因表達(dá)。可以看出，只有OsNRT2.1在0.5 mmol·L-1N 營養(yǎng)條件下表達(dá)顯著上調(diào)，上調(diào)幅度為1～3 倍。而其他N 濃度處理則沒有顯著的表達(dá)變化（圖 4（a）和（b））；有意思的是，OsNIA1、OsNIA2、OsASN1和OcPPC4個(gè)氮代謝關(guān)鍵基因在根部或葉片的表達(dá)響應(yīng)并不顯著（圖 5）。

圖5 4 種N 濃度處理后水稻植株4 個(gè)氮代謝關(guān)鍵基因在根部或葉片的表達(dá)響應(yīng)Figure 5 Expression response of 4 key N metabolism genes in root or leaf to 4 different N nutrition conditions

3 討論與結(jié)論

本研究系統(tǒng)分析全生育期內(nèi)不同N營養(yǎng)條件對水稻植株生物和發(fā)育的影響效果?？梢钥闯?，外施N 肥對蔗糖代謝和轉(zhuǎn)運(yùn)（光合碳同化）、氨基酸代謝及葉綠素合成代謝均有重要的影響。首先，蔗糖代謝和轉(zhuǎn)運(yùn)（光合碳同化）、葉綠素合成代謝，植株籽粒產(chǎn)量和結(jié)實(shí)率等性狀之間表現(xiàn)非常一致的變化趨勢，即在相對正常的N 營養(yǎng)濃度（0.5 和2 mmol·L-1）條件下，這些性狀均表現(xiàn)最大值。然而，水稻植株氨基酸代謝與外施N 營養(yǎng)濃度始終是成正比，這表明氨基酸代謝與蔗糖代謝和轉(zhuǎn)運(yùn)（光合同化作用）及色素合成代謝有不同的調(diào)控機(jī)制和調(diào)控途徑。

孟亞利等[12]在水稻地上部干物質(zhì)分配動態(tài)模擬的研究中發(fā)現(xiàn)環(huán)境因素中N 供應(yīng)水平對色素分配指數(shù)的影響最大, 水稻株體內(nèi)N 水平高, 分配給形成葉的同化物比例也大。王月福等[13]在施氮量對小麥耔粒蛋白質(zhì)組分含量及加工品質(zhì)影響的研究表明，增施氮肥能夠顯著提高籽粒蛋白質(zhì)各組分的含量，但各組分含量提高的幅度存在差異。本研究表明，水稻植株生長發(fā)育有一個(gè)比較狹窄的適宜N 營養(yǎng)濃度范圍。綜合來看，2 mmol·L-1N 是最適宜水稻生長發(fā)育的N 營養(yǎng)濃度條件。這個(gè)結(jié)論對指導(dǎo)水稻農(nóng)業(yè)生產(chǎn)具有重要的應(yīng)用價(jià)值，也清楚地表明，過度施N 肥不僅不能提高作物產(chǎn)量，反而導(dǎo)致水稻生長發(fā)育抑制，生育期延長，結(jié)實(shí)率降低等不利農(nóng)藝性狀特點(diǎn)。

本研究結(jié)果將為后續(xù)深入探究N 營養(yǎng)對水稻生長發(fā)育和C、N代謝的相關(guān)分子機(jī)制提供了前期基礎(chǔ)。