孔慶楊 董曉斌 王 英 班宏艷 郎曉多

吉林省婦幼保健院(吉林省產(chǎn)科質(zhì)量控制中心) 1 病理科 2 院長辦公室，吉林省長春市 130051； 3 吉林省雙遼市婦幼保健計(jì)劃生育服務(wù)中心細(xì)胞室； 4 吉林大學(xué)第一醫(yī)院病理中心； 5 吉林省婦幼保健院(吉林省產(chǎn)科質(zhì)量控制中心)體檢中心

通過巴氏染色涂片進(jìn)行宮頸涂片細(xì)胞學(xué)篩查是發(fā)達(dá)國家最有效和最具成本效益的癌癥篩查方法，可降低宮頸癌的發(fā)病率和死亡率[1]。然而，宮頸涂片篩查有顯著的假陽性和假陰性結(jié)果率[2]。為了改善巴氏涂片篩查癌前宮頸病變的更多細(xì)節(jié)，已經(jīng)開發(fā)了許多輔助測試[3-6]，包括薄層細(xì)胞學(xué)檢查;使用放大的化學(xué)發(fā)光篩查檢查(窺鏡檢查)與巴氏涂片相結(jié)合；細(xì)胞學(xué)和宮頸造影聯(lián)合使用; 自動復(fù)篩方法；通過雜交捕獲或聚合酶鏈反應(yīng)測試檢測人乳頭狀瘤病毒 DNA；通過端粒重復(fù)擴(kuò)增方案(TRAP)，傅里葉變換紅外(FTIR)光譜和p16INK4a蛋白的免疫細(xì)胞化學(xué)檢測來評估端粒酶的重復(fù)活性。然而，由于成本較高，這些新技術(shù)的可用性有限，在發(fā)展中國家的大規(guī)模篩查計(jì)劃中沒有任何作用。

最近有研究發(fā)現(xiàn)酸性磷酸酶在發(fā)育不良的宮頸細(xì)胞中有高活性。酸性磷酸酶(CAP)是多種溶酶體酶的總稱， 不存在于正常女性生殖道的鱗狀細(xì)胞中。子宮頸的再生前病變出現(xiàn)在含有CAP的轉(zhuǎn)化區(qū)，因此，低級別和高級別鱗狀上皮內(nèi)病變(分別為LSIL和HSIL)的異常細(xì)胞均呈CAP 陽性。其他病變?nèi)?ASC-H(非典型鱗狀細(xì)胞不能排除高級別SIL)和其他宮頸上皮內(nèi)瘤變(AGC)病變也表達(dá) CAP。非典型鱗狀細(xì)胞(ASC，根據(jù)宮頸TBS報(bào)告系統(tǒng))是指形態(tài)上提示為鱗狀上皮內(nèi)病變的細(xì)胞改變，但從質(zhì)量和數(shù)量上又不足以作出明確判斷。ASC不是一個(gè)單一的生物學(xué)實(shí)體，它包括與致瘤型人類乳頭瘤病毒感染無關(guān)的改變(炎性)、瘤變，也包括那些提示可能有潛在宮頸上皮內(nèi)瘤變(CIN)的情況，以及極少數(shù)的癌。這正是目前細(xì)胞形態(tài)學(xué)診斷無法解決的問題，此時(shí)若能聯(lián)合宮頸酸性磷酸酶檢測，并將有瘤變傾向的鱗狀上皮細(xì)胞標(biāo)記、區(qū)分開來，將會對臨床診斷和治療起到重要的作用，也是宮頸癌篩查細(xì)胞學(xué)診斷中的重大進(jìn)步。本研究旨在評估CAP在宮頸異常細(xì)胞中輔助診斷的效用，以幫助觀察異常鱗狀細(xì)胞和宮頸癌及癌前病變的篩查。

1 對象與方法

1.1 研究對象 收集近5年送檢本院134例患者宮頸標(biāo)本，經(jīng)常規(guī)液基薄層細(xì)胞學(xué)技術(shù)制片后被診斷為ASC-US，將其作為研究對象。其患者年齡33～64歲，平均年齡(48.80±6.96)歲。本研究經(jīng)醫(yī)學(xué)倫理委員會同意。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)18周歲<年齡<65周歲；(2)檢查時(shí)未處在生理期內(nèi)；(3)檢查前1周無性生活；(4)無局部用藥及陰道沖洗史。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)患者無法遵守研究中各項(xiàng)要求；(2)入選前3個(gè)月內(nèi)參與過其他相關(guān)臨床研究。

1.2 方法

1.2.1 染色試劑：一抗酸性磷酸酶(FSC-2201，合肥科久盛生物醫(yī)藥有限公司)，二抗、DAB顯色劑、PBS、抗體稀釋液、過氧化物酶封閉液、稀釋液(均為北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)，蘇木素染液(珠海貝索生物技術(shù)有限公司)。

1.2.2 樣本制備：采用經(jīng)過細(xì)胞學(xué)TBS報(bào)告系統(tǒng)診斷為ASC-US的婦科宮頸標(biāo)本，用沉降式液基細(xì)胞制片機(jī)制備薄層細(xì)胞片備用；采用Thermo自動免疫組織化學(xué)染色機(jī)進(jìn)行染色。

1.2.3 樣本染色步驟：(1)細(xì)胞涂片95%酒精固定； (2)PBS沖洗5min,2次；(3)加一抗稀釋液室溫孵育30min；(4)棄掉液體，加過氧化氫孵育10min；(5)滴加一抗酸性磷酸酶(按照1∶150稀釋比例)，室溫條件下孵育1h；(6)PBS沖洗3次；(7)滴加二抗30min；(8)PBS沖洗3次；(9)滴加DAB(1ml加1滴)5min；(10)PBS終止顯色；(11)蘇木素染色；(12)封片。

染色以鱗狀上皮化生或?qū)m頸腺上皮細(xì)胞為陽性對照，用抗體的孵育液作陰性對照。有經(jīng)驗(yàn)的且能熟練掌握判讀標(biāo)準(zhǔn)醫(yī)師進(jìn)行判讀，同時(shí)采用隨機(jī)雙盲法，陽性結(jié)果的判定標(biāo)準(zhǔn)為在含有豐富酸性磷酸酶的陽性對照的鱗狀上皮化生細(xì)胞中，光學(xué)顯微鏡下細(xì)胞漿內(nèi)可見明顯棕色顆粒。正常的鱗狀上皮、表層細(xì)胞中呈陰性，宮頸腺上皮細(xì)胞細(xì)胞漿中顯示均勻的棕色顆粒，在萎縮性反應(yīng)中，一些底層細(xì)胞可呈淺棕色著色，同時(shí)組織細(xì)胞也可以顯色[7]。

1.3 診斷標(biāo)準(zhǔn) 以TBS分類系統(tǒng)作為診斷標(biāo)準(zhǔn)。TBS報(bào)告主要包括[8]：(1)良性細(xì)胞學(xué)改變，主要包括感染(滴蟲感染、真菌感染、嗜血桿病形態(tài)感染、放線菌形態(tài)感染、HPV形態(tài)感染、單純皰疹形態(tài)感染)和炎癥。(2)上皮細(xì)胞異常改變：①腺上皮細(xì)胞改變，分為不典型的腺上皮細(xì)胞，無明確診斷意義，宮頸腺癌、子宮內(nèi)膜癌及其他腺癌；②異常鱗狀上皮細(xì)胞可分為：非典型鱗狀上皮細(xì)胞(ASC)：無明確診斷意義的非典型鱗狀上皮細(xì)胞(ASC-US)和非典型鱗狀上皮細(xì)胞，但高度鱗狀上皮內(nèi)病變(ASC-H)除外；低度鱗狀上皮內(nèi)病變(LSIL)；高度鱗狀上皮內(nèi)病變(HSIL)； 鱗狀細(xì)胞癌(SCC)。陽性CAP指ASC-US上方的病變。在用CAP染色的涂片中，宮頸管的正常細(xì)胞和一些單核細(xì)胞呈陽性，根據(jù)其形態(tài)可以排除。只有未成熟的CAP陽性鱗狀上皮細(xì)胞、核擴(kuò)張的鱗狀上皮細(xì)胞和核異型鱗狀上皮細(xì)胞被鑒定為CAP陽性細(xì)胞。

2 結(jié)果

2.1 酸性磷酸酶染色結(jié)果 正常鱗狀上皮化生細(xì)胞未檢測到CAP(見圖1)，其為細(xì)胞學(xué)染色的陰性對照；被檢測除棕色沉淀的鱗狀上皮細(xì)胞(見圖2)，CAP陽性表達(dá)，其為細(xì)胞學(xué)染色的陽性對照；ASC-US細(xì)胞中CAP陽性細(xì)胞內(nèi)有明顯棕色沉淀細(xì)胞，CAP陰性細(xì)胞無顯著沉淀(見圖3～4)；LSIL患者細(xì)胞和HSIL患者細(xì)胞中CAP表達(dá)均為陽性，有大片棕色沉淀在視野中(見圖5～6)。

圖1正常鱗狀上皮細(xì)胞， 圖2鱗化細(xì)胞，CAP CAP陰性表達(dá) 陽性表達(dá)

圖3ASC-US細(xì)胞CAP 圖4ASC-US細(xì)胞CAP 陽性表達(dá)(箭頭所指) 陰性表達(dá)

圖5低鱗狀上皮內(nèi)病變細(xì)胞 圖6高鱗狀上皮內(nèi)病變細(xì)胞CAP陽性表達(dá)(箭頭所指) CAP陽性表達(dá)(箭頭所指)

2.2 酸性磷酸酶結(jié)果與組織病理學(xué)結(jié)果比較 134例經(jīng)宮頸細(xì)胞學(xué)檢查被判斷為未明確意義的非典型鱗狀上皮細(xì)胞婦科宮頸標(biāo)本經(jīng)組織病理學(xué)檢查后發(fā)現(xiàn)，發(fā)生炎癥改變76例，LSIL 50例，HSIL 7例，鱗狀細(xì)胞癌1例。酸性磷酸酶染色發(fā)現(xiàn)，酸性磷酸酶在LSIL、HSIL、鱗狀細(xì)胞癌中均大量表達(dá)，而在大部分炎癥中未有表達(dá)，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

3 討論

子宮頸良性和惡性病變已被評估為多種組織化學(xué)反應(yīng)，包括核糖核酸、糖原、酸性磷酸酶、非特異性酯酶、葡萄糖醛酸酶和磷酸胺酶。其中，酸性磷酸酶因其易于使用細(xì)胞化學(xué)技術(shù)進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)定位而引起了相當(dāng)大的關(guān)注[9]。在正?；准?xì)胞、“非典型”基底細(xì)胞、組織細(xì)胞以及惡性鱗狀細(xì)胞中可見高酸性磷酸酶活性[10]。1997年酸性磷酸酶首次被提出用于檢測常規(guī)巴氏涂片上的非典型鱗狀細(xì)胞的作用[11]。

表1組織病理學(xué)結(jié)果與對應(yīng)酸性磷酸酶檢測結(jié)果

本研究對經(jīng)細(xì)胞學(xué)檢查為ASC-US的患者進(jìn)一步進(jìn)行CAP檢測，134例經(jīng)宮頸細(xì)胞學(xué)檢查被判斷為未明確意義的非典型鱗狀上皮細(xì)胞婦科宮頸標(biāo)本經(jīng)組織病理學(xué)檢查后發(fā)現(xiàn)，發(fā)生炎癥改變76例，LSIL 50例，HSIL 7例，鱗狀細(xì)胞癌1例。CAP染色發(fā)現(xiàn)，CAP在LSIL、HSIL、鱗狀細(xì)胞癌中均大量表達(dá)，在大部分炎癥中其表達(dá)呈陽性，且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

雖然技術(shù)簡單性和檢測病變的能力似乎對本次研究有利，但引入CAP檢測這一方法還確實(shí)存在許多解釋問題。本次檢測采用的修飾在評估核特征方面似乎在技術(shù)上較差。核細(xì)節(jié)是檢測非典型鱗狀細(xì)胞的最基本標(biāo)準(zhǔn)。在某些情況下，具有非常高宮頸酸性磷酸酶活性的宮頸內(nèi)膜細(xì)胞，其中棕色顆粒往往覆蓋細(xì)胞核，很難評估。需要嚴(yán)格避免過度染色。鱗狀化生細(xì)胞中存在酶活性意味著只有精通常規(guī)細(xì)胞病理學(xué)的人才能評估CAP涂片。否則所有帶有化生鱗狀細(xì)胞的涂片都將被認(rèn)為是陽性的，在沒有明確的核細(xì)節(jié)的情況下，這可以模仿非典型細(xì)胞并導(dǎo)致不正確的診斷。

CAP檢測在宮頸癌篩查中的作用需要更多的評估。篩查技術(shù)需要高靈敏度，以避免漏診、誤診[12]。CAP檢測最大效用是保證質(zhì)量和選擇宮頸涂片進(jìn)行重新篩查。CAP陽性有助于將注意力僅集中在重要細(xì)胞上，忽略CAP陰性細(xì)胞大大加快了篩選過程。還需要評估聯(lián)合行動方案在資源貧乏地區(qū)的作用。讓檢測人員之間通過酸性磷酸酶染色結(jié)果進(jìn)行篩選，將陽性涂片結(jié)果直接進(jìn)行進(jìn)一步檢查，這會比讓檢測人員篩查LSIL和HSIL要容易得多。

綜上所述，宮頸酸性磷酸酶對宮頸細(xì)胞學(xué)檢查結(jié)果為未明確意義的非典型鱗狀上皮細(xì)胞進(jìn)行明確診斷的主要作用可能是用于初始篩查或作為宮頸涂片質(zhì)量保證調(diào)查的輔助手段。此外，在缺乏經(jīng)驗(yàn)豐富的檢測人員的醫(yī)療環(huán)境下，酸性磷酸酶染色與常規(guī)巴氏涂片結(jié)合使用時(shí)，巴氏涂片的敏感性將有所提高，進(jìn)而能夠轉(zhuǎn)化為更有應(yīng)用價(jià)值的宮頸涂片篩查計(jì)劃。