陳杉彬,趙德義,姚逸萍,曹建全,趙文梅,孫偉, 楊海存,王德良,劉建波,郝飛克*

1(中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院有限公司，北京，100015)2(山東景芝白酒有限公司，山東 安丘，262100) 3(酒類品質(zhì)與安全國際聯(lián)合研究中心，北京，100015)

過量酒精攝入可能會導(dǎo)致多種疾病，包括肝臟疾病、口咽癌、食管癌、結(jié)腸癌等重大疾病和肌肉損失、記憶力衰退等潛在疾病[1-2]，其中酒精中毒和肝硬化是世界范圍內(nèi)最嚴(yán)重的健康問題[3]。這些疾病受多方面影響，大量研究證實了氧化應(yīng)激在酒精性疾病中的關(guān)鍵作用[4-5]。過量消耗酒精會導(dǎo)致肝臟產(chǎn)生大量的氧自由基，如超氧物、H2O2和·OH等。自由基參與了許多重要的生命過程，過量的自由基會破壞細(xì)胞原本的氧化穩(wěn)態(tài)平衡，就會對細(xì)胞的完整性造成損害，對細(xì)胞造成氧化損傷。酒精會誘導(dǎo)氧化應(yīng)激和活性氧的產(chǎn)生，誘導(dǎo)造成的氧化壓力對細(xì)胞大分子造成的嚴(yán)重?fù)p傷持續(xù)存在的同時，還可能會引起機體器官生理功能障礙[6-8]。自由基的堆積會引起生物大分子損傷，蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和DNA是主要攻擊靶點，過量的自由基造成氧化應(yīng)激損傷，如脂質(zhì)的破壞、酶的失活、引起DNA突變以及細(xì)胞膜的破壞，最終導(dǎo)致整個細(xì)胞被破壞，器官和系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)、形態(tài)、功能異常[9-10]。

普遍認(rèn)為，由2～9個氨基酸殘基所組成的小肽具有抗氧化活性，能夠提高機體免疫能力、抗疲勞、提高免疫調(diào)節(jié)、抗菌,抗應(yīng)激、鎮(zhèn)定、抗腫瘤、促進酒精代謝。從宣威火腿中提取的六肽(NPPKFD)可以預(yù)防自由基引起的疾病，還能夠防止酒精誘導(dǎo)造成的氧化應(yīng)激損傷[11]。亞麻環(huán)肽在亞麻籽油氧化過程中扮演著重要角色，具有較高的潛在藥物價值，或可用作藥物替代品[12]。短肽添加到動物飼料中，作為營養(yǎng)物質(zhì)能夠?qū)游锏南?、激素分泌和免疫功能等產(chǎn)生影響[13]。首次從白酒酒醅中發(fā)現(xiàn)的多肽Lys-Gly-Pro(KGP)和al-Pro-Asp(PD)具有很強的自由基清除能力，可能具有緩解氧化損傷的作用[14]。從白酒中檢測到三肽Pro-His-Pro(PHP)，已被證明具有一定的體外抑制血管緊張素轉(zhuǎn)換酶的能力，但其他方面仍未有深入研究。

小肽具體的抗氧化功能機理還不明晰，為探究其中可能的功能成分，利用高效液相色譜-四級桿-飛行時間質(zhì)譜法(high performance liquid chromatography-quadrupole-time of flight-mass spectrometry，HPLC-Q-TOF-MS)從一品景芝酒酒樣中檢測到一種三肽Pro-His-Pro(PHP)，從體內(nèi)、體外兩方面論證三肽PHP在肝損傷中的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗材料、試劑

Pro-His-Pro(PHP)，純度≥98%，吉爾生化有限公司，用超純水配制為150 g/L試劑保存，實驗時溶于52%ol食用酒精中。

人源肝細(xì)胞LO2，國家實驗細(xì)胞資源共享服務(wù)平臺，經(jīng)本實驗室傳代后液氮保存。

實驗動物，斯貝福生物技術(shù)有限公司，為49～56日齡雄性C57BL/6J小鼠，體重18～22 g，動物飼養(yǎng)溫度為(23±2)℃，相對濕度為(50±5)%，光照時間12 h/d，自由飲食，5只/籠，合籠飼養(yǎng)，實驗動物的相關(guān)處理均嚴(yán)格遵守實驗動物福利倫理與保護相關(guān)規(guī)定，并隨時接受實驗動物倫理委員會的監(jiān)督與檢查。許可證號為(JK)2021-W-003。

偶氮二異丁脒鹽酸鹽(2,2′-azobis-2-methyl-propanimidamide，AAPH)，純度≥98%，蘇州亞科公司；胎牛血清(fetal boine serum, FBS)、0.25%胰蛋白酶，Geminig公司；RPMI-1640培養(yǎng)液、雙抗青鏈霉素，GIBCO公司；細(xì)胞培養(yǎng)皿、96孔板、6孔板，康寧公司；CCK8試劑盒，日本同仁化學(xué)研究所；lysis buffer，貝博生物公司；超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、過氧化氫酶(catalase，CAT)、谷胱甘肽還原型(glutathione reduction，GSH)、丙二醛(malondialdehyde，MDA)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(glutamic-pyruic transaminase，ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(glutamic oxalacetic transaminase，AST)、堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)、總膽固醇(total cholesterol，TC)、血清中甘油三酯(triacylglycerol，TG)、高密度脂蛋白膽固醇(high density lipoprotein cholesterol，HDL-C)和低密度脂蛋白膽固醇(low density lipoprotein cholesterol，LDL-C)試劑盒，南京建成生物公司；PDF膜，默克公司；5×蛋白質(zhì)上樣緩沖液、BCA試劑盒，索萊寶公司；Marker，Bio-Rad公司；一抗：Nrf2、Keap1，英國Proteintech公司；GAPDH、二抗：Rabbit,美國CST公司；ECL曝光液，美國Merck millipore公司。

1.2 儀器與設(shè)備

NMYC-60C轉(zhuǎn)移脫色搖床，泰州諾米醫(yī)療器械有限公司；BG-power600、轉(zhuǎn)膜儀BG-erBLOT 101-540-001，北京百晶生物技術(shù)有限公司；chemiscope 6200化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)，北京市六一儀器廠；WD-9405B型水平搖床，沃德生物醫(yī)學(xué)儀器分公司；Mini-PROTEAN Tetra 電泳槽，美國Bio-Rad公司；Heraeus Pico 17離心機，美國賽默飛世爾科技公司;Eclipse Ci-L光學(xué)顯微鏡，日本尼康公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 細(xì)胞存活率測定

取處于指數(shù)生長期的LO2細(xì)胞，加入適量0.25%胰蛋白酶消化約2 min。用完全培養(yǎng)液(含10% FBS與1%雙抗的RPMI-1640培養(yǎng)液，下同)重懸細(xì)胞并接種于96孔板，每孔100 μL,細(xì)胞量1.6×104。分為空白組、正常對照組和不同劑量PHP組(0～6.4 mg/mL)，每組設(shè)3個復(fù)孔，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，取出培養(yǎng)板，每孔加入100 μL CCK8預(yù)混液[(完全培養(yǎng)液)∶(CCK8)=9∶1],繼續(xù)培養(yǎng)2 h后用酶標(biāo)儀于450 nm處測定每孔的吸光度值，重復(fù)3次，細(xì)胞存活率按公式(1)計算：

(1)

式中：OD實驗組，測定孔吸光度值；OD空白孔，無添加吸光度值；OD正常對照組，只加RPMI-1640培養(yǎng)基處理細(xì)胞吸光度值。

1.3.2 細(xì)胞氧化指標(biāo)測定

取處于指數(shù)生長期的LO2細(xì)胞，加入適量0.25%胰蛋白酶消化約2 min。用完全培養(yǎng)液重懸細(xì)胞并接種于6孔板，每孔2 mL,細(xì)胞量2×105。分為空白對照組、AAPH處理組(400 μmol/L)、低劑量PHP組(1 mg/mL)、中劑量PHP組(3 mg/mL)和高劑量PHP組(6 mg/mL)，分別用PHP預(yù)處理21 h后,用PHP+AAPH同時處理3 h,冷PBS清洗2遍后，用lysis buffer裂解細(xì)胞，進行BCA定量，測量CAT、GSH、SOD和MDA含量，并加入5×蛋白質(zhì)上樣緩沖液制樣，操作步驟按照試劑盒使用說明書進行。

1.3.3 實驗動物分組與造模

實驗小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后，將50只小鼠隨機分成5組，包括空白對照、食用酒精組、PHP低劑量組、PHP中劑量組、PHP高劑量組。其中食用酒精組、PHP低劑量組、PHP中劑量組和PHP高劑量組分別腹腔注射相同劑量的52%ol食用酒精，其中PHP低劑量組、PHP中劑量組、PHP高劑量組分別每天注射0.1、0.2和0.4 g/kg·bw PHP，培養(yǎng)30 d后，最后一次注射后禁食不禁水，8 h后，眼球取血，頸椎脫臼處死小鼠，取肝臟組織和血液進行后續(xù)實驗，其中，將右半部肝臟組織通過10%中性多聚甲醛固定制備石蠟切片，肝臟組織病理學(xué)變化采用HE染色后觀察；其余肝臟存-80 ℃低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.4 小鼠肝臟組織病理學(xué)檢查

肝臟組織用10%中性多聚甲醛固定24 h后轉(zhuǎn)入70%(體積分?jǐn)?shù)，下同)酒精溶液中脫水處理24 h，常規(guī)石蠟包埋后制作厚度約4 μm的切片，使用C8H10進行脫蠟處理，酒精梯度(95%、90%、80%、75%)脫水；蘇木精染色；鹽酸醇分化；0.5%伊紅染色后常規(guī)梯度酒精(75%、80%、90%、95%)脫水后經(jīng)100%乙醇I(10 min)，100%乙醇II(10 min)；最后經(jīng)二甲苯透明后中性樹膠封片，在光學(xué)顯微鏡下，選取不同的視野拍照并分析肝臟組織病理學(xué)變化。

1.3.5 小鼠肝功能和血脂水平的檢測

小鼠眼球取血，靜置30 min，3 000 r/min離心10 min，得到血清，并將其轉(zhuǎn)移至-80 ℃進行低溫保存。通過賴氏法檢測血清轉(zhuǎn)氨酶AST和ALT水平，具體操作步驟嚴(yán)格按照試劑盒使用說明書進行。小鼠體內(nèi)血清中TC、TG、HDL-C和LDL-C的水平分別通過COD-PAP法、GPO-PAP酶法、直接檢測法進行測定。具體操作步驟嚴(yán)格按照試劑盒使用說明書進行。

1.3.6 Western Blot 實驗操作

將所有蛋白樣品進行上樣，每個膠孔上樣10 μL，樣品兩側(cè)的泳道用10 μL的Marker進行上樣，空白膠孔加入10 μL 1× Loading Buffer補齊。每塊膠以20 mA的電流強度進行恒流電泳。在目的蛋白泳動至距膠下緣1 cm以上時結(jié)束或在溴酚藍到達膠的底端附近即可停止電泳，關(guān)閉電源，進行轉(zhuǎn)膜。將PDF膜完全浸濕于甲醇中，將膠卸下后保留分離膠，將轉(zhuǎn)膜夾黑面朝下，并按照海綿-濾紙-膠-PDF膜-濾紙-海綿的順序逐層擺放，將轉(zhuǎn)膜夾合上夾緊后放到轉(zhuǎn)膜槽中，加入適量電轉(zhuǎn)緩沖液。并置于冰水混合物中，恒壓120 ，運行60 min。將膜取出后用5%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))脫脂奶粉封閉液封閉，50 r/min，1 h。按照Marker標(biāo)記的區(qū)間將整張膜裁剪成合適的大小加入適量封閉液，按1:1 000的比例加入相應(yīng)的一抗，4 ℃孵育過夜。在室溫條件下用TBS/T漂洗3次，每次5 min。按照1:5 000的比例加入相應(yīng)的二抗，室溫，搖床孵育40 min。結(jié)束后，用TBS/T漂洗膜3次，每次5 min。進行化學(xué)顯影。

1.3.7 數(shù)據(jù)分析

用SPSS 23.0分析處理數(shù)據(jù)，組間檢驗采用t檢驗，P<0.01具有極顯著差異(用**表示)；P<0.05具有顯著差異(用字母標(biāo)記法表示)，所有實驗數(shù)據(jù)均為3個平行試驗的平均值，用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示；圖表由Origin 2018繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 對細(xì)胞存活率及相關(guān)氧化指標(biāo)的影響

用不同質(zhì)量濃度(0～6.4 mg/mL)的PHP處理LO2細(xì)胞24 h,與空白組相比較的結(jié)果見圖1-a。細(xì)胞存活率均在80%以上，PHP對LO2細(xì)胞增殖無明顯影響和毒性作用，細(xì)胞活力正常。

a-細(xì)胞存活率；b-SOD；c-CAT；d-GSH；e-MDA圖1 不同濃度PHP處理細(xì)胞的細(xì)胞存活率、SOD、CAT、GSH活力和MDA含量Fig.1 The cell iability enzyme actiity of SOD, CAT, GSH, and MDA content in different dose PHP treatment 注：不同小寫字母表示具有顯著差異(P<0.05)(下同)

選用0～6 mg/mL進行后續(xù)實驗，參考其他文獻[15]，選用AAPH(400 μmol/L)處理3 h進行氧化損傷模型構(gòu)造，由圖1-b～圖1-e結(jié)果可知，與空白組相比較，氧化相關(guān)指標(biāo)CAT、GSH活力均呈現(xiàn)不同程度的降低，MDA含量升高，均呈顯著性差異。SOD活力隨PHP濃度升高而略微升高。MDA含量隨PHP濃度升高呈現(xiàn)降低趨勢，與AAPH處理組間呈顯著差異(P<0.05)。CAT和GSH活力均隨PHP濃度升高而升高，與AAPH處理組間呈顯著差異(P<0.05)。綜合來看，小肽PHP能緩解AAPH造成的氧化應(yīng)激損傷，維持機體的氧化穩(wěn)態(tài)，可能是通過調(diào)控氧化應(yīng)激信號通路的響應(yīng)機制，使抗氧化物含量增加，緩解氧化壓力。

2.2 對細(xì)胞氧化通路的影響

小肽PHP能夠調(diào)控抗氧化物含量的增加，轉(zhuǎn)錄因子NF-E2相關(guān)因子2(nuclear factor erythroid-2-related factor 2，Nrf2)是調(diào)節(jié)蛋白CNC(CapN’ collar-bZIP)家族成員的轉(zhuǎn)錄激活因子，主要和胞漿蛋白伴侶分子(Kelch-like ECH-associated protein 1, Keap1)結(jié)合。在正常生理條件下，Nrf2的表達具有一定的穩(wěn)定性，通過泛素化以及蛋白酶體的降解作用維持和Keap1的動態(tài)平衡。當(dāng)機體出現(xiàn)過量活性氧時，使Nrf2在胞漿內(nèi)持續(xù)累積并轉(zhuǎn)移進入細(xì)胞核，進而結(jié)合基因啟動子區(qū)的ARE序列，通過激活下游抗氧化基因來保護細(xì)胞免受活性氧應(yīng)激物引起的損傷[16]。由圖2-a可知，與對照組相比，AAPH中Nrf2大量聚集，且在一定范圍內(nèi)，隨PHP濃度的升高而升高。同時，蛋白Keap1隨PHP濃度增高而略微增加，但在PHP為6 mg/mL時，Keap1蛋白較大幅度降低。明顯可以觀察到Nrf2是和Keap1解偶聯(lián)進入細(xì)胞核中進行相關(guān)表達發(fā)揮功能。其半定量結(jié)果與免疫印跡結(jié)果基本一致。

a-細(xì)胞氧化通路關(guān)鍵蛋白表達；b-半定量分析圖2 不同濃度PHP處理細(xì)胞氧化通路關(guān)鍵 蛋白表達和半定量分析Fig.2 The expression and expression leels of n-Nrf2, Keap1 were detected by western blotting analysis

2.3 對小鼠肝組織病理形態(tài)學(xué)的影響

通過蘇木精-伊紅染色，由圖3-a小鼠肝組織病理形態(tài)可見，空白對照組小鼠肝組織基本無明顯病理變化，肝組織排列緊密，肝細(xì)胞正常生長，無變性情況；食用酒精組小鼠局部肝細(xì)胞小灶性干酪樣壞死，胞核溶解，胞漿嗜酸性增強，伴少量炎性細(xì)胞浸潤。低濃度PHP組出現(xiàn)肝細(xì)胞胞漿疏松淡染，有少量的炎性細(xì)胞浸染(圖3-c)；中濃度PHP組肝細(xì)胞胞漿疏松淡染，伴隨一定量的炎性細(xì)胞(圖3-d)；高濃度PHP組少量的中性粒細(xì)胞浸潤，炎性細(xì)胞小灶性浸潤(圖3-e)。長期飲酒對肝細(xì)胞產(chǎn)生一定影響，主要包括肝細(xì)胞變性、炎性侵染等，但不同處理均有一定差別，PHP處理后，肝細(xì)胞狀態(tài)優(yōu)于未處理組，PHP能夠?qū)κ秤镁凭斐傻母螕p傷起到一定的保護作用，能夠減少酒精帶來的肝損傷危害。

a-空白對照組；b-食用酒精組；c-PHP低劑量組； d-PHP中劑量組；e-PHP高劑量組圖3 各組小鼠肝組織病理形態(tài)Fig.3 Hepatic histological morphology of mice in each group

2.4 對小鼠肝臟功能和血脂水平的影響

如圖4所示，與食用酒精組比較，PHP處理組小鼠在血清中AST、ALT活力均有一定程度降低，且在ALT活力上具有顯著性差異(P<0.05)。不同濃度PHP處理組AST活力分別是食用酒精組的0.936倍、0.909倍和0.894倍，但無顯著性差異。而不同濃度PHP處理組ALT活力不同程度的低于食用酒精組，其中中高劑量處理組與食用酒精組相比出現(xiàn)顯著性差異。不同濃度PHP處理組ALP活力與食用酒精組無顯著性差異。與食用酒精組相比，PHP不同劑量組小鼠血清中TC、TG、LDL-C含量相較食用酒精組出現(xiàn)降低的現(xiàn)象(P<0.05)，同時HDL-C含量上升；表明PHP能夠在一定程度上緩解食用酒精造成的肝損傷，但無法使這種損傷恢復(fù)至初始狀態(tài)。

a-AST；b-ALT；c-ALP；d-TC；e-TG；f-LDL-C；g-HDL-C圖4 不同濃度PHP處理對小鼠血清AST、ALT、ALP活性和TC、TG、LDL-C、HDL-C含量的影響Fig.4 The effect of PHP treatment on serum AST, ALT, and ALP actiity and TC, TG, LDL-C, and HDL-C content in mice

2.5 對小鼠氧化相關(guān)指標(biāo)的影響

酶類抗氧化系統(tǒng)主要包括SOD、CAT、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-Px)的GSH。其中MDA是氧化損傷造成脂質(zhì)過氧化的終產(chǎn)物，它在細(xì)胞內(nèi)過量累積會引起細(xì)胞代謝紊亂或功能缺失，最終可能導(dǎo)致細(xì)胞死亡，因此可以用抗氧化系統(tǒng)中的抗氧化酶和MDA含量反映機體細(xì)胞氧化損傷程度[17-18]。由圖5可知，與食用酒精組相比，PHP不同劑量處理組在氧化相關(guān)指標(biāo)CAT、GSH、SOD活力相較食用酒精組出現(xiàn)不同程度的升高，能夠使MDA不同程度的降低，但從SOD和GSH方面來看，不同濃度處理組相較于食用酒精組沒有出現(xiàn)顯著性差異，可能是抗氧化酶在對抗氧自由基時已經(jīng)消耗。綜合來看，酒精可能是通過影響氧化相關(guān)酶來造成肝損傷，PHP能夠提高氧化酶的活力進而恢復(fù)肝細(xì)胞內(nèi)氧化平衡，在一定程度上保護酒精造成的肝損傷。

3 結(jié)論與討論

為探究一品景芝酒中可能的有益成分，利用HPLC-Q-TOF-MS從一品景芝酒酒樣中檢測到一種三肽PHP。為探究PHP對緩解酒精性肝損傷可能的作用機理，通過使用不同濃度的PHP對人源肝細(xì)胞LO2及C57小鼠進行處理，觀察在氧化應(yīng)激條件下的LO2細(xì)胞情況及誘導(dǎo)型小鼠酒精性肝損傷的影響作用。通過AAPH處理LO2細(xì)胞后，測定其相應(yīng)抗氧化物酶含量，均能夠提高抗氧化酶活力，不同程度減少了由AAPH帶來的氧化損傷。同時，Nrf2-Keap1是抗氧化通路中的一條關(guān)鍵通路，在各種組織、器官中均能表達[19]。Nrf2也可能是調(diào)控酒精肝損傷的關(guān)鍵蛋白，利用Nrf2全身敲除小鼠證實，Nrf2的缺失能夠增加小鼠急性酒精暴露導(dǎo)致的死亡率[20-21]。當(dāng)氧化應(yīng)激后，Nrf2與Keap1解離，更多的Nrf2進入細(xì)胞核中發(fā)揮功能[22-23]。在一定范圍內(nèi)，隨PHP濃度的升高，核中的Nrf2蛋白表達升高。同時，PHP為6 mg/mL時，Keap1蛋白表達量降低，可能是因為在低濃度下的PHP對氧化應(yīng)激損傷沒有明顯的緩解作用。

a-CAT；b-SOD；c-GSH；d-MDA圖5 不同濃度PHP處理對CAT、SOD、GSH活力和MDA含量的影響Fig.5 The effect of PHP treatment on CAT, SOD, GSH actiity and MDA content

病理切片顯示，食用酒精組小鼠肝組織已經(jīng)受到了一定的損害，發(fā)生炎性改變；PHP各濃度處理組肝細(xì)胞變性數(shù)量及情況均要優(yōu)于食用酒精組小鼠。同時對不同組小鼠肝臟健康相關(guān)指標(biāo)進行比較，結(jié)果表明在食用酒精組中，血清AST、ALT、TC、TG、LDL-C水平均要高于PHP組，同時HDL-C含量明顯低于PHP組。所有肝臟相關(guān)指標(biāo)均能夠表明，通過用PHP處理酒精性肝損傷小鼠，確實能夠在一定程度上緩解酒精性肝損傷的產(chǎn)生。目前研究表明酒精能夠產(chǎn)生氧化應(yīng)激引起機體產(chǎn)生相應(yīng)反應(yīng)。乙醇代謝產(chǎn)物乙醛可直接與組織SOD、GSH-Px等抗氧化酶和抗氧化蛋白GSH結(jié)合而導(dǎo)致抗氧化酶活性下降,造成系統(tǒng)抗氧化功能降低[24]。能夠發(fā)現(xiàn)PHP處理組中的氧化相關(guān)指標(biāo)CAT、GSH、SOD活力均比食用酒精組有不同程度的升高，MDA含量降低。

目前研究結(jié)果表明，三肽PHP不光能夠在體外抑制血管緊張素轉(zhuǎn)換酶，具有一定的抗氧化能力，同時也能證明PHP是通過調(diào)控抗氧化物酶的活力來緩解氧化應(yīng)激損傷，保持氧化水平，但這種緩解能力是有一定限度的，可能是PHP直接作用于抗氧化通路的某些關(guān)鍵蛋白帶來的影響。PHP能夠通過減少氧化應(yīng)激，達到減緩酒精帶來的肝臟損害。