關(guān)猛猛，劉春瑩，魚紅閃*

1(大連工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院，遼寧 大連，116034)2(大連大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，遼寧 大連，116622)

人參植物的主要活性成分是人參皂苷，在人參植物中已發(fā)現(xiàn)了超過150種的人參皂苷[1-2]。人參皂苷Rc是人參植物中主要皂苷之一，在人參和西洋參中的含量豐富，其中人參和西洋參根總皂苷中的Rc質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)12%～17%，莖葉總皂苷中Rc質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)5%～9%[3-4]。人參皂苷Rc具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤、調(diào)節(jié)血脂、預(yù)防糖尿病和保護(hù)神經(jīng)系統(tǒng)的藥理功能[5-6]，但其人體吸收率低，生理活性弱[7-8]。研究表明，人參皂苷生理活性與人參皂苷分子糖基數(shù)量有關(guān)，皂苷糖基數(shù)量越少其皂苷人體吸收率越高，生物利用度和藥理活性越高[8-12]。人參皂苷Rc分子有3-O-β-D-Glc-(1-2)-β-D-Glc和20-O-α-L-Araf-(1-6)-β-D-Glc等4個(gè)糖基，因此，Rc藥理活性低于3個(gè)糖基的稀有皂苷C-Mc1及2個(gè)糖基的稀有皂苷C-Mc[8,13]。而人參皂苷C-Mc和C-Mc1在人參、西洋參等人參植物中幾乎不存在[4,13]，因此將人參中含量高的Rc皂苷轉(zhuǎn)化為稀有皂苷C-Mc1和C-Mc，將會(huì)大大提高Rc的生物利用度，對人參類制品和藥物的開發(fā)具有重要意義。

為了得到稀有人參皂苷C-Mc1和C-Mc，UPADHYAYA等[14]從Armillariamellea菌絲中分離篩選出能水解β-葡萄糖苷的酶，該酶分子質(zhì)量為121.5 kDa，能將人參皂苷Rc轉(zhuǎn)化為C-Mc和C-Mc1，但大量制備的可行性有待于進(jìn)一步研究驗(yàn)證。課題組曾用Aspegillusnigerg.848發(fā)酵得到人參皂苷酶I型并利用該酶將一些二醇類人參皂轉(zhuǎn)化為稀有皂苷C-Mc、C-Y、F2和C-K[15-16]，但其產(chǎn)物分離工序復(fù)雜且沒有制備C-Mc1。TEN等[17]利用Sphingopyxissp.BG97轉(zhuǎn)化制備了稀有皂苷C-Mc1，但沒有制備C-Mc。本課題組在前期的研究中，篩選到Terrabacterginsenosidimutans菌能產(chǎn)人參皂苷酶，調(diào)取到該酶基因，轉(zhuǎn)化至Escherichiacoli上，表達(dá)得到人參皂苷酶。進(jìn)一步的研究表明，該酶能水解Rb1和Rb2等人參二醇皂苷的3-O-葡萄糖基，生成Gyp17、Gyp75、C-O和C-Y等稀有皂苷[18-19]。本文主要研究了基因工程菌產(chǎn)人參皂苷3-O-β-D-葡萄糖苷酶的性質(zhì)，系統(tǒng)研究了該酶水解人參皂苷Rc的3-O-β-D-葡萄糖基催化特性，建立了酶轉(zhuǎn)化制備C-Mc1和C-Mc的方法，以期為今后人參成分的保健食品、化妝品和人參藥物開發(fā)，提供新原料稀有人參皂苷，也為其產(chǎn)業(yè)化提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

人參皂苷標(biāo)準(zhǔn)品C-K、Rc、Rh2、C-Mc1和C-Mc，成都樂科技有限公司；薄層色譜硅膠板，杭州禾慧化工有限公司；克隆用試劑盒EzCloning Kit和pGEX 4T-1(GST基因融合載體)，韓國Enzynomics公司。

Waters 2695色譜儀，美國Waters公司；Unitary C18柱(5 μm，Φ3 mm×250 mm)，華譜新創(chuàng)科技有限公司；蛋白色譜柱TOSOH TSK-Gel-2000 SW(Φ7.8 mm×300 mm)，日本TOSOH生物科學(xué)公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 酶的制備與純化

將T.ginsenosidimutans(Gsoil 308 2T)的人參皂苷3-O-β-D-葡萄糖苷酶DNA片段(bgpA，1 947 bp)，利用EzCloning Kit試劑盒，插入于pGEX 4T-1(GST基因融合載體)，形成GST-bgpA融合基因，再轉(zhuǎn)入E.coliC41(DE3)細(xì)胞表達(dá)，其細(xì)胞在LB-氨芐青霉素培養(yǎng)基中40 ℃培養(yǎng)到OD600=0.6時(shí)加入0.5 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)蛋白表達(dá)(20 ℃，12 h)。冷凍離心收集細(xì)胞，用磷酸鈉緩沖液(含5 mmol/L的EDTA和體積分?jǐn)?shù)1%的Triton X-100)洗滌后將細(xì)胞懸浮于0.05 mol/L的pH 7.0磷酸鈉緩沖液中，用超聲波破碎法破碎細(xì)胞，離心除去不溶物。上清液經(jīng)谷胱甘肽-Sepharose 4B柱分離得到了帶有GST標(biāo)簽的融合蛋白，用凝血酶處理切割GST標(biāo)簽，得到以包涵體形式表達(dá)的目的蛋白(原體凍干粉)。

將上述克隆表達(dá)的目的蛋白凍干粉200 mg與尿素14.4 g， 10 μL巰基乙醇和30 mL磷酸緩沖液(pH 7.0，0.02 mol/L)混合，常溫下輕微搖晃2 h使包涵體被充分溶解，再加入1.2 L磷酸緩沖液(含有體積分?jǐn)?shù)5%的甘油、0.5 g/L聚乙二醇、體積分?jǐn)?shù)0.003 7%巰基乙醇、0.1 g/L NaCl)混合均勻，待恢復(fù)酶蛋白空間結(jié)構(gòu)后即為粗酶液，4 ℃保存待用。

上述粗酶液經(jīng)通過Capto Q陰離子交換層析[20]分離純化，得到人參皂苷3-O-β-D-葡萄糖苷酶。通過HPLC和SDS-PAGE法檢測確定其為純酶，酶的分子質(zhì)量測定以標(biāo)準(zhǔn)蛋白的分子質(zhì)量為依據(jù)，SDS-PAGE法測定。

人參皂苷3-O-β-D-葡萄糖苷酶對人參皂苷Rc的催化反應(yīng)：將0.2 mL 4 g/L的人參皂苷Rc與0.2 mL的酶液混合(pH 5.0)，在40 ℃分別反應(yīng)6、16、36 h，采用HPLC方法檢測，計(jì)算底物和產(chǎn)物含量比例。酶活力定義為最適反應(yīng)條件下，每小時(shí)水解1 mmol底物所需酶量為1個(gè)酶活力單位。

1.2.2 純酶的最適pH和最適溫度

取0.1 mL 4 g/L的人參皂苷Rc溶液在不同pH的磷酸緩沖液體系下與等體積純酶反應(yīng)，在40 ℃下反應(yīng)6 h后經(jīng)薄層色譜(thin-layer chromatography，TLC)檢測，以pH為橫坐標(biāo)，相對酶活力為縱坐標(biāo)作圖，確定最適pH。

取0.1 mL 4 g/L的人參皂苷Rc溶液(pH 7.0)在不同溫度下與等體積純酶反應(yīng)6 h，TLC檢測相對酶活力，以溫度為橫坐標(biāo)，相對酶活力為縱坐標(biāo)作圖，確定酶的最適溫度。

1.2.3 酶反應(yīng)動(dòng)力學(xué)

上述人參皂苷3-O-β-D-葡萄糖苷酶米氏常數(shù)Km和最大酶反應(yīng)速度max測定：配制濃度為10、13.3、20、26.7、40 mmol/L的人參皂苷Rc溶液，在40 ℃分別反應(yīng)0.5、1、1.5、2、2.5 h；其反應(yīng)液經(jīng)HPLC分析，計(jì)算底物減少初速度，建立1/S對1/曲線(Linweaer-Burk plots)[21]，得到Km和m值，其米氏方程如公式(1)所示：

(1)

1.2.4 底物濃度和時(shí)間對粗酶反應(yīng)的影響

用pH 7.0磷酸緩沖液配制0.2 mL的質(zhì)量濃度為10、20、50、100 g/L的人參皂苷Rc溶液，與等體積粗酶液混合，使最終人參皂苷Rc質(zhì)量濃度為5、10、25、50 g/L，40 ℃反應(yīng)24 h。TLC檢測人參皂苷Rc的轉(zhuǎn)化，確定最佳底物濃度。

取0.2 mL 10 g/L的人參皂苷Rc溶液與等體積酶液在40 ℃下分別反應(yīng)3、12、24、40、60 h，TLC檢測人參皂苷Rc的轉(zhuǎn)化，確定最佳反應(yīng)時(shí)間。

1.2.5 利用粗酶制備稀有皂苷C-Mc和C-Mc1

C-Mc的制備：將8 g人參皂苷Rc在最佳條件下與粗酶反應(yīng)60 h，然后在預(yù)先裝好的AB-8大孔樹脂柱上過柱，待皂苷都吸附在樹脂后用去離子水洗去蛋白和糖類，然后用體積分?jǐn)?shù)90%的乙醇將皂苷全部洗脫下來，再經(jīng)D-280樹脂脫色，過濾旋蒸后得到C-Mc單體皂苷。

C-Mc1的制備：在粗酶最佳轉(zhuǎn)化條件下，將40 g人參皂苷Rc與粗酶反應(yīng)24 h，然后經(jīng)AB-8大孔樹脂柱純化和D-280樹脂脫色，得到C-Mc1和C-Mc的混合品，其混合品經(jīng)硅膠柱分離，得到C-Mc1和C-Mc單體產(chǎn)物。

硅膠柱層析：將混合皂苷用工業(yè)甲醇溶解，可加入少量氯仿促進(jìn)溶解，加入樣品質(zhì)量2.5倍的80～100目硅膠，不斷攪拌蒸干，碾碎后即為樣品膠。將15倍樣品質(zhì)量的300～400目分離膠均勻裝在柱內(nèi)壓實(shí)，下端用脫脂棉塞緊。樣品膠均勻鋪在分離膠上，并用3層脫脂棉覆蓋壓實(shí)，然后用氯仿-甲醇洗脫液洗脫，柱的下端放置100 mL三角瓶接取洗脫液，每瓶洗脫液都經(jīng)TLC檢測確定其中皂苷種類。

1.2.6 檢測方法

TLC檢測：根據(jù)點(diǎn)樣的數(shù)量裁剪合適尺寸的硅膠板，距離板底部0.7 cm出作點(diǎn)樣線，樣品間距3 cm，用毛細(xì)管吸取樣品進(jìn)行點(diǎn)樣，然后放入展開劑中，待展開劑到距頂部3 cm時(shí)放入顯色劑中，硅膠板完全浸濕用熱吹風(fēng)吹干。展開劑為(正丁醇)∶(乙酸乙酯)∶(水)=4∶1∶2。顯色劑為體積分?jǐn)?shù)10%的硫酸，在100 ℃下顯色。用Bandscan 5.0軟件對TLC板上點(diǎn)的面積、顏色深淺進(jìn)行分析。

人參皂苷的HPLC檢測：2 mg樣品溶于1 mL色譜甲醇待檢測，流動(dòng)相：乙腈(A)-水(B)：0～20 min，20% A；20～31 min，20%～32% A；31～40 min，32%～43% A；40～70 min，43%～100% A。進(jìn)樣量10 μL，柱溫35 ℃，體積比流速0.6 mL/min，檢測波長203 nm。

酶蛋白的HPLC檢測：流動(dòng)相為含有0.5 g/L的NaN3的0.02 mol/L磷酸緩沖液(pH 6.7)，進(jìn)樣量20 μL，柱溫35 ℃，體積比流速1.0 mL/min。

2 結(jié)果與分析

2.1 酶的純化結(jié)果及其催化特性

酶的純化結(jié)果如圖1所示，純化后的酶在HPLC檢測中是單峰(圖1-a)；在SDS-PAGE中為單帶(圖1-b)，即可判斷純化后的酶為單一蛋白。依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)蛋白的分子質(zhì)量，通過SDS-PAGE所計(jì)算出酶蛋白的分子質(zhì)量為72.4 kDa，與T.ginsenosidimutans菌的人參皂苷酶基因序列(bgpA，1 947 bp)翻譯后的氨基酸序列分子質(zhì)量(理論值)基本相符。

a-HPLC圖；b-SDS-PAGE圖[1-目的蛋白， 2-標(biāo)準(zhǔn)蛋白：磷酸酶b(97.2 kDa)，牛血清蛋白(66.4 kDa)、 卵清蛋白(44.3 kDa)、碳酸苷酶(29.0 kDa)、胰蛋白酶 抑制劑(20.1 kDa)和溶菌酶(14.3 kDa)]圖1 純酶的HPLC和SDS-PAGE圖Fig.1 Purified recombinant enzyme in HPLC and SDS-PAGE analysis

為了解人參皂苷3-O-β-D-葡萄糖苷酶對Rc的催化特性，對人參皂苷Rc不同酶反應(yīng)時(shí)間的反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行HPLC分析，結(jié)果如圖2-a所示。酶反應(yīng)6 h，50%以上的人參皂苷Rc反應(yīng)生成C-Mc1；反應(yīng)16 h，大部分人參皂苷Rc反應(yīng)生成C-Mc1和少量C-Mc；當(dāng)反應(yīng)36 h，人參皂苷Rc全部反應(yīng)生成C-Mc1和C-Mc。如圖2-b所示，該異源表達(dá)的人參皂苷3-O-β-D-葡萄糖酶催化人參皂苷Rc的過程為：先水解人參皂苷Rc的3-O-β-D-葡萄糖基生成C-Mc1，再水解C-Mc1的3-O-β-D-葡萄糖基生成C-Mc。

a-不同酶反應(yīng)時(shí)間人參皂苷Rc的酶解產(chǎn)物的HPLC圖； b-人參皂苷3-O-β-D-葡萄糖酶水解Rc的反應(yīng)式圖2 人參皂苷3-O-β-D-葡萄糖酶水解Rc的反應(yīng)Fig.2 Ginsenoside Rc hydrolysis by recombinant ginsenoside-3-O-β-D-glucosidase 注：A-酶反應(yīng)6 h的產(chǎn)物；B-酶反應(yīng)16 h的產(chǎn)物； C-酶反應(yīng)36 h的產(chǎn)物

2.2 純酶的最適pH和最適溫度

2 g/L的人參皂苷Rc在不同pH磷酸緩沖液反應(yīng)體系下與純酶反應(yīng)6 h，其酶活力如圖3所示，人參皂苷3-O-β-D-葡萄糖苷酶反應(yīng)的最適pH為7.0。

圖3 不同pH對人參皂苷3-O-β-D-葡萄糖 酶活力的影響Fig.3 Effect of different pH on ginsenoside-3-O- β-D-glucosidase actiity

2 g/L的人參皂苷Rc在pH 7.0條件下，在不同溫度中與純酶反應(yīng)6 h。其酶活力檢測結(jié)果如圖4所示，酶反應(yīng)的最適溫度為40 ℃。

圖4 不同溫度對人參皂苷3-O-β-D-葡萄糖 酶活力的影響Fig.4 Effect of different temperature on ginsenoside- 3-O-β-D-glucosidase actiity

綜上可知，人參皂苷3-O-β-D-葡萄糖苷酶水解Rc最適pH為7.0，最適溫度為40 ℃。

2.3 酶反應(yīng)動(dòng)力學(xué)

人參皂苷3-O-β-D-葡萄糖苷酶米氏常數(shù)Km和最大酶反應(yīng)速度max測定：底物濃度[S]為10、13.3、20、26.7、40 mmol/L人參皂苷Rc，在40 ℃分別進(jìn)行酶反應(yīng)0.5、1、1.5、2、2.5 h；經(jīng)HPLC分析，計(jì)算底物減少的初速度，建立1/S對1/值(表1)的曲線(Linweaer-Burk plots)，如圖5所示，得到Km值為6.25 mmol/L，m值為19.6 mmol/(h·L)。根據(jù)米氏方程：人參皂苷Rc濃度為5 mmol/L時(shí)酶反應(yīng)速度為=8.67 mmol/(h·L)。

表1 不同底物濃度的酶促反應(yīng)初速度Table 1 The initial reaction rate of pure enzyme with Rc at different substrate concentrations

圖5 人參皂苷3-O-β-D-葡萄糖苷酶的雙倒數(shù)圖Fig.5 Linweaer-Burk plot of combinant ginsenoside- 3-O-β-D-glucosidase

2.4 底物濃度和時(shí)間對粗酶反應(yīng)的影響

由于酶的純化成本高，如下用粗酶轉(zhuǎn)化制備C-Mc和C-Mc1。通過1.2.1中的方法制得了粗酶液，為了解粗酶的反應(yīng)條件，探討了pH和溫度對粗酶反應(yīng)的影響，其結(jié)果與純酶相同。

進(jìn)一步探討了粗酶制備C-Mc1的最佳底物濃度，如圖6所示。5 g/L的Rc皂苷酶反應(yīng)24 h，人參皂苷Rc完全反應(yīng)，產(chǎn)物主要為C-Mc1和C-Mc；10和25 g/L的Rc皂苷酶反應(yīng)24 h，人參皂苷Rc幾乎全部轉(zhuǎn)化為C-Mc1；50 g/L的Rc皂苷酶反應(yīng)24 h，只有部分Rc皂苷轉(zhuǎn)化為C-Mc1。因此，要從Rc皂苷制備C-Mc1，需酶反應(yīng)體系中人參皂苷Rc質(zhì)量濃度為10～25 g/L；要制備C-Mc皂苷，需酶反應(yīng)體系中人參皂苷Rc質(zhì)量濃度為5 g/L。

a,b,c,d,e分別為Rc、C-Mc1、C-Mc、C-K、Rh2人參皂苷標(biāo)準(zhǔn)品； 1～4分別為底物質(zhì)量濃度5、10、25、50 g/L圖6 不同Rc底物質(zhì)量濃度對粗酶反應(yīng)的影響TLC圖Fig.6 Effect of Rc concentration on crude enzyme reaction by TLC

反應(yīng)時(shí)間對粗酶反應(yīng)的影響如圖7所示，5 g/L的Rc酶反應(yīng)3 h和12 h，部分人參皂苷Rc被反應(yīng)生成C-Mc1；反應(yīng)24 h，人參皂苷Rc幾乎全部反應(yīng)，生成大量C-Mc1和少量的C-Mc；反應(yīng)40 h，主要產(chǎn)物為C-Mc1和C-Mc；反應(yīng)60 h，Rc全部反應(yīng)生成C-Mc。

a,b,c,d,e分別為Rc、C-Mc1、C-Mc、C-K、Rh2人參皂苷標(biāo)準(zhǔn)品； 1～5分別為反應(yīng)時(shí)間3、12、24、40、60 h的產(chǎn)物圖7 反應(yīng)時(shí)間對Rc粗酶反應(yīng)的影響TLC圖Fig.7 Reaction time effect on ginsenoside Rc crude enzyme reaction by TLC

綜上可知，利用粗酶轉(zhuǎn)化人參皂苷Rc制備C-Mc1，需10～25 g/L的Rc在40 ℃下反應(yīng)24 h；制備C-Mc，需5 g/L的Rc在40 ℃下反應(yīng)60 h。

2.5 利用粗酶制備稀有皂苷C-Mc和C-Mc1

C-Mc的制備：將8 g的Rc皂苷(7.4 mmol)配制成800 mL質(zhì)量濃度為10 g/L的人參皂苷Rc溶液，再與等體積粗酶液混合(最終人參皂苷Rc質(zhì)量濃度為5 g/L)，在40 ℃下反應(yīng)60 h，吸附、洗脫并脫色后，最后將乙醇洗脫液過濾，旋蒸得到5.2 g(6.9 mmol)的C-Mc單體，經(jīng)HPLC檢測，其純度達(dá)到90%以上(圖8)，C-Mc的摩爾得率高達(dá)93.2%。

C-Mc1的制備：將40 g底物Rc(37.1 mmol)配制成1 L的人參皂苷Rc溶液，與等體積粗酶液在40 ℃條件下攪拌反應(yīng)24 h(人參皂苷Rc終濃度為20 g/L)，吸附、洗脫并脫色后，過濾旋蒸得到30 g的C-Mc和C-Mc1混合品。將混合品用甲醇溶解，再與80～100目硅膠混合攪拌，蒸干后均勻鋪在預(yù)先裝好的分離膠上方，用純氯仿通柱，然后用(氯仿)∶(甲醇)=8.5∶1.5的洗脫液洗脫，分別收集合并C-Mc1和C-Mc的洗脫液，過濾旋蒸后得到25.5 g的C-Mc1(27.8 mmol)和3.1 g的C-Mc(4.1 mmol)單體，經(jīng)HPLC檢測，其純度都在90%以上(圖8)，C-Mc1的摩爾得率為74.9%，C-Mc的摩爾得率為11.1%。

圖8 粗酶轉(zhuǎn)化Rc制備的稀有人參皂苷C-Mc1和 C-Mc單體HPLC圖Fig.8 The HPLC of ginsenoside C-Mc1 and C-Mc from Rc by crude enzyme reaction

3 結(jié)論與討論

利用E.coli細(xì)胞異源表達(dá)了來自T.ginsenosidimutans菌的人參皂苷3-O-β-D-葡萄糖苷酶，經(jīng)測定酶分子質(zhì)量為72.4 kDa，確定了酶最適反應(yīng)pH為7.0，最適反應(yīng)溫度40 ℃，Km值為6.25 mmol/L，m值為19.6 mmoL/(h·L)。該酶能水解人參中含量較高的人參皂苷Rc的末端3-O-β-D-葡萄糖基，生成稀有皂苷C-Mc1, 進(jìn)一步水解C-Mc1的3-O-β-D-葡萄糖基生成稀有皂苷C-Mc。

利用基因工程菌制取的粗酶，轉(zhuǎn)化Rc皂苷制備C-Mc1和C-Mc中，20 g/L的Rc粗酶反應(yīng)24 h，C-Mc1摩爾得率達(dá)74.9%，C-Mc摩爾得率為11.1%，并經(jīng)硅膠柱分離可得C-Mc1和C-Mc單體皂苷；5 g/L的Rc粗酶反應(yīng)60 h，C-Mc的摩爾得率高達(dá)93.2%，文中所述的酶轉(zhuǎn)化Rc皂苷制備C-Mc1和C-Mc的方法，為今后高活性稀有人參皂苷C-Mc1和C-Mc的產(chǎn)業(yè)化提供依據(jù)。