馬永慶，嚴(yán)建剛，魏穎*，徐亞光，張瑞雪，秦修遠

1(北京市蛋白功能肽工程技術(shù)研究中心，北京，100015)2(完美(廣東)日用品有限公司，廣東 中山，528451)

皮膚是機體的生理屏障，保護機體免受病原體、化學(xué)或物理損傷，它也是直接暴露于紫外線輻射的器官[1]。紫外線中波(ultraiolet B，UB)主要作用于皮膚的表皮層和真皮淺層中的成纖維細胞，使結(jié)締組織發(fā)生重建，膠原合成減少，造成皮膚損傷，甚至導(dǎo)致癌癥[2-3]。其調(diào)控機制包括氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)、細胞凋亡等[4]。膠原蛋白是哺乳動物分布最為廣泛的蛋白質(zhì)之一，約占人體內(nèi)總蛋白質(zhì)含量的25%～30%，占人體皮膚蛋白質(zhì)的71.2%[5]，一旦缺乏膠原蛋白，皮膚會出現(xiàn)色斑、缺水、粗糙、皺紋加深等一系列老化現(xiàn)象[6]，因此保護和補充真皮中的膠原蛋白對于美容護膚有重要意義。

目前，歐美、日韓等多個國家采用注射膠原蛋白的方法來修復(fù)面部問題，市場中大量的口服補充膠原蛋白類產(chǎn)品也層出不窮。膠原肽是一種將膠原蛋白經(jīng)生物酶解精制后得到的由多種短肽組成的混合物。相對于膠原蛋白，膠原肽保證了優(yōu)良營養(yǎng)特性的同時，還兼顧了更多的生物活性，如抗氧化、降血壓、增強免疫作用等[7-9]。膠原肽對于皮膚的影響也受到了廣泛關(guān)注，如口服攝入膠原肽可通過調(diào)節(jié)透明質(zhì)酸的合成來緩解UB誘導(dǎo)的皮膚干燥[10]，也可通過激活TGF-β/Smad途徑抑制膠原蛋白的降解來促進光老化皮膚的修復(fù)[11]。2016年，日本京都大學(xué)和大阪市立大學(xué)共同研發(fā)了一種具有修復(fù)皮膚光損傷的物質(zhì)：Nahlsgen，其有效成分是一種氨基酸衍生物即甲基羧氨基羧基丙基膦酸酯，是一種γ谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶抑制劑，具有促進人表皮角質(zhì)形成細胞增殖和遷移，抑制紫外線誘導(dǎo)過氧化物的生成，減輕紫外線對皮膚成纖維細胞損傷的作用[12-13]。針對2種功能活性物質(zhì)，本研究基于UB光損傷人皮膚成纖維細胞(human skin fibroblast，HSF)模型，主要評價膠原肽和Nahlsgen協(xié)同對光損傷皮膚細胞的保護能力及對膠原蛋白生成能力的影響，為膠原肽的進一步開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

Nahlsgen，TOABO公司；H-DMEM培養(yǎng)基，Hyclone公司；胎牛血清、青霉素鏈霉素溶液(雙抗)，四季青公司；胰蛋白酶、磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)，碧云天生物技術(shù)研究所；HSF，上海冠導(dǎo)生物工程公司；噻唑藍(methyl thiazolyl tetrazolium，MTT)、二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)、2′,7′二氫二氯熒光素二乙酸酯(2′, 7′-dichlorofluorescin diacetate，DCFH-DA)，美國Sigma公司；羥脯氨酸試劑盒，南京建成生物技術(shù)有限公司；鱈魚魚皮，浙江東海岸實業(yè)有限公司；Collagen Type I and Elastin Rabbit Polyclonal antibody，Proteintech。

1.2 儀器與設(shè)備

恒溫培養(yǎng)箱、BD C6流式細胞儀、PikoReal 96實時定量PCR儀，美國Thermo Fisher公司；酶標(biāo)儀，美國Dynex公司；恒溫水浴鍋，蘇州珀西瓦爾實驗設(shè)備有限公司；ESCO AC2-6S1生物安全柜，新加坡藝思高科技有限公司；SH2B UB輻照儀，上海希格瑪高技術(shù)有限公司；T100梯度PCR儀，Bio-Rad公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 膠原肽的制備及分子質(zhì)量分布測定

膠原肽制備流程：

鱈魚魚皮清洗勻漿→預(yù)熱調(diào)pH→復(fù)合酶酶解→95 ℃滅酶→濃縮→脫色→噴霧干燥

采用高效凝膠過濾色譜法測定上述膠原肽分子質(zhì)量分布情況[14]。

1.3.2 UB誘導(dǎo)HSF損傷模型的建立

將生長狀態(tài)良好的HSF密度調(diào)整為105個/mL，以100 μL/孔加入到96孔板中，于37 ℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，待細胞單層貼壁后，棄去培養(yǎng)液，PBS清洗后，每孔加入50 μL PBS，空白組用錫箔紙包裹住，選取不同輻照劑量UB照射[15]，照射完畢后扣掉PBS 溶液，DMEM不完全培養(yǎng)基繼續(xù)孵育24 h，每組每孔加入100 μL MTT(0.5 mg/mL)，4 h后加入100 μL DMSO于37 ℃搖床上振蕩10 min,使結(jié)晶溶解，于490 nm處檢查細胞的活性，用細胞存活率表示，以選取合適的UB輻照劑量，細胞存活率計算如公式(1)所示：

(1)

1.3.3 Nahlsgen和膠原肽對HSF的保護作用

選取合適的UB輻照劑量照射完成后加入含有Nahlsgen和膠原肽樣品的DMEM不完全培養(yǎng)基孵育24 h，MTT法測其細胞存活率。

1.3.4 Nahlsgen和膠原肽對HSF氧化應(yīng)激的影響

HSF以1.0×105個/mL密度接種6孔細胞培養(yǎng)板，每孔2 mL，放置37 ℃、5% CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。隨后小心吸走6孔中的細胞上清液，經(jīng)PBS清洗后，加入含有Nahlsgen或膠原肽樣品的不完全培養(yǎng)基，孵育4 h。孵育完成后，倒出含有樣品的培養(yǎng)液，PBS清洗，每孔加入0.5 mL PBS緩沖液覆蓋底面，UB輻照完成后棄掉PBS，每孔加入終濃度為10 μmol/L的熒光染料DCFH-DA 1 mL，于37 ℃、5% CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)30 min，然后取出吸走上清液，用PBS小心清洗3次。消化，完全培養(yǎng)基終止，置于流式細胞儀測定其相對熒光值[16]。HSF內(nèi)抗氧化能力以活性氧(reactie oxygen species，ROS)含量來表示，ROS含量計算如公式(2)所示：

(2)

1.3.5 Nahlsgen和膠原肽對HSF羥脯氨酸含量的影響

將生長狀態(tài)良好的HSF密度調(diào)整為105個/mL，從1 mL/孔加入到12孔板中，于37 ℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，待細胞單層貼壁后，棄去培養(yǎng)液，PBS清洗后，換上含Nahlsgen或膠原肽的DMEM不完全培養(yǎng)基1 mL，繼續(xù)孵育24 h，吸取細胞培養(yǎng)液，消化法測定羥脯氨酸的含量[17]。

1.3.6 Nahlsgen和膠原肽對I型前膠原蛋白和原彈性蛋白mRNA表達情況的影響

將生長狀態(tài)良好的HSF密度調(diào)整為105個/mL，以3 mL/孔加入到6孔板中，于37 ℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，待細胞單層貼壁后，棄去培養(yǎng)液，PBS清洗后，換上含Nahlsgen或膠原肽的DMEM不完全培養(yǎng)基1 mL，繼續(xù)孵育24 h。Trizonal法提取細胞中的總RNA，紫外分光光度計測定A260/A280比值及RNA濃度，實時熒光定量PCR(quantitatie real-time PCR，qRT-PCR)檢測mRNA 水平的表達。

表1 COLⅠA1和ELN引物序列Table 1 Sequences of primers for target genes of amplified fragment

1.3.7 Nahlsgen和膠原肽對I型膠原蛋白和彈性蛋白的蛋白表達情況的影響

培養(yǎng)及上樣方法同1.3.6，用細胞刮刀刮下細胞，離心收集HSF，使用放射免疫沉淀分析(radio immunoprecipitation assay,RIPA)裂解液提取各組蛋白，提取完成后BCA法測定蛋白濃度，用于后續(xù)實驗。

根據(jù)目的蛋白不同分子質(zhì)量，配制10%/6%分離膠，5%濃縮膠，各樣品取總蛋白上樣電泳，濃縮膠電壓80 、時間30 min，分離膠電壓120 、時間60 min。電泳結(jié)束后，100 mA、時間90～180 min濕法轉(zhuǎn)膜，PDF膜在使用之前用甲醇活化30 s。濕法轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，用50 g/L脫脂奶粉封閉，然后TBS with Tween-20(TBST)于室溫?fù)u床上洗膜3次，每次10 min，一抗4 ℃孵育過夜，繼續(xù)用TBST洗膜3次，每次10 min，二抗孵育2 h，TBST洗膜，利用增強化學(xué)發(fā)光法(enhanced chemiluminescence,ECL)超敏顯色液顯色，凝膠成像儀拍照，采用機器自帶軟件進行灰度分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 膠原肽分子質(zhì)量分布

由表2可知，本實驗制備的膠原肽屬于小分子肽段混合物，分子質(zhì)量主要分布在1 000 Da以下，占93.59%，其中分子質(zhì)量在140～500 Da占比最多，這部分主要是二肽、三肽，具有易吸收、低致敏、低滲透壓等特點。

表2 膠原肽分子質(zhì)量分布情況Table 2 Molecular weight distributions of collagen protein hydrolysate

2.2 UB誘導(dǎo)HSF損傷模型

本研究通過不同劑量UB照射HSF來建立皮膚光損傷模型。UB照射劑量對HSF存活率的影響見圖1。UB照射劑量在60、70、80、100 mJ/cm2時，與空白組相比，HSF存活率沒有顯著變化，既不促進也不抑制細胞生長；當(dāng)照射劑量為120 mJ/cm2時，抑制HSF的生長(P<0.05)，照射劑量為160 mJ/cm2時極顯著抑制細胞的生長(P<0.01)，此時細胞生存率為85.87%。故選用160 mJ/cm2劑量誘導(dǎo)HSF損傷，進行后續(xù)評價實驗。

圖1 UB照射劑量對HSF存活率的影響Fig.1 Effects of UB irradiation dose on the iability of HSF 注：*表示與對照相比差異顯著(P<0.05)， **表示差異極顯著(P<0.01)(下同)

2.3 Nahlsgen和膠原肽對HSF的保護作用

由圖2可知，在UB照射下，HSF生存率極顯著降低，為85.87%，加入Nahlsgen后，基本恢復(fù)到正常水平，101.09%。經(jīng)Nahlsgen和不同濃度膠原肽復(fù)配干預(yù)后發(fā)現(xiàn)，細胞生存率與膠原肽添加量呈負(fù)相關(guān)，膠原肽為50 μg/mL時細胞生存率最高(104.99%)。在UB照射后，僅添加膠原肽的情況下，細胞生存率隨著膠原肽濃度的增加逐漸提高，由此可看出2種物質(zhì)均能提高細胞的生存率。

圖2 Nahlsgen和膠原肽對HSF存活率的影響Fig.2 Effects of Nahlsgen and collagen protein hydrolysate on cell iability of UB-irradiated HSF

由圖3可知，在UB照射下，ROS含量極顯著升高，為142.92%，加入Nahlsgen后，與空白對照組相比，ROS含量極顯著降低，132.79%。

圖3 Nahlsgen和膠原肽對HSF中ROS含量的影響Fig.3 Effects of Nahlsgen and collagen protein hydrolysate on ROS leels of UB-irradiated HSF

Nahlsgen和膠原肽復(fù)配加入后，膠原肽質(zhì)量濃度為100 μg/mL時，ROS含量最低，為118.35%。UB照射后，在只添加膠原肽的情況下，ROS含量隨著膠原肽濃度的升高逐漸降低，但是變化不明顯，ROS含量最低為129.47%。由此可看出2種物質(zhì)均能降低ROS含量，Nahlsgen和100 μg/mL膠原肽復(fù)配時能力最強。

HSF是人體皮膚真皮中的主體細胞成分，它與自身分泌的膠原、彈性纖維及基質(zhì)成分一同構(gòu)成了真皮主體。HSF數(shù)量的減少是引起皺紋產(chǎn)生的重要原因，且HSF具有趨化性和黏附性，對維持皮膚的彈性和韌性具有重要作用，所以HSF在皮膚老化過程中扮演著重要角色[18]。HSF體外增殖能力的評價是研究光老化的重要手段[19]。過量的ROS會引起機體組織細胞氧化應(yīng)激反應(yīng)，造成生物大分子物質(zhì)損傷，甚至引起疾病，而機體為保持活性氧自由基平衡，就必須通過抗氧化防御體系及時清除過量的ROS自由基[20]，清除ROS在緩解皮膚光老化過程中起著重要作用[21]。實驗結(jié)果表明，Nahlsgen和膠原肽可以提高HSF的增殖率和降低ROS水平，可以起到抗光老化的作用。

2.4 Nahlsgen和膠原肽對HSF羥脯氨酸含量的影響

由圖4可知，單獨添加膠原肽、Nahlsgen和膠原肽復(fù)配加入后，隨著膠原肽含量的增加，羥脯氨酸的含量隨之增加；相同濃度的膠原肽，加入Nahlsgen后，羥脯氨酸含量比單獨添加膠原肽高，由此可看出，Nahlsgen和膠原肽對羥脯氨酸含量的升高起到協(xié)同作用。

圖4 Nahlsgen和膠原肽對HSF羥脯氨酸含量的影響Fig.4 Effects of Nahlsgen and collagen protein hydrolysate on hydroxyproline content of HSF

羥脯氨酸是膠原蛋白中主要的氨基酸，其含量相對穩(wěn)定，約占膠原蛋白12%～14%。因此，可通過測定組織中羥脯氨酸含量變化來檢測膠原蛋白的合成能力。實驗結(jié)果表明，Nahlsgen和膠原肽復(fù)配可以提高羥脯氨酸的含量。

2.5 Nahlsgen和膠原肽對I型前膠原蛋白和原彈性蛋白mRNA和蛋白水平的影響

由圖5可知，單獨添加Nahlsgen、Nahlsgen和100 μg/mL膠原肽復(fù)配加入后，I型前膠原蛋白、原彈性蛋白的mRNA水平極顯著提高，由圖6可知，Nahlsgen和200 μg/mL膠原肽復(fù)配加入后對原彈性蛋白的mRNA水平極顯著提高，是對照組的4.77倍，Nahlsgen和膠原肽復(fù)配對于原彈性蛋白的RNA水平提高程度顯著優(yōu)于單獨添加Nahlsgen。

圖5 Nahlsgen和膠原肽對HSF I型前膠原蛋白 mRNA表達的影響Fig.5 Effects of Nahlsgen and collagen protein hydrolysate on the mRNA expression of COLⅠA1 in HSF

圖6 Nahlsgen和膠原肽對HSF原彈性蛋白 mRNA表達的影響Fig.6 Effects of Nahlsgen and collagen protein hydrolysate on the mRNA expression of ELN in HSF

HSF分泌的膠原主要以Ⅰ和Ⅲ型為主。其中正常成人皮膚以Ⅰ型膠原為主，胎兒皮膚主要由Ⅲ型膠原組成。膠原蛋白是皮膚中主要的蛋白質(zhì)，不僅含量高，而且還與肌膚的健康程度、保水性和彈性有著密切的關(guān)系。隨著年齡的增長，成纖維細胞合成膠原蛋白和彈性蛋白的能力越來越低，皮膚無法維持正常的形態(tài)和結(jié)構(gòu)，出現(xiàn)粗糙、松弛、塌陷、皺紋等問題[22]。結(jié)果表明，Nahlsgen和膠原肽復(fù)配可以提高膠原蛋白和彈性蛋白的基因水平。由圖7可知，單獨添加Nahlsgen、Nahlsgen和中高濃度膠原肽復(fù)配后、單獨添加膠原肽組可以促進HSF I型膠原蛋白的表達、Nahlsgen和膠原肽復(fù)配可以提高彈性蛋白的蛋白水平表達，結(jié)合基因表達水平結(jié)果，認(rèn)為Nahlsgen和膠原肽復(fù)配可以很好促進I型膠原蛋白和彈性蛋白的表達，起到一定的護膚作用。

a-I型前膠原蛋白和原彈性蛋白的蛋白質(zhì)印跡表達；b-Nahlsgen和膠原肽對HSF I型前膠原蛋白表達的影響； c-Nahlsgen和膠原肽對HSF原彈性蛋白表達的影響圖7 Nahlsgen和膠原肽對HSF I型膠原蛋白和彈性蛋白的蛋白水平影響Fig.7 Effects of Nahlsgen and collagen protein hydrolysate on the proteinexpression of COL I and ELN in HSF

3 結(jié)論

隨著年齡增長，皮膚逐漸發(fā)生退行性改變以及生理機能逐漸衰退的老化現(xiàn)象，主要分為內(nèi)源性衰老和外源性老化，前者是自然衰老，后者主要由紫外線輻射導(dǎo)致皮膚老化，也稱皮膚光老化。UB可作用于真皮淺層中的成纖維細胞，產(chǎn)生氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)等，引起皮膚粗糙、皺紋現(xiàn)象發(fā)生。為研究UB照射對皮膚氧化應(yīng)激和膠原蛋白的影響，本文以不同劑量UB處理不同時間后的HSF細胞為研究對象，揭示經(jīng)Nahlsgen和膠原肽分別及復(fù)配干預(yù)后，ROS水平、Ⅰ型膠原蛋白和彈性蛋白mRNA表達和蛋白水平的變化情況，探討Nahlsgen和膠原肽最佳配伍方式。

本研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)UB損傷后，HSF內(nèi)產(chǎn)生大的ROS，并造成膠原蛋白的流逝，導(dǎo)致不可逆轉(zhuǎn)的損傷，造成皮膚老化。利用Nahlsgen和膠原肽復(fù)配后可以提高成纖維細胞活性和降低氧化應(yīng)激損傷，有效保護HSF抵抗UB帶來的損傷。從羥脯氨酸含量、Ⅰ型前膠原蛋白和原彈性蛋白的mRNA表達水平、Ⅰ型膠原蛋白和彈性蛋白的蛋白表達結(jié)果可知，復(fù)配Nahlsgen和膠原肽可以促進Ⅰ型膠原蛋白和彈性蛋白的表達和合成，及時補充促進膠原蛋白合成，從而延緩皮膚細胞的衰老，增強皮膚的彈力，且復(fù)配的效果明顯優(yōu)于單獨使用的效果，顯著發(fā)揮抗皮膚光老化的作用。同時，本研究為開發(fā)安全有效的光保護劑奠定理論基礎(chǔ)。