汲晨洋，胡曉，吉宏武，陳勝軍，李來(lái)好，戚勃，鄧建朝，潘創(chuàng)，楊賢慶

1(廣東海洋大學(xué) 食品科技學(xué)院，廣東 湛江，524088)2(中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所， 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部水產(chǎn)品加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/國(guó)家水產(chǎn)品加工技術(shù)研發(fā)中心，廣東 廣州，510300) 3(海洋食品精深加工關(guān)鍵技術(shù)省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心(大連工業(yè)大學(xué))，遼寧 大連，116034)

白鰱魚(yú)肉質(zhì)鮮嫩、營(yíng)養(yǎng)豐富、產(chǎn)量高，是我國(guó)最受歡迎的淡水魚(yú)種之一[1]。據(jù)中國(guó)漁業(yè)年鑒統(tǒng)計(jì)，2020年我國(guó)白鰱魚(yú)總產(chǎn)量高達(dá)38.12萬(wàn)t，且產(chǎn)量呈逐年遞增趨勢(shì)，在漁業(yè)中占有重要生態(tài)地位。目前，市場(chǎng)上白鰱魚(yú)的主要加工方式為魚(yú)糜及其制品[2]。魚(yú)糜凝膠是由冷凍或新鮮魚(yú)肉經(jīng)低溫固化和高溫加熱制成的黏彈性凝膠食品。然而，鰱魚(yú)魚(yú)糜存在凝膠形成能力差和冷凍儲(chǔ)存期間蛋白質(zhì)易氧化的問(wèn)題，極大限制了白鰱魚(yú)糜制品的開(kāi)發(fā)。因此，尋找改善魚(yú)糜制品凝膠特性的方法成為相關(guān)學(xué)者的研究重點(diǎn)。

多糖由于其良好的膠凝特性、強(qiáng)吸水性和生物活性，成為改善魚(yú)糜品質(zhì)的主要添加劑[3]。多糖改善魚(yú)糜凝膠特性的機(jī)制為：(1)在熱誘導(dǎo)凝膠化過(guò)程中，多糖與蛋白質(zhì)分子相互作用促進(jìn)交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)的形成；(2)多糖具有較強(qiáng)水結(jié)合能力，可以填充三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)并截留水分；(3)多糖可以通過(guò)改變蛋白質(zhì)體系的黏度，在凝膠基質(zhì)中發(fā)揮膠凝或增稠作用[4]。XIONG等[5]發(fā)現(xiàn)，添加魔芋葡聚糖后的草魚(yú)魚(yú)糜凝膠破斷強(qiáng)度和凝膠強(qiáng)度顯著增加。WU[6]研究表明，添加普魯蘭多糖后的魚(yú)糜凝膠性能改善，持水性提高，證明多糖是改善魚(yú)糜制品品質(zhì)的有效添加劑。如今，相關(guān)學(xué)者更加注重開(kāi)發(fā)具有多功能性添加劑的新型魚(yú)糜制品，在改善魚(yú)糜制品凝膠性能的同時(shí)，還能賦予食物有益的健康特性。

條斑紫菜是中國(guó)南方沿海地區(qū)的重要經(jīng)濟(jì)海藻，具有高蛋白、低脂肪的特點(diǎn)，是水溶性多糖的重要來(lái)源。紫菜多糖是一種線性硫酸化雜多糖，主要由交替的“β-(1→3)-D-半乳糖”與“α-(1→4)-3,6-內(nèi)醚-L-半乳糖”單元以及硫酸化的線性骨架組成[7]?；谄洫?dú)特的結(jié)構(gòu)，紫菜多糖可在適當(dāng)?shù)奶砑臃秶鷥?nèi)表現(xiàn)出良好的凝膠增強(qiáng)和吸水作用，在食品工業(yè)中被用作膠凝劑、穩(wěn)定劑、增稠劑和乳化劑[8]。此外，紫菜多糖還富含抗氧化活性、免疫調(diào)節(jié)作用和抗炎等生物活性[9-10]。根據(jù)多糖良好的水結(jié)合能力、膠凝特性和抗氧化活性，紫菜多糖可能有提高魚(yú)糜凝膠性能和品質(zhì)的潛力。然而，目前還沒(méi)有紫菜多糖在鰱魚(yú)魚(yú)糜加工中的應(yīng)用。因此，本研究旨在闡明紫菜多糖對(duì)魚(yú)糜凝膠特性、微觀結(jié)構(gòu)和抗氧化活性的影響，并探索多糖-魚(yú)糜復(fù)合凝膠的水分狀態(tài)和蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)變化，旨在為開(kāi)發(fā)新型魚(yú)糜制品提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮白鰱魚(yú)購(gòu)于廣州市融漁海鮮超市，質(zhì)量為(1.7±0.31)kg/條；條斑紫菜，江蘇南通昌鈺海苔有限公司；木薯淀粉、食鹽、食用油，市售；三聚磷酸鈉、焦磷酸鈉、六偏磷酸鈉、CaCl2、戊二醛、無(wú)水乙醇，均為分析純，廣州化學(xué)試劑廠。

1.2 儀器與設(shè)備

SHA·BA水浴恒溫振蕩器，常州金壇精達(dá)儀器制造有限公司；UMC5真空斬拌機(jī)，德國(guó)Stephan Machinery公司；T50型均質(zhì)機(jī)，德國(guó)IKA公司；CT3質(zhì)構(gòu)儀，美國(guó)Brookfield公司；AantiJ26XP型臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)，美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特公司；CR-400型全自動(dòng)色差計(jì)，日本柯尼卡美能達(dá)控股公司；Alpha1-4冷凍干燥機(jī)，德國(guó)Christ公司；SU8020場(chǎng)發(fā)射掃描子顯微鏡，日本日立公司；Bruker AANCE Ⅲ 600M核磁共振儀，德國(guó)布魯克公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 條斑紫菜多糖的制備

參考JI等[11]的方法并稍作修改，按料液比1∶20(g∶mL)加入紫菜粉末和無(wú)水乙醇，450 W超聲波處理30 min，90 ℃熱水?dāng)嚢杞? h，抽濾烘干。隨后按料液比1∶75(g∶mL)加入去離子水，90 ℃攪拌浸提4 h，8 000 r/min離心15 min，旋蒸濃縮，倒入4倍體積95%無(wú)水乙醇，置于4 ℃冰箱靜置過(guò)夜。收集沉淀，加入去離子水復(fù)溶，調(diào)節(jié)pH 6.5后添加1 g/L木瓜蛋白酶，50 ℃恒溫水浴2.5 h，沸水滅活并離心。上清液加入Seage試劑(上清液∶氯仿∶正丁醇=25∶5∶1，體積比)，將所得多糖溶液透析72 h，旋蒸濃縮并冷凍干燥，以獲得紫菜多糖。紫菜多糖的得率、總糖含量、硫酸基含量和蛋白質(zhì)含量分別為(15.05±0.35)%、(66.12±0.28)%、(12.27±0.06)%和(0.33±0.16)%，分子質(zhì)量為7.07×105Da。

1.3.2 魚(yú)糜凝膠的制備

參考ZHENG等[12]的方法并稍作修改，將新鮮白鰱魚(yú)斬首，去鱗，去內(nèi)臟后用清水洗滌，收集背部白色肌肉，使用5倍體積冷水沖洗2次魚(yú)肉，再用0.5%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))NaCl溶液沖洗。紗布過(guò)濾，以1 500 r/min離心5 min，獲得魚(yú)糜。稱取6組質(zhì)量為300 g的魚(yú)糜，放入真空斬拌機(jī)低溫空斬2 min，各組加入2%食鹽(以魚(yú)糜質(zhì)量計(jì)算，下同)，10%食用油，10%木薯淀粉，0.3%復(fù)合磷酸鹽(三聚磷酸鈉∶焦磷酸鈉∶六偏磷酸鈉=2∶2∶1)斬拌3 min。隨后添加15%冰水及含有0.6% CaCl2的不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的紫菜多糖(0%、0.2%、0.4%、0.6%、0.8%和1.0%)，混合樣品于3 000 r/min直升攪拌機(jī)內(nèi)斬拌10 min(整個(gè)過(guò)程溫度控制低于10 ℃)。將斬拌后的樣品灌入塑料腸衣內(nèi)(Φ25 mm)，兩端扎緊密封。然后采用兩段式加熱(45 ℃加熱15 min，90 ℃加熱30 min)，最后將煮過(guò)的多糖-魚(yú)糜復(fù)合凝膠置于冰水冷卻30 min。去除腸衣于4 ℃冰箱冷藏過(guò)夜，待測(cè)各項(xiàng)指標(biāo)。

1.3.3 凝膠強(qiáng)度的測(cè)定

將魚(yú)糜凝膠樣品切成2.5 cm圓柱體，在室溫條件下平衡30 min后，采用CT3質(zhì)構(gòu)儀測(cè)定樣品凝膠強(qiáng)度。探頭型號(hào)：TA/44球形探頭，測(cè)試模式：壓縮模式，測(cè)試速度1.0 mm/s，下壓距離15.0 mm，觸發(fā)力5.0 g。力-形變曲線上獲得的第1個(gè)峰值定義為破斷強(qiáng)度，相應(yīng)的到達(dá)第1個(gè)峰值的距離定義為破斷距離，每組3個(gè)平行。凝膠強(qiáng)度按公式(1)計(jì)算：

凝膠強(qiáng)度/(g·mm)=破斷強(qiáng)度(g)×破斷距離(mm)

(1)

1.3.4 質(zhì)地剖面分析參數(shù)的測(cè)定

采用1.3.3相同處理方式測(cè)定樣品質(zhì)構(gòu)特性。探頭型號(hào)：TA/44球形探頭，測(cè)試模式：質(zhì)地多面剖析(texture profile analysis，TPA)，測(cè)試速度1.0 mm/s，壓縮比50%，觸發(fā)力5.0 g。選取硬度、彈性、內(nèi)聚性、咀嚼性和回復(fù)性為TPA參數(shù)，每組3個(gè)平行。

1.3.5 白度測(cè)定

將魚(yú)糜凝膠切成3 mm厚的薄片，采用色差儀測(cè)定凝膠的白度，測(cè)量前使用標(biāo)準(zhǔn)白板對(duì)色差儀進(jìn)行校準(zhǔn)，然后記錄L*(亮度)，a*(紅色/綠色)和b*(黃色/藍(lán)色)值。白度按公式(2)計(jì)算：

(2)

1.3.6 凝膠持水性測(cè)定

稱取約3.0 g魚(yú)糜凝膠記質(zhì)量為m1，用3層濾紙裹住樣品后裝入50 mL離心管內(nèi)。4 ℃、5 000 r/min離心15 min，離心結(jié)束后移除濾紙并再次稱質(zhì)量記為m2。持水性按公式(3)計(jì)算：

(3)

1.3.7 凝膠水分分布及存在狀態(tài)分析

參考宋春勇等[13]的方法并稍作修改，魚(yú)糜凝膠在室溫下靜置30 min后切成15 mm×15 mm×20 mm的長(zhǎng)方體(約2.0 g)，裝入核磁管中，插入探針。采用Carr-Purcell-Meiboom-Gill(CPMG)脈沖序列，在32 ℃條件下測(cè)定魚(yú)糜凝膠的橫向弛豫時(shí)間T2。測(cè)量參數(shù)：SFI=22 MHz，TR=6 s，NS=8，τ=400 μs，EchoCount=1 500。使用MultiExp In Analysis軟件對(duì)CPMG衰減曲線進(jìn)行分布指數(shù)擬合。根據(jù)峰位置確定橫向弛豫時(shí)間常數(shù)，并通過(guò)累計(jì)積分確定圖譜中各峰面積，所得峰面積表示為樣品中水的百分含量。

1.3.8 微觀結(jié)構(gòu)測(cè)定

參考熊雅雯等[14]的方法并略作修改，將6組魚(yú)糜凝膠切成約1 mm3小塊，去離子水沖洗10 min，放入2.0%戊二醛溶液中4 ℃固定24 h，再用0.1 mol/L，pH 7.2的磷酸緩沖液漂洗3次，15 min/次。隨后依次在30%、50%、70%、90%及無(wú)水乙醇中進(jìn)行10 min梯度洗脫。最后，將魚(yú)糜凝膠真空冷凍干燥和噴金，在電壓0.5～30 k下分別放大200倍和500倍觀察樣品微觀結(jié)構(gòu)。

1.3.9 傅立葉紅外變換光譜測(cè)定

將各組樣品冷凍干燥并研磨成粉末，并分別與KBr按1∶100比例均勻混合，真空壓縮成片。利用傅立葉紅外光譜儀在4 000-400 cm-1分辨率下掃描樣品，共掃描32次。

1.3.10 抗氧化活性測(cè)定

將魚(yú)糜凝膠和去離子水按體積比1∶20混合，4 ℃、3 000 r/min均質(zhì)5 min?；旌弦阂? 000 r/min離心10 min去除沉淀，并通過(guò)0.22 μm濾膜。真空冷凍干燥后，將200 mg樣品重新溶解在10 mL去離子水中，并進(jìn)行抗氧化活性試驗(yàn)。

1.3.10.1 DPPH自由基清除活性

參考WU等[10]的方法并稍作修改，取2 mL樣品溶液與2 mL(0.2 mmol/L)DPPH溶液混勻，室溫下混合物在黑暗中反應(yīng)30 min。隨后，在波長(zhǎng)517 nm處測(cè)量其吸光值，以2 mL無(wú)水乙醇溶液作為空白。DPPH自由基清除活性按公式(4)計(jì)算：

(4)

式中：A0，空白組吸光值;A1，樣品溶液吸光值。

1.3.10.2 ·OH清除活性

參考JI等[11]的方法并稍作修改，將1 mL樣品溶液、1 mL 6 mmol/L FeSO4和1 mL 6 mmol/L H2O2依次加入離心管中，充分混勻靜置10 min。隨后，加入1 mL 6 mmol/L水楊酸，室溫下靜置反應(yīng)30 min，測(cè)定510 nm處吸光值?！H清除活性按公式(5)計(jì)算：

(5)

式中：A0，空白組吸光值(用去離子水代替樣品溶液)；A1，樣品溶液吸光值；A2，本底組吸光值(用去離子水代替水楊酸溶液)。

1.3.10.3 ABTS陽(yáng)離子自由基清除活性

參考TANG等[15]的方法并稍作修改，將7 mmol/L ABTS溶液與2.4 mmol/L K2S2O8溶液等比例混勻，室溫下黑暗反應(yīng)12～16 h，形成ABTS儲(chǔ)備液。然后用50%(體積分?jǐn)?shù)，下同)甲醇溶液稀釋混合物，直至734 nm處吸光值為0.70±0.02，形成ABTS工作液。取0.1 mL樣品溶液與3.9 mL ABTS工作液充分混勻，室溫下黑暗中反應(yīng)30 min，測(cè)定734 nm處吸光值。ABTS陽(yáng)離子自由基清除活性按公式(6)計(jì)算：

(6)

式中：A0，空白組吸光值(用去離子水代替樣品溶液)；A1，樣品溶液吸光值；A2，50%甲醇溶液吸光值(用50%甲醇代替樣品溶液)

1.3.11 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)樣本通過(guò)Excel軟件進(jìn)行整理，采用OriginPro 2019b軟件作圖、SPSS Statistics 26.0軟件數(shù)據(jù)處理，使用Duncan方法進(jìn)行多重比較分析，P<0.05為統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 紫菜多糖對(duì)魚(yú)糜凝膠強(qiáng)度的影響

凝膠強(qiáng)度表示破斷強(qiáng)度與破斷距離的乘積，可反映凝膠內(nèi)部蛋白質(zhì)聚集能力[16]。如圖1所示，紫菜多糖添加量≤0.4%時(shí)，破斷強(qiáng)度和破斷距離隨多糖添加量的增加而增加(P<0.05)，多糖添加量>0.4%時(shí)反而減少。因此，添加0.4%多糖的魚(yú)糜表現(xiàn)為最佳破斷強(qiáng)度(427.50 g)和破斷距離(8.39 mm)，相較于對(duì)照組分別提高54.51%和22.37%。通常，破斷強(qiáng)度與凝膠強(qiáng)度和抗凝膠破斷性有關(guān)，破斷距離與凝膠彈性呈正相關(guān)[17]。此外，圖1還顯示出加入多糖的魚(yú)糜凝膠破斷強(qiáng)度和破斷距離均高于對(duì)照組，表明復(fù)合凝膠組具有較強(qiáng)的破斷強(qiáng)度和破斷距離。這是由于紫菜多糖具有較強(qiáng)吸水性，可與魚(yú)糜競(jìng)爭(zhēng)水分，致使魚(yú)糜蛋白濃度增加，提高凝膠強(qiáng)度。同時(shí)，作為填料的多糖均勻分散在整個(gè)凝膠體系中時(shí)，可促進(jìn)蛋白質(zhì)與多糖之間的相互作用，有利于增強(qiáng)凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)[8]。然而，添加過(guò)量的多糖(>0.4%)破斷強(qiáng)度和破斷距離均降低，其原因?yàn)檫^(guò)量的多糖分散在魚(yú)糜凝膠網(wǎng)絡(luò)中，會(huì)破壞連續(xù)網(wǎng)絡(luò)中氫鍵的形成，阻礙多糖與蛋白分子之間的交聯(lián)，導(dǎo)致凝膠強(qiáng)度降低。這與YU等[18]研究的κ-卡拉膠改善魚(yú)糜制品凝膠強(qiáng)度變化得到的結(jié)果相似。

圖1 紫菜多糖添加量對(duì)白鰱魚(yú)魚(yú)糜凝膠強(qiáng)度的影響Fig.1 Effect of Porphyra polysaccharide content on strength of siler carp surimi gel 注：不同字母表示差異顯著(P<0.05)(下同)

2.2 紫菜多糖對(duì)魚(yú)糜凝膠質(zhì)構(gòu)特性的影響

質(zhì)地是影響食物口感和功能特性的重要品質(zhì)參數(shù)。相較于液體食物而言，固體食物在口腔內(nèi)變化更為強(qiáng)烈。硬度定義為食物第一壓縮循環(huán)期間的峰值力；彈性表示魚(yú)糜在第一次壓縮過(guò)程中變形后物理回彈的程度；內(nèi)聚性表示相對(duì)于第一個(gè)變形的承受能力；回復(fù)性定義為第一下壓時(shí)，形變目標(biāo)之前面積與形變目標(biāo)之后的面積比值[19]。由表1可知，添加紫菜多糖對(duì)魚(yú)糜凝膠質(zhì)構(gòu)特性影響顯著。隨多糖添加量的增加，硬度和咀嚼性達(dá)到最大值510.83 g和29.28 mJ，分別是對(duì)照組的1.96和2.31倍(P<0.05)。這與WU[6]研究的多糖類物質(zhì)能提升魚(yú)糜制品質(zhì)構(gòu)特征結(jié)果一致。然而，彈性、內(nèi)聚性和回復(fù)性隨多糖添加量的增加呈現(xiàn)先增加后減小的趨勢(shì)，與凝膠強(qiáng)度結(jié)果一致。紫菜多糖添加量為0.4%時(shí)，彈性、內(nèi)聚性和回復(fù)性均達(dá)到最大值，表明在魚(yú)糜凝膠的空腔和連續(xù)相中填充適量的多糖可促進(jìn)凝膠網(wǎng)絡(luò)中蛋白質(zhì)和水分子之間的交聯(lián)，形成均勻致密的三維凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，從而改善魚(yú)糜制品的質(zhì)構(gòu)特征[17]。

表1 紫菜多糖添加量對(duì)白鰱魚(yú)魚(yú)糜凝膠質(zhì)構(gòu)的影響Table 1 Effect of Porphyra polysaccharide content on the texture of siler carp surimi gel.

2.3 紫菜多糖對(duì)魚(yú)糜凝膠白度的影響

白度直接影響魚(yú)糜制品的整體可接受性，是評(píng)估魚(yú)糜制品品質(zhì)的重要指標(biāo)。通常，理想狀態(tài)的魚(yú)糜凝膠具有高L*，低b*和高白度特點(diǎn)[4]。由表2可知，添加紫菜多糖后的魚(yú)糜凝膠，L*值降低，而a*值和b*值上升(P<0.05)，表明魚(yú)糜凝膠亮度逐漸變暗且色澤向紅色和黃色方向發(fā)展。RAWDKUEN等[20]的研究表明，魚(yú)糜制品的白度主要取決于添加劑的顏色、類型和數(shù)量。由于紫菜多糖本身為淡黃色，導(dǎo)致均勻分散在魚(yú)糜凝膠中時(shí)整體白度下降，但與淀粉/魚(yú)糜和大豆分離蛋白/魚(yú)糜復(fù)合凝膠的白度相比，添加0.2%～1.0%多糖的魚(yú)糜凝膠整體白度仍能為消費(fèi)者所接受[16]。

表2 紫菜多糖添加量對(duì)鰱魚(yú)魚(yú)糜凝膠色度的影響Table 2 Effects of Porphyra polysaccharide on chroma of siler carp surimi gel

2.4 持水性

在熱誘導(dǎo)魚(yú)糜凝膠化過(guò)程中，蛋白質(zhì)高級(jí)結(jié)構(gòu)受熱松動(dòng)，分子之間相互交聯(lián)形成三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，與水結(jié)合并截留其他成分，使魚(yú)糜凝膠具有一定的持水能力。持水性反映了凝膠網(wǎng)絡(luò)截留或結(jié)合水分的能力[21]。如圖2所示，隨著紫菜多糖的加入，持水性顯著提高(P<0.05)，整體呈先上升后下降趨勢(shì)。當(dāng)多糖添加量為0.4%時(shí)，凝膠持水性達(dá)到最大值94.74%，與對(duì)照組相比提高10.41%。這是由于多糖具有較強(qiáng)的吸水和保水能力，可增強(qiáng)蛋白質(zhì)凝膠網(wǎng)絡(luò)[7]。多糖吸水引起溶脹，向蛋白質(zhì)基質(zhì)施加壓力，使凝膠基質(zhì)變得更加致密和牢固。此外，多糖還可以作為填充材料填充蛋白質(zhì)基質(zhì)中的空腔，以誘導(dǎo)形成更加均勻致密的空間網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，從而容納更多的水分[21]。然而，多糖添加量>0.4%時(shí)，魚(yú)糜凝膠持水性下降，其原因?yàn)樘砑舆^(guò)量多糖會(huì)干擾蛋白質(zhì)與水分子之間的相互作用，破壞凝膠網(wǎng)絡(luò)的形成，導(dǎo)致魚(yú)糜持水能力降低。CHEN等[22]添加親水膠體(可得然膠、明膠、黃原膠和κ-卡拉膠)以提高魚(yú)糜制品的保水能力和凝膠質(zhì)量，結(jié)果顯示，在0～5 g/kg添加范圍內(nèi)，4種膠最佳添加量分別為4、1、0、2 g/kg，即添加少量的親水膠體有助于提高凝膠持水性，過(guò)量添加會(huì)降低持水性。因此，添加適量的多糖可促進(jìn)與蛋白質(zhì)之間的相互作用，形成均勻致密的凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，提高魚(yú)糜的持水能力，改善魚(yú)糜凝膠品質(zhì)。

圖2 紫菜多糖添加量對(duì)鰱魚(yú)魚(yú)糜凝膠持水性的影響Fig.2 Effect of Porphyra polysaccharide content on water holding capacity of siler carp surimi gel

2.5 低場(chǎng)核磁共振

利用低場(chǎng)核磁弛豫時(shí)間T2分析魚(yú)糜凝膠內(nèi)部水分流動(dòng)性、分布狀態(tài)及相互遷移情況[17]。弛豫時(shí)間T2可反映魚(yú)糜凝膠氫質(zhì)子受抑制程度，弛豫時(shí)間越短說(shuō)明氫質(zhì)子受抑制程度越強(qiáng)，即水分越穩(wěn)定。如圖3所示，魚(yú)糜凝膠通過(guò)衰減曲線反演后弛豫時(shí)間T2圖譜中存在3個(gè)峰，代表3種不同水分狀態(tài)，即T21：(0～10 ms)表示與蛋白質(zhì)等大分子疏水基團(tuán)緊密結(jié)合水，移動(dòng)性較弱，屬于結(jié)合水；T22：(10～150 ms)表示束縛在三維凝膠網(wǎng)絡(luò)中的水分，具有一定移動(dòng)性，屬于不易流動(dòng)水；T23：(150～1 000 ms)表示存在于三維凝膠網(wǎng)絡(luò)以外的水分，移動(dòng)性較強(qiáng)，屬于自由水[23]。對(duì)照組凝膠T21、T22、T23分別為0.54、52.61、579.41 ms，而加入多糖后的魚(yú)糜凝膠T21、T22、T23分別降至0.43、46.94、327.27 ms。隨著多糖添加量的增加，弛豫時(shí)間向短時(shí)間遷移，表明多糖具有更強(qiáng)的結(jié)合水和限制水分子自由運(yùn)動(dòng)的能力[21]。

圖3 紫菜多糖添加量對(duì)鰱魚(yú)魚(yú)糜凝膠弛豫時(shí)間T2的影響Fig.3 Effect of Porphyra polysaccharide on relaxation time T2 of siler carp surimi gel

使用P21、P22、P23表示不同狀態(tài)水分相應(yīng)的各峰面積比例，反映水分在魚(yú)糜中的分布與遷移。如圖4所示，不易流動(dòng)水是魚(yú)糜凝膠的主要水分，所占比例約為92%，直接關(guān)系到魚(yú)糜凝膠的持水能力。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)變化時(shí)，凝膠中水分會(huì)發(fā)生相互轉(zhuǎn)化[18]。不同狀態(tài)水分中自由水流動(dòng)性最強(qiáng)，在離心過(guò)程中易流失對(duì)魚(yú)糜凝膠的保水性產(chǎn)生不利影響。因此，當(dāng)自由水所占比較高時(shí)，凝膠持水性較低。在該實(shí)驗(yàn)中，對(duì)照組P23在所有凝膠中占比最高達(dá)到0.63%，表明其保水能力最弱。添加多糖后的凝膠，P23占比減少，P21占比增加，表明凝膠內(nèi)部水分逐漸趨于穩(wěn)定。這是由于多糖吸水膨脹與蛋白質(zhì)相互作用增強(qiáng)，部分自由水轉(zhuǎn)化為束縛水，使水的流動(dòng)性降低，三維凝膠網(wǎng)絡(luò)增強(qiáng)。其中添加0.4%多糖的魚(yú)糜凝膠，P21和P22二者所占總峰面積比例達(dá)到最大值99.64%，表明具有最大持水能力，該結(jié)果與持水性結(jié)果一致。

圖4 紫菜多糖添加量對(duì)鰱魚(yú)魚(yú)糜凝膠水分分布的影響Fig.4 Effect of Porphyra polysaccharide content on water distribution in siler carp surimi gel

2.6 微觀結(jié)構(gòu)分析

魚(yú)糜內(nèi)部三維凝膠網(wǎng)絡(luò)的形成與蛋白質(zhì)鏈的有序聚集密切相關(guān)。鏈密度越高，凝膠越均勻有序，所表現(xiàn)的凝膠強(qiáng)度越強(qiáng)[24]。如圖5所示，對(duì)照組樣品結(jié)構(gòu)松散，表面粗糙，呈團(tuán)簇狀，說(shuō)明蛋白質(zhì)分子之間交聯(lián)較少，蓄水能力低，導(dǎo)致魚(yú)糜凝膠強(qiáng)度和持水能力差。

a-0%(a1:×200、a2:×500)；b-0.2%(b1:×200、b2:×500)； c-0.4%(c1:×200、c2:×500)；d-0.6%(d1:×200、d2:×500)； e-0.8%(e1:×200、e2:×500)；f-1.0%(f1:×200、f2:×500)圖5 紫菜多糖添加量對(duì)白鰱魚(yú)魚(yú)糜凝膠微觀結(jié)構(gòu)的影響Fig.5 Effect of Porphyra polysaccharide content on the microstructure of siler carp surimi gel

與對(duì)照組相比，添加多糖的魚(yú)糜凝膠可以引入更多氫鍵和親水相互作用，凝膠基質(zhì)更致密，表面也更光滑平整且孔徑分布均勻，表明形成的凝膠連接性更好，蛋白質(zhì)鏈密度高，網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)也更均勻有序。在魚(yú)糜凝膠化過(guò)程中，蛋白質(zhì)變性，暴露出更多與多糖相互作用的隱藏位點(diǎn)，二者之間靜電相互作用增強(qiáng)，限制凝膠基質(zhì)中水分子的運(yùn)動(dòng)，從而形成均勻緊湊的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)[6]。然而，添加過(guò)量的紫菜多糖(>0.4%)，凝膠結(jié)構(gòu)逐漸松散，孔徑增大，這是由于過(guò)量的多糖會(huì)阻礙與蛋白質(zhì)之間的交聯(lián)，致使質(zhì)構(gòu)特性弱化。魚(yú)糜凝膠微觀結(jié)構(gòu)的變化與凝膠強(qiáng)度和持水性結(jié)果一致。

2.7 傅立葉紅外光譜分析

傅立葉紅外光譜廣泛用于食品的定性與定量分析，通過(guò)魚(yú)糜凝膠在紅外光譜中出現(xiàn)的若干特征吸收峰，反映蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化[19]。徐安琪等[8]研究表明，位于1 600～1 700 cm-1區(qū)域內(nèi)的特征吸收峰屬于酰胺I帶，該區(qū)域?qū)Φ鞍踪|(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)變化敏感。酰胺I帶局部空間構(gòu)象由分子內(nèi)氫鍵維系，主要形式為：α-螺旋(1 650～1 660 cm-1)，β-折疊(1 600～1 640 cm-1)，β-轉(zhuǎn)角(1 660～1 700 cm-1)和無(wú)規(guī)則卷曲(1 640～1 650 cm-1)[25]。根據(jù)酰胺I帶特征吸收峰面積，計(jì)算蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)含量。

由圖6可知，添加紫菜多糖的魚(yú)糜凝膠蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)含量發(fā)生變化。當(dāng)紫菜多糖添加量為0%～0.4%時(shí)，α-螺旋含量從11.91%降至6.87%(P<0.05)，而β-轉(zhuǎn)角含量從36.09%增至39.86%(P<0.05)，β-折疊與無(wú)規(guī)則卷曲無(wú)顯著性差異(P>0.05)。隨著多糖的進(jìn)一步添加，α-螺旋含量逐漸上升，β-轉(zhuǎn)角含量呈相反趨勢(shì)。這與CHEN等[22]研究的添加κ-卡拉膠后的凝膠蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)變化結(jié)果相似。通常，凝膠化過(guò)程中，α-螺旋含量下降表示肌球蛋白展開(kāi)程度增加，促進(jìn)凝膠網(wǎng)絡(luò)形成，β-結(jié)構(gòu)含量增加表示蛋白質(zhì)分子發(fā)生聚集形成凝膠，無(wú)規(guī)則卷曲含量下降表示蛋白質(zhì)三維凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)從無(wú)序向規(guī)則有序轉(zhuǎn)變，而均勻有序的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)有利于提高魚(yú)糜制品的凝膠強(qiáng)度。維系蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的主要作用力為氫鍵、疏水相互作用和靜電相互作用等非共價(jià)鍵力，其中α-螺旋結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性主要依賴多肽鏈上氨基和羰基之間的氫鍵作用[14]。熱處理導(dǎo)致蛋白質(zhì)分子變性，破壞了氨基與羰基之間的氫鍵作用，使得α-螺旋結(jié)構(gòu)發(fā)生解旋并轉(zhuǎn)變?yōu)棣?折疊和β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)，凝膠內(nèi)部水分隨蛋白質(zhì)分子的展開(kāi)發(fā)生遷移，暴露出更多疏水基團(tuán)，有利于良好的凝膠網(wǎng)絡(luò)形成[25]。然而繼續(xù)添加多糖，β-折疊和β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)開(kāi)始分解，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)逐漸松散，通過(guò)疏水相互作用，α-螺旋含量逐漸回升。因此，熱誘導(dǎo)凝膠化過(guò)程中蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)處于不斷變化中，其原因可能為熵的作用，導(dǎo)致α-螺旋、β-折疊、β-轉(zhuǎn)角和無(wú)規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)之間發(fā)生相互轉(zhuǎn)化[26]。這與上述魚(yú)糜凝膠凝膠強(qiáng)度、持水性、微觀結(jié)構(gòu)的測(cè)定結(jié)果一致。

圖6 紫菜多糖添加量對(duì)蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)含量的影響Fig.6 Effect of Porphyra polysaccharide addition on protein secondary structure content

2.8 抗氧化活性分析

在冷凍貯藏期間，魚(yú)糜制品品質(zhì)劣變主要與蛋白質(zhì)氧化有關(guān)。因此，抑制蛋白質(zhì)氧化可有效穩(wěn)定肌原纖維蛋白的結(jié)構(gòu)和功能，保持良好的肉制品品質(zhì)[27]。多糖的抗氧化機(jī)制主要是通過(guò)直接清除自由基或間接抑制氧化過(guò)程實(shí)現(xiàn)[11]。自由基清除模型由于操作便捷、結(jié)果可靠被廣泛用于評(píng)價(jià)多糖的抗氧化活性。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)測(cè)定魚(yú)糜凝膠的DPPH自由基、·OH和ABTS陽(yáng)離子自由基清除率，評(píng)估紫菜多糖對(duì)魚(yú)糜凝膠的氧化抑制能力。由圖7-a可知，添加多糖的DPPH自由基清除活性與對(duì)照組相比差異顯著(P<0.05)，且多糖添加量與DPPH自由基清除活性呈劑量依賴性關(guān)系。當(dāng)多糖添加量為1.0%時(shí)DPPH自由基清除能力為(69.56±1.54)%，相較于對(duì)照組提高了68.71%，表明紫菜多糖可以向DPPH自由基捐贈(zèng)電子或H+，有效抑制蛋白質(zhì)氧化[10]。圖7-b顯示，·OH清除率與多糖添加量呈正相關(guān)，各組魚(yú)糜凝膠·OH清除活性分別為：(54.88±0.33)%、(56.12±0.37)%、(60.00±0.19)%、(62.41±0.34)%、(65.25±0.32)%、(68.34±0.41)%。圖7-c顯示，隨多糖添加量從0%增加到1.0%，ABTS陽(yáng)離子自由基清除率呈先增加后穩(wěn)定趨勢(shì)。與添加至魚(yú)糜中的其他植物多糖相比，紫菜多糖顯示出更好的氧化抑制能力。ZHENG等[12]的研究表明，添加1.0%巖藻依聚糖的魚(yú)糜·OH和ABTS陽(yáng)離子自由基清除能力約為65%和73%，而在相同添加量下，紫菜多糖-魚(yú)糜凝膠清除率分別為68.34%和79.11%。綜上，添加紫菜多糖能夠有效抑制自由基氧化，且以劑量依賴性方式延緩蛋白質(zhì)的氧化。

a-DPPH自由基；b-·OH；c-ABTS陽(yáng)離子自由基圖7 紫菜多糖含量對(duì)白鰱魚(yú)魚(yú)糜凝膠抗氧化活性的影響Fig.7 Effect of Porphyra polysaccharide content on antioxidant actiity of siler carp surimi gel

3 結(jié)論

添加紫菜多糖對(duì)白鰱魚(yú)魚(yú)糜凝膠特性、水分狀態(tài)、微觀結(jié)構(gòu)、蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)及抗氧化活性有重要影響。當(dāng)多糖添加量為0.4%時(shí)，魚(yú)糜凝膠強(qiáng)度、質(zhì)構(gòu)特性和持水性表現(xiàn)最佳，并具有最均勻致密的三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，這主要?dú)w因于多糖具有強(qiáng)吸水性和填充作用。白度隨多糖添加量增加而下降，這與多糖自身顏色有關(guān)，但整體色澤在可接受范圍內(nèi)。此外，添加紫菜多糖使魚(yú)糜凝膠弛豫時(shí)間T2向短時(shí)間遷移，并使部分自由水轉(zhuǎn)化為束縛水，增強(qiáng)凝膠形成能力。但添加過(guò)量的多糖會(huì)削弱魚(yú)糜中蛋白質(zhì)交聯(lián)作用，破壞凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的完整性，導(dǎo)致凝膠質(zhì)量下降。熱誘導(dǎo)凝膠化過(guò)程中，α-螺旋含量先下降后上升，β-轉(zhuǎn)角呈相反趨勢(shì)。抗氧化實(shí)驗(yàn)表明，添加紫菜多糖后的魚(yú)糜凝膠顯示出優(yōu)異的氧化抑制能力。本研究為開(kāi)發(fā)新型多糖-魚(yú)糜制品提供理論依據(jù)。