關(guān)鵬，凍梓杰，賀舒佳，劉悅陽，雷萌萌,2,3，黃忠民,2,3，艾志錄,2,3,4，索標(biāo),2,3,4*

1(河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，河南 鄭州，450002)2(農(nóng)業(yè)農(nóng)村部 大宗糧食加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 河南 鄭州，450002)3(國家速凍米面制品加工技術(shù)研發(fā)專業(yè)中心，河南 鄭州，450002) 4(速凍面米及調(diào)制食品河南省工程實(shí)驗(yàn)室，河南 鄭州，450002)

金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)是危害公共衛(wèi)生的主要食源性致病菌之一[1]。中國疾病預(yù)防控制中心2019年共報(bào)告了91起因金黃色葡萄球菌及其毒素引起的暴發(fā)性食源性疾病事件，導(dǎo)致了1 023人患病住院治療[2-3]。金黃色葡萄球菌的爆發(fā)主要與被污染的食品有關(guān)，其廣泛存在于未經(jīng)深度處理的食品原材料、即食食品和操作不規(guī)范加工場所中[4]。

低溫冷藏是短時間內(nèi)儲存食品原料和產(chǎn)品、延長食品貨架期及長距離運(yùn)輸食品的最常用方法之一[5]。雖然低溫會影響基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯，從而抑制細(xì)胞復(fù)制[6]。但是金黃色葡萄球菌對4 ℃的低溫環(huán)境有較強(qiáng)的適應(yīng)性，在4 ℃貯藏60 d的奶制品進(jìn)行微生物檢測仍能發(fā)現(xiàn)有金黃色葡萄球菌存在。金黃色葡萄球菌長期受到低溫脅迫后可能會以小菌落變種(small colony ariants, SCs)形態(tài)存活8周或者更長的時間。SCs細(xì)胞是食品安全的重要挑戰(zhàn)，這是因?yàn)榕c正常細(xì)胞相比，SCs細(xì)胞通常具有較強(qiáng)的耐藥性，而且能夠抵抗宿主細(xì)胞的清除并存活數(shù)十年[7]。

細(xì)菌的細(xì)胞膜是保衛(wèi)細(xì)胞正常功能的第一道生物防線，在維持細(xì)胞形態(tài)、傳遞信息和與外界進(jìn)行物質(zhì)交換起到重要作用[8]。研究發(fā)現(xiàn)抗生素、抗菌肽和天然抑菌劑等物質(zhì)能通過作用細(xì)胞膜的靶向位點(diǎn)、破壞細(xì)胞膜的完整性改變其通透性，從而起到抑菌的作用[9]。然而，致病菌對低溫等環(huán)境脅迫的抗性差異性較大，細(xì)菌細(xì)胞膜的完整性對環(huán)境脅迫的抵抗能力是致病菌脅迫抗性的重要體現(xiàn)[10]。然而，金黃色葡萄球菌在低溫脅迫下細(xì)胞膜的完整性以及其抗性差異急需深入研究。

本實(shí)驗(yàn)對4株具有不同低溫耐受性金黃色葡萄球菌為供試菌株，基于平板計(jì)數(shù)法區(qū)分低溫抗性強(qiáng)弱不同的菌株，并觀測菌落形態(tài)、計(jì)算存活率。通過測定細(xì)胞內(nèi)容物泄露量、測定電導(dǎo)率方法、結(jié)晶紫方法對細(xì)胞膜完整性進(jìn)行研究；進(jìn)而通過實(shí)時熒光定量PCR(quantitatie real-time PCR, qRT-PCR)分析4株金黃色葡萄球菌的基因表達(dá)在低溫處理后參與機(jī)體調(diào)控的變化，以期在基因調(diào)控上詮釋不同金黃色葡萄球菌在低溫下的存活機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株來源

金黃色葡萄球菌(BB-1、BK-1、BH-25和FA-3)，實(shí)驗(yàn)室前期分離自當(dāng)?shù)乩滏準(zhǔn)称?，并通過Biolog技術(shù)[11]和nuc基因[12]作為引物的PCR法鑒定，菌株均保存于-80 ℃甘油管中。

1.1.2 培養(yǎng)基與試劑

TSA培養(yǎng)基、TSB培養(yǎng)基，北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司；酵母浸粉(yeast extract, YE)，上海生工生物工程股份有限公司；PBS、10 μg/mL結(jié)晶紫，北京索萊寶科技有限公司；無水乙醇，天津市德恩化學(xué)試劑有限公司；TRIzon Reagent試劑，江蘇康為世紀(jì)生物科技有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、實(shí)時熒光定量試劑盒，翌圣生物科技有限公司。

1.1.3 儀器與設(shè)備

SX-500高壓蒸汽滅菌鍋，日本Tomy公司；Centrifuge 5430高速臺式離心機(jī)，德國Eppendorf公司；LHP-250智能恒溫恒濕培養(yǎng)箱，上海鴻都電子科技有限公司；CD-6 ASX游標(biāo)卡尺，日本株式會社三豐；NanoDrop 2000核酸蛋白微量測定儀，美國賽默飛世爾科技有限公司；DDS-307A電導(dǎo)率儀，上海儀電有限公司；EPOCH2微孔板分光光度計(jì)，美國Biotek公司；StepOne Plus實(shí)時熒光定量PCR儀，美國ABI公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 菌懸液的制備

將供試菌株37 ℃振蕩培養(yǎng)至指數(shù)期后期，取25 mL的細(xì)胞培養(yǎng)液經(jīng)4 ℃、8 000 r/min離心5 min收集后，用PBS清洗2次，懸浮于等體積的PBS中制成菌懸液。

1.2.2 金黃色葡萄球菌菌落形態(tài)和活性細(xì)胞數(shù)目測定

將上述菌懸液保存于4 ℃冰箱中，每7 d在TSA-YE平板上用涂布平板法測定菌落總數(shù)，連續(xù)測定4周，存活率[13]按照公式(1)計(jì)算：

(1)

觀察菌落TSA-YE平板上的金黃色葡萄球菌菌落形態(tài)，直徑小于1 mm的菌落定義為SCs細(xì)胞[7]，并比較形成SCs細(xì)胞的菌株與未形成的菌株在低溫下存活能力的差異。

1.2.3 菌懸液內(nèi)容物泄漏量的測定

取1 mL低溫處理的菌液到1.5 mL無酶離心管，4 ℃、8 000 r/min離心5 min，取上清液3 μL，用核酸蛋白微量測定儀測定胞內(nèi)核酸和蛋白質(zhì)泄露量[14]。所有操作都在冰上完成，以減少核酸和蛋白質(zhì)的降解。

1.2.4 菌懸液電導(dǎo)率的測定

取5 mL低溫處理的菌液到15 mL無酶離心管，4 ℃、8 000 r/min離心5 min，吸上清液并使用電導(dǎo)率儀進(jìn)行電導(dǎo)率的測定，所有操作皆在冰上完成。

1.2.5 細(xì)胞膜完整性的測定

取5 mL低溫處理的菌液，4 ℃、8 000 r/min離心5 min，并用預(yù)冷的PBS清洗，重復(fù)3次。得到的菌泥重懸于含有10 μg/mL結(jié)晶紫的PBS中37 ℃培養(yǎng)10 min。之后于4 ℃、12 000 r/min離心15 min，收集上清液使用微孔板分光光度計(jì)測量590 nm處吸光度。

1.2.6 RNA提取和反轉(zhuǎn)錄

使用TRIzol法分別提取低溫處理7 d和新鮮的金黃色葡萄球菌RNA，操作按照TRIzon Reagent說明書。提取的RNA經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳和核酸蛋白微量測定儀檢測純度、濃度和完整度，隨后使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄為cDNA，操作按照說明書進(jìn)行。反轉(zhuǎn)錄后的cDNA和引物經(jīng)過1%瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證后，進(jìn)行實(shí)時熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)。

1.2.7 反轉(zhuǎn)錄實(shí)時熒光定量PCR檢測目的基因表達(dá)

qRT-PCR檢測方法如下，20 μL反應(yīng)體系包括：10 μL qPCR SYBR Green Master Mix (High Rox Plus)、上下游引物各0.4 μL、1 μL模板DNA、剩余體積使用無菌超純水補(bǔ)齊。部分引物參考文獻(xiàn)[15]設(shè)計(jì)，其余引物通過Primer-BLAST(https://www.ncbi.nlm.nih.go/)設(shè)計(jì)，并由鄭州尚亞生物公司合成，如表1所示，引物所擴(kuò)增產(chǎn)物的正確性通過對基因組DNA的PCR擴(kuò)增后測序以驗(yàn)證。qRT-PCR使用StepOnePlus實(shí)時熒光定量PCR儀進(jìn)行，擴(kuò)增程序[15]為：95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性10 s、60 ℃退火20 s、72 ℃延伸20 s，擴(kuò)增40個循環(huán)。以16 s rDNA為內(nèi)參基因，數(shù)據(jù)使用2-ΔΔCt法定量分析[16]。

表1 實(shí)時熒光定量引物Table 1 Primer pairs used for qRT-PCR

1.2.8 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

所有實(shí)驗(yàn)均進(jìn)行3個平行，應(yīng)用Excel 2019軟件計(jì)算平均值和誤差，并采用One-Way ANOA比較在P<0.05水平的差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 低溫處理后金黃色葡萄球菌菌落形態(tài)和活細(xì)胞數(shù)目的變化

經(jīng)過低溫處理后，4株金黃色葡萄球菌平板菌落的形態(tài)如圖1所示，BB-1表現(xiàn)出與其未處理正常細(xì)胞所見非典型生長特征，呈明顯的小菌落形態(tài)(即SCs細(xì)胞)(圖1-b)，通過游標(biāo)卡尺測量直徑為(0.32±0.04) mm；而其他3株金黃色葡萄球菌形態(tài)上與處理前變化不大(圖1-d、圖1-f、圖1-h)，測量出直徑為(1.12±0.02) mm，和SCs細(xì)胞直徑具有顯著性差異(P<0.05)。

a, c, e和g-BB-1、BK-1、BH-25和FA-3在平板上的菌落形態(tài)；b, d, f和h-經(jīng)過低溫處理后的菌株BB-1、BK-1、BH-25和FA-3 在平板上的菌落形態(tài)；i-低溫對不同金黃色葡萄球菌的活細(xì)胞數(shù)目的影響；j-低溫對不同金黃色葡萄球菌存活率的影響圖1 低溫處理后金黃色葡萄球菌菌落形態(tài)和活細(xì)胞數(shù)目以及存活率的變化Fig.1 Changes in colonial morphology and iable cell number of S.aureus after low temperature treatment 注：不同字母表示在P<0.05水平上差異顯著

在低溫脅迫下，4株金黃色葡萄球菌的活細(xì)胞數(shù)下降2.38～5.03 lg CFU/mL (圖1-i)，但下降程度各不相同。其中，金黃色葡萄球菌BB-1在4周的低溫脅迫后數(shù)目下降2.38 lg CFU/mL，存活率為75.5%。然而，BH-25在4周低溫脅迫后活細(xì)胞數(shù)目下降5.03 lg CFU/mL，與BB-1相比高2.65 lg CFU/mL(P<0.05)，存活率僅為45.34%，與BB-1相差30.16%(P<0.05)。因此，能形成SCs細(xì)胞金黃色葡萄球菌BB-1的低溫抗性較其他3株金黃色葡萄球菌強(qiáng)，而BH-25的低溫抗性最弱。

2.2 低溫脅迫下金黃色葡萄球菌細(xì)胞膜通透性的變化

如圖2-a、圖2-b所示，在低溫脅迫處理過程中，4株金黃色葡萄球菌的胞內(nèi)物質(zhì)泄露量均不斷增大，其中BB-1蛋白質(zhì)泄露量最低，為0.687 mg/mL，核酸泄露量為96.1 ng/μL；但是，BH-25蛋白質(zhì)泄露量為1.284 mg/mL，比BB-1多0.597 mg/mL(P<0.05)，核酸泄露量為130.9 ng/μL比BB-1多34.8 ng/μL(P<0.05)；其余2株菌的泄露量介于BB-1和BH-25菌株之間，BK-1蛋白質(zhì)泄露量為0.938 mg/mL，核酸泄露量為117.5 ng/μL；FA-3蛋白質(zhì)泄露量為1.216 mg/mL，核酸泄露量為129.1 ng/μL。由此可見，在4周低溫處理后的BB-1胞內(nèi)蛋白質(zhì)和核酸泄露量均少于其他3株金黃色葡萄球菌，而BH-25的泄露量最多。

菌懸液的電導(dǎo)率測定結(jié)果如圖2-c所示。4周后BB-1電導(dǎo)率上升最小為1.6 μS/cm，BH-25電導(dǎo)率上升最大為2.3 μS/cm比BB-1多上升0.7 μS/cm(P<0.05)；BK-1菌懸液電導(dǎo)率上升1.9 μS/cm、FA-3上升2.1 μS/cm。結(jié)果表明，BB-1的電解質(zhì)泄露量較少，菌懸液電導(dǎo)率較低；而BH-25電解質(zhì)泄露量較大，菌懸液電導(dǎo)率較高。

各菌株細(xì)胞膜通透性如圖2-d所示。經(jīng)過4周低溫處理后，4株金黃色葡萄球菌的細(xì)胞膜通透性都有所上升。4周低溫處理后BB-1的OD590值在4株菌株中下降最少為1.81；BH-25的OD590值在4株菌株中下降最多為2.32；BK-1的OD590值下降2.08；FA-3的OD590值下降2.23。

因此，通過測量胞內(nèi)泄露量、菌懸液電導(dǎo)率和結(jié)晶紫染色法測定金黃色葡萄球菌細(xì)胞膜完整性，結(jié)果表明在低溫脅迫處理后，金黃色葡萄球菌BB-1的細(xì)胞膜通透性最低，完整性最好；BH-25的細(xì)胞膜通透性最高且完整性最差，BB-1和BH-25菌株在細(xì)胞膜完整性上具有顯著性差異(P<0.05)。

a-胞內(nèi)蛋白質(zhì)泄露量；b-胞內(nèi)核酸泄露量；c-菌懸液電導(dǎo)率；d-細(xì)胞膜通透性圖2 低溫對不同金黃色葡萄球菌細(xì)胞膜完整性的影響Fig.2 Effect of low temperature on the cell membrane integrity of different S.aureus strains

2.3 基因?qū)崟r熒光定量PCR分析

金黃色葡萄球菌的抗逆基因(rsb、rsbW和sigB)和細(xì)胞膜脂肪酸相關(guān)基因(fabD、fabF、fabG、fabH和fabI)表達(dá)量結(jié)果如圖3所示。

圖3 低溫對不同金黃色葡萄球菌相關(guān)基因表達(dá)量的影響Fig.3 Effect of low temperature on the transcription of related genes of different S.aureus strains 注：虛線為內(nèi)參基因表達(dá)量

在7 d低溫處理后，BB-1和BK-1上述基因表達(dá)水平上調(diào)，而FA-3和BH-25基因表達(dá)水平下調(diào)。其中，BB-1的rsb、rsbW和sigB基因表達(dá)水平分別上調(diào)5.89、13.49和8.02倍，可能和機(jī)體積極抵抗環(huán)境的作用有關(guān)；然而BH-25的rsb、rsbW和sigB基因表達(dá)水平卻分別下調(diào)0.015、0.046和0.018倍，顯著低于BB-1的基因表達(dá)(P<0.05)。在fab家族基因表達(dá)水平中，BB-1的fabD、fabF、fabG、fabH和fabI基因表達(dá)水平分別上調(diào)12.18、21.64、12.87、10.10和21.71倍，這可能和細(xì)胞膜脂肪酸的生物合成水平增加有關(guān)；但是BH-25的fabD、fabF、fabG、fabH和fabI基因表達(dá)水平卻分別下調(diào)0.26、0.14、0.26、0.095和0.19倍，顯著低于BB-1的基因表達(dá)水平(P<0.05)。因此，在8個基因表達(dá)上，4株金黃色葡萄球菌有不同結(jié)果，低溫抗性能力強(qiáng)的BB-1抗逆基因和細(xì)胞膜脂肪酸相關(guān)基因表達(dá)皆上調(diào)，而低溫抗性能力最弱的BH-25基因表達(dá)水平皆顯著下調(diào)。

3 討論

金黃色葡萄球菌的低溫抗性較強(qiáng)[17]，本研究對不同金黃色葡萄球菌在長期低溫脅迫下活細(xì)胞數(shù)目、細(xì)胞膜完整性和相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平等進(jìn)行探究。結(jié)果表明，能形成SCs細(xì)胞的BB-1比未能形成SCs細(xì)胞的其他3株菌在低溫下存活能力更強(qiáng)，存活率更高。而在環(huán)境脅迫下可形成SCs狀態(tài)的致病菌被認(rèn)為是其抗逆存活的重要調(diào)控方式之一，并且SCs細(xì)胞通常具有極強(qiáng)的耐受性和抵抗能力，這和前人結(jié)果一致[7]。

細(xì)胞膜可以控制物質(zhì)的進(jìn)出和細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)的運(yùn)輸，同時協(xié)助其抵抗外界不利環(huán)境和宿主免疫系統(tǒng)的侵害[18]。本研究通過測定細(xì)胞內(nèi)容物泄露量、電導(dǎo)率和結(jié)晶紫法驗(yàn)證金黃色葡萄球菌在低溫脅迫下細(xì)胞膜的完整性。形成SCs細(xì)胞的BB-1在低溫脅迫下金黃色葡萄球菌細(xì)胞膜的完整性要優(yōu)于未形成SCs的菌株，細(xì)胞內(nèi)容物泄露最少，且存活率最高。這和經(jīng)過低溫誘導(dǎo)而形成SCs細(xì)胞壁變厚，細(xì)胞膜更完整，細(xì)胞生存能力更強(qiáng)的研究結(jié)果近似[19]。

有研究稱，rsb-rsbW/sigB系統(tǒng)是機(jī)體的抗性調(diào)節(jié)系統(tǒng)，SigB因子在抗惡劣環(huán)境中起到至關(guān)重要的作用，SigB因子介導(dǎo)嘧啶生物的合成，從而調(diào)控綠膿桿菌SCs形成[20]。而SigB因子調(diào)節(jié)功能的發(fā)揮受RsbW和Rsb的調(diào)控，其中RsbW能夠與SigB結(jié)合，從而阻滯SigB功能的發(fā)揮。Rsb又稱為SigB拮抗劑抑制因子，即只有當(dāng)Rsb與RsbW結(jié)合后，SigB因子才能夠釋放并發(fā)揮其脅迫耐受調(diào)節(jié)功能。SigB因子可以在惡劣環(huán)境下激活，例如暴露于熱、鹽和抗菌物質(zhì)，這些條件刺激sigma因子的sigB基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)，進(jìn)而編碼應(yīng)激蛋白和其他機(jī)體防御進(jìn)程[21]。而Rsb、RsbW和SigB因子受到rsb、rsbW和sigB基因編碼，所以通過rsb、rsbW和sigB表達(dá)情況分析可以了解抗性調(diào)節(jié)系統(tǒng)的作用情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)對低溫抗性強(qiáng)且能突變成SCs細(xì)胞的BB-1菌株sigB基因表達(dá)量上調(diào)最多，而低溫抗性最差的BH-25菌株sigB基因表達(dá)水平下調(diào)最多。而SCs細(xì)胞的形成可能與sigB基因的上調(diào)表達(dá)有關(guān)，這和ALRESHIDI等[19]的研究結(jié)果相符。這也表明BB-1菌株能更好地通過rsb-rsbW/sigB系統(tǒng)在低溫脅迫下調(diào)節(jié)機(jī)體功能，使得菌體對低溫的抗性更強(qiáng)。而BH-25菌株體內(nèi)rsb-rsbW/sigB系統(tǒng)卻無法發(fā)揮作用，這也可能是導(dǎo)致其低溫抗性最差的原因之一。

另外，長期低溫環(huán)境會引起細(xì)菌細(xì)胞膜發(fā)生改變，細(xì)胞膜的變化主要和細(xì)胞膜上的脂肪酸響應(yīng)環(huán)境壓力的修飾改變有關(guān)，并在很大程度上歸功于生物合成基因的調(diào)節(jié)。fab家族基因主要參與調(diào)控細(xì)胞膜脂肪酸的合成，fabD基因編碼丙二酸單酰-輔酶A-ACP轉(zhuǎn)移酶參與脂肪酸合成第一步，其催化丙二酸單?；鶑囊阴oA到?；d體ACP的硫酯轉(zhuǎn)移[22]。fabF和fabH基因參與編碼β-酮脂?；?ACP合酶和β-酮脂酰基-ACP合酶III，它們分別在碳碳鍵合成和支鏈脂肪酸縮合中起作用[23]，該過程是脂肪酸合成縮合步驟的起始。fabG負(fù)責(zé)編碼酮脂?；€原酶，可以還原4-氯乙酰乙酸乙酯[24]。fabI編碼烯脂?；?ACP還原酶在脂肪酸生物合成步驟和完成延伸步驟中作用[25]，細(xì)胞膜脂肪酸合成詳細(xì)步驟如圖4所示。

圖4 細(xì)胞膜脂肪酸合成步驟Fig.4 Cell membrane fatty acid synthesis steps 注：圖中FabD、FabF、FabG、FabH和FabI皆為參與合成的酶， 分別由fabD、fabF、fabG、fabH和fabI基因編碼

當(dāng)細(xì)胞遭到脅迫后，細(xì)胞膜脂肪酸生物合成的基因會上調(diào)表達(dá)響應(yīng)不利環(huán)境，這與WANG等[8]結(jié)果相似。因此解釋了BB-1菌株在低溫下通過細(xì)胞膜脂肪酸生物合成基因表達(dá)水平的上調(diào)導(dǎo)致機(jī)體合成脂肪酸能力加強(qiáng)，細(xì)胞膜完整性較好；而BH-25菌株細(xì)胞膜脂肪酸生物合成基因表達(dá)水平的下調(diào)可能導(dǎo)致機(jī)體無法維持正常生存的細(xì)胞膜脂肪酸能力，使得細(xì)胞膜完整性變差。

4 結(jié)論

總之，低溫能夠抑制金黃色葡萄球菌的生存，但由于存在種間抗性差異和小菌落變種情況，4株金黃色葡萄球菌對低溫有不同的耐受性，能夠形成SCs細(xì)胞的菌株低溫抗性最強(qiáng)存活率更高。并且低溫改變了細(xì)胞膜的通透性，使得細(xì)胞質(zhì)物質(zhì)流出胞外，但是SCs細(xì)胞的細(xì)胞膜完整性較好，細(xì)胞內(nèi)容物流出最少，這可能由于形成SCs后細(xì)胞膜比普通菌株細(xì)胞膜更完整，具有存活優(yōu)勢。而能形成SCs細(xì)胞可能與rsb-rsbW/sigB系統(tǒng)發(fā)揮作用有關(guān)，能夠使細(xì)胞在惡劣環(huán)境下做出有利的響應(yīng)，并且該系統(tǒng)還可能調(diào)控細(xì)胞膜脂肪酸合成基因(fabD、fabF、fabG、fabH和fabI)的表達(dá)量增強(qiáng)，使得SCs細(xì)胞的細(xì)胞膜完整性更好，細(xì)胞內(nèi)環(huán)境更加穩(wěn)定，并且有助于細(xì)胞在低溫下存活。但SCs細(xì)胞的低溫脅迫抗性調(diào)節(jié)分子機(jī)制及關(guān)鍵基因的作用，仍有待于今后進(jìn)一步的研究探討。提醒我們即使長期冷藏的食品也會有金黃色葡萄球菌存活，更要避免低溫耐受性強(qiáng)的菌株污染食品造成更大的危害，要求我們能找到對冷藏食品更有效的殺菌方式。