朱笑舉 潘鋒 陳妍蓓 陳致宏 鄭永仁 尹梅芳 劉正

摘要：目的 觀察電針“梨狀二穴”對腰椎間盤突出癥模型大鼠的神經(jīng)肽NPY、SP及背根神經(jīng)節(jié)的影響。 方法 將32只SD大鼠隨機分為空白組、模型組、電針1組和電針2組，每組8只。治療6 d后，腹主動脈采血取各組大鼠血清，采用ELISA法檢測各組血清中神經(jīng)肽（NPY、SP）含量，并在各組中隨機取2只大鼠的背根神經(jīng)節(jié)進(jìn)行HE染色觀察其病理改變。 結(jié)果 模型組血清NPY、SP含量較空白組、電針1組、電針2組均升高，且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）;電針1組、電針2組血清NPY、SP含量均低于空白組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）;電針1組血清NPY、SP含量低于電針2組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。模型組大鼠背根神經(jīng)節(jié)細(xì)胞出現(xiàn)病理性改變;電針1組及電針2組背根神經(jīng)節(jié)細(xì)胞得到一定程度的恢復(fù)。結(jié)論 電針“梨狀二穴”降低了致痛因子如NPY、SP在外周的含量，促進(jìn)了背根神經(jīng)節(jié)的細(xì)胞組織形態(tài)的修復(fù)，從而減輕炎癥反應(yīng)，降低疼痛程度，消除疼痛癥狀。

關(guān)鍵詞：梨狀二穴;腰椎間盤突出癥;NPY;SP;神經(jīng)節(jié)

中圖分類號：R245.9?? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A?? 文章編號：1007-2349（2022）05-0066-05

Effects of Electro-acupuncture at Piriform Two Points on NPY， SP and Ganglia in Ratswith Lumbar Disc Herniation

ZHU Xiao-ju1， PAN Feng1， CHEN Yan-bei1， CHEN Zhi-hong1， ZHENG Yong-ren2， YIN Mei-fang1， LIU Zheng1

（1. Qujing Hospital of Traditional Chinese Medicine， Qujing 655000， China;2. Yunnan University of Traditional Chinese Medicine， Kunming 650500， China）

【Abstract】Objective： To observe the effect of electro-acupuncture at “two piriform points” on the neuropeptides NPY， SP and dorsal root ganglia in lumbar disc herniation model rats. Methods： 32 SD rats were randomly divided into blank group， model group， electro-acupuncture group 1 and electro-acupuncture group 2， 8 rats each group. After 6-day treatment， their blood was collected from the abdominal aorta to obtain the serum of the rats in each group， and the serum neuropeptide （NPY and SP） content of each group was detected by ELISA. The dorsal root ganglia of 2 rats from each group were randomly selected to observe the pathological changes by HE staining. Results： Compared with that of the blank group， EA group 1 and EA group 2， the serum NPY and SP levels of the model group were increased and the differences were statistically significant （P<0.05）. The serum NPY and SP contents of the EA group 1 and EA group 2 were lower than those of the blank group， and the difference was statistically significant （P<0.05）. The serum NPY and SP contents of the EA group 1 were lower than those of the EA group 2， and the difference was statistically significant （P<0.05）. The dorsal root ganglion cells of the rats in the model group showed pathological changes and the dorsal root ganglion cells of the EA group 1 and 2 groups recovered to a certain extent. Conclusion： Electro-acupuncture at “Piriform Two Point” reduces the content of pain-inducing factors such as NPY and SP in the periphery and promotes the repair of cell tissue morphology in the dorsal root ganglion， thereby alleviating the inflammatory response， reducing the degree of pain and eliminating pain symptoms.

【Key words】Piriform Two Points; Lumbar Disc Herniation; NPY; SP; Ganglion

腰椎間盤突出癥（lumbar disc herniation，LDH）是一種臨床常見的多發(fā)病，主要是由于腰椎間盤退行性改變，導(dǎo)致腰椎間盤纖維環(huán)發(fā)生部分或完全斷裂，內(nèi)部髓核向外突出刺激或壓迫脊神經(jīng)根導(dǎo)致神經(jīng)根發(fā)生炎癥反應(yīng)[1]，表現(xiàn)為腰痛、下肢麻木或疼痛，嚴(yán)重者甚至出現(xiàn)下肢活動障礙，嚴(yán)重影響患者的日常生活和工作。當(dāng)前隨著人們生活方式的轉(zhuǎn)變，該病的發(fā)病率正在逐年上升，且復(fù)發(fā)率較高。筆者自創(chuàng)“梨狀二穴”，經(jīng)過十余年的臨床應(yīng)用，在治療腰椎間盤突出癥等疾病方面取得了很好療效[2-3]，但其作用機理尚待進(jìn)一步研究。本實驗意在通過電針“梨狀二穴”對腰椎間盤突出癥模型大鼠的神經(jīng)肽（NPY、SP）及背根神經(jīng)節(jié)形態(tài)的影響探索“梨狀二穴”的作用機制。

1 材料與方法

1.1 動物 健康成年SD大鼠（湖南斯萊克景達(dá)實驗動物有限公司）體重（200±20）g，動物級別為清潔級，動物房符合SPF屏障系統(tǒng)，溫度25℃，相對濕度45%，氣壓保持在適宜范圍內(nèi)。實驗過程中，所有動物在同等條件下飼養(yǎng)，自由飲水和攝食。動物適應(yīng)性飼養(yǎng)三天后進(jìn)行正式實驗，避免實驗誤差。實驗設(shè)計符合本院動物實驗倫理學(xué)規(guī)定。

1.2 實驗儀器與試劑 0.25 mm×13 mm規(guī)格一次性使用無菌針灸針;華佗牌SDZ-11電針儀;熱刺痛儀;25 、50 μL微量注射器;9號腰椎穿刺針;電子天平;移液槍;抗凝離心管;低溫離心機;病理切片機;酶聯(lián)免疫檢測儀器;超低溫冰箱;鹽酸利多卡因注射液;P物質(zhì)（SP）試劑盒;神經(jīng)肽Y（NPY）試劑盒;1%氯胺酮50 mg/kg;高效切片石蠟;蘇木素-伊紅染液;消毒紗布、干棉球若干。

1.3 分組方法 大鼠32只，按體重編號1～32號，隨機分為4組，每組8只，分別為（1）空白組：不做造模及治療處理，但是做斷尾處置，以防偏倚。（2）模型組：造成非壓迫腰椎間盤突出神經(jīng)根壓迫癥狀模型，但不做治療處理。（3）電針1組：造成非壓迫腰椎間盤髓核突出大鼠模型后選擇“梨狀二穴”進(jìn)行電針治療。（4）電針2組：造成非壓迫腰椎間盤髓核突出大鼠模型后選擇環(huán)跳-秩邊配伍進(jìn)行電針治療。

1.4 造模方法 參照陸志東等[4]非壓迫性腰椎間盤髓核突出模型的造模方法。術(shù)前1 d，1%氯胺酮50 mg/kg腹腔注射麻醉后將大鼠背部的毛剪短并用脫毛劑脫毛。手術(shù)時采用1%氯胺酮50 mg/kg腹腔注射麻醉，將大鼠尾部和背部消毒，鋪無菌巾，距尾根部1 cm處切斷鼠尾并縫合傷口，切開尾部椎間盤，見髓核呈膠凍樣，取5個髓核并加入50 μL生理鹽水，充分?jǐn)嚢璩苫鞈乙簜溆?。髓核混懸液制備完成后，將除空白組以外的大鼠置于屈曲側(cè)臥位，以L4～5棘突間隙為穿刺點用9號腰椎穿刺針行硬膜外穿刺，成功后用微量注射器注射50 μL大鼠自體髓核混懸液，接著將2%利多卡因25 μL注射到硬膜外腔中，拔除穿刺針，大鼠放入籠中觀察。氯胺酮麻醉恢復(fù)后，大鼠四肢活動自如，說明硬膜外穿刺和注射失敗;雙前肢活動自如，雙后肢運動、感覺喪失或減退，20～30 min后完全恢復(fù)，說明硬膜外穿刺注射成功，可繼續(xù)進(jìn)一步的觀察。

1.5 針刺干預(yù)

1.5.1 “梨狀二穴”定位 “梨狀二穴”包括“梨狀肌1”和“梨狀肌2”兩個穴位，其定位如下：“梨狀肌1”位于大鼠梨狀肌近骶骨端，大鼠秩邊穴直上5 mm;“梨狀肌2”位于梨狀肌近股骨大轉(zhuǎn)子端，大鼠環(huán)跳穴直上2.5 mm。

1.5.2 干預(yù)方法 造模成功后，所有大鼠均給予正常飼養(yǎng)。空白組、模型組不予干預(yù)，但在每天的治療時間要將其提拿出籠，以保證和其余大鼠刺激條件相同。電針1組、電針2組均在造模成功后第4 d開始干預(yù)，每日1次，共6次。電針1組：針“梨狀二穴”，直刺5～7 mm，接華佗牌SDZ-11電針儀，以連續(xù)波刺激，頻率2 Hz，強度2 mA（以大鼠后下肢出現(xiàn)輕微抽動但不掙扎為佳），留針時間30 min。電針2組：針環(huán)跳、秩邊，直刺5～7 mm，治療方法與電針1組相同。

1.6 觀察指標(biāo)的檢測

1.6.1 后肢熱刺激縮爪閾值的檢測 空白組、模型組、電針1組、電針2組大鼠，分別在造模前、造模結(jié)束后的第1、3 d及治療后的第2、4、6 d對右側(cè)后肢熱刺激縮爪閾差值進(jìn)行檢測。于室溫25℃左右將大鼠靜置于痛覺測試儀玻璃板上并用配套透明塑料固定籠分隔，適應(yīng)10 min安靜后用輻射熱光源（55±5）℃對準(zhǔn)足底中部外側(cè)，記錄大鼠出現(xiàn)疼痛反應(yīng)即縮腿甚至舔足的時間（即痛閾潛伏期），測量2次取平均值，每次間隔1 h。若照射50 s仍無反應(yīng)，則取出大鼠防止足底組織燙傷，按50s計算，使用自身前后對照方法進(jìn)行對比。

1.6.2 血清取樣及檢測 治療6 d后腹主動脈采血，取血5 mL放入抗凝的試管中，用4℃離心4000 rpm離心15 min，分離血清，置于-20℃保存應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附劑測定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）測定標(biāo)本中NPY、SP含量。測定嚴(yán)格按試劑盒說明進(jìn)行操作。

1.6.3 背根神經(jīng)節(jié)取樣及檢測 治療6 d后，每組隨機抽取2只大鼠，對其進(jìn)行腹腔麻醉，麻醉劑為1%氯胺酮50mg/kg進(jìn)行注射，麻醉后從大鼠臀部肌肉進(jìn)行解剖，暴露坐骨神經(jīng)，沿著坐骨神經(jīng)往上解剖脊柱關(guān)節(jié)至L5～S1椎間孔處，剪開椎板，將椎間孔里面的神經(jīng)充分暴露，背根神經(jīng)節(jié)呈楠圓形米粒般大小，將神經(jīng)節(jié)取出加4%多聚甲醛緩沖液進(jìn)行常溫保存。背根神經(jīng)節(jié)進(jìn)行包埋、切片、HE染色，最后使用切片掃描儀進(jìn)行數(shù)字掃描成像后觀察，描述其主要病理改變，拍攝或截取對應(yīng)描述中不同的典型病變部位并用箭頭標(biāo)識。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法 所得數(shù)據(jù)使用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行正態(tài)分布檢驗，服從正態(tài)分布結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示。組間比較時，若組內(nèi)服從正態(tài)分布，則采用單因素方差分析（One-way ANOVA），檢驗以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 整體情況 造模后的大鼠較造模前對比，精神狀態(tài)下降，活動量減少，飲食飲水隨之減少。各組的大鼠在活動時前肢較正常沒有改變，后肢造模后有明顯改變，行動方式大多改為爬行為主，速度緩慢，頻率及幅度降低。造模后的各組大鼠未發(fā)現(xiàn)有后肢癱瘓、步態(tài)不穩(wěn)、足外翻以及大小便失禁的情況。

2.2 后肢熱刺激縮痛閾值 造模前，各組大鼠后肢熱刺激縮痛閾值比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。造模后第3 d，模型組、電針1組和電針2組與造模前對比有差異（P<0.05），提示模型組、電針1組和電針2組造模后熱痛刺激縮爪閾值下降，即造模成功;模型組、電針1組和電針2組之間閾值無差異（P>0.05），具有可比性。干預(yù)6 d后，電針1組、電針2組的閾值分別與本組造模后3 d的閾值比較，有顯著性差別（P<0.05），提示干預(yù)6 d后熱痛刺激縮痛閾值明顯提升，說明大鼠的痛覺的敏感緩解，經(jīng)干預(yù)后大鼠疼痛減輕。見表1。

2.3 血清NPY、SP含量 電針干預(yù)6 d后，各實驗組大鼠血清NPY含量比較，采用單因素方差分析（One-way ANOVA）發(fā)現(xiàn)：F=47.05、P<0.0001，組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義。模型組血清NPY含量均較空白組、電針1組、電針2組升高，且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）;電針1組、電針2組血清NPY含量均低于空白組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）;電針1組與電針2組相比，電針1組血清NPY含量低于電針2組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。各實驗組大鼠血清SP含量比較，采用單因素方差分析（One-way ANOVA）發(fā)現(xiàn)：F=79.19、P<0.0001，組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義。與模型組相比，空白組、電針1組、電針2組血清SP含量均降低，且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）;與空白組相比，電針1組、電針2組血清SP含量均較低，且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）;電針1組血清SP含量低于電針2組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。見表2。

2.4 背根神經(jīng)節(jié)HE染色光鏡觀察 空白組：大鼠背根神經(jīng)節(jié)結(jié)構(gòu)完整，形態(tài)飽滿，核位于中央，質(zhì)均勻，大而圓，核仁清晰，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)充滿顆粒狀尼氏小體，髓鞘完整，排列規(guī)則，軸突清晰（圖1-A）。模型組：大鼠細(xì)胞出現(xiàn)皺縮、形狀不規(guī)則，胞質(zhì)模糊，邊界不清，核固縮，尼氏小體減少，神經(jīng)纖維斷裂，髓鞘不完整（圖1-B）。電針1組：少量細(xì)胞核偏移，核仁大較清晰，髓鞘整體排列規(guī)則（圖1-C）。電針2組：少量細(xì)胞胞質(zhì)模糊，核仁較清晰，髓鞘整體排列規(guī)則（圖1-D）。

3 討論

“梨狀二穴”為劉正主任醫(yī)師根據(jù)臨床經(jīng)驗自擬創(chuàng)立，包括“梨狀肌1”穴和“梨狀肌2”穴。梨狀肌1穴位于秩邊穴直上1寸，與秩邊同屬足太陽膀胱經(jīng);梨狀肌2穴位于環(huán)跳穴直上0.5寸，與環(huán)跳同屬足少陽膽經(jīng)。從解剖位置上看，二穴均在梨狀肌肌腹上，深層走行的是從坐骨大孔穿出的坐骨神經(jīng)。臨床治療發(fā)現(xiàn)，針刺此二穴對坐骨神經(jīng)的刺激作用較“秩邊”、“環(huán)跳”更強，故采用“梨狀二穴”治療腰椎間盤突出癥具有較好療效。

LDH在中醫(yī)學(xué)上屬于“腰腿痛”、“痹證”的范疇，中醫(yī)學(xué)認(rèn)為其發(fā)病主要是由于腰部急、慢性損傷，風(fēng)寒濕邪侵襲等因素有關(guān)，本病病機在于肝腎不足，筋骨不健，復(fù)受勞損扭挫，或感風(fēng)寒濕熱之邪，經(jīng)絡(luò)閉阻，氣滯血瘀，不通則痛[5]?！夺樉募滓医?jīng)·陰受病發(fā)痹第一》云：“腰脅相引痛急，髀筋瘈脛，肱痛不可屈伸，痹不仁，環(huán)跳主之?！薄！夺樉募滓医?jīng)·腎小腸受病發(fā)腹脹腰痛引背少腹控睪第八》曰：“腰痛骶寒，俯仰急難，陰痛下重，不得小便，秩邊主之?！杯h(huán)跳穴、秩邊穴為治療腰椎間盤突出癥的常用穴位?！袄鏍疃ā笔桥R床經(jīng)驗用穴，從解剖位置來看，位于梨狀肌肌腹上，深層走行是沿坐骨大孔穿出的坐骨神經(jīng)，臨床運用時針感較上述二穴更強，療效也頗為顯著。

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為當(dāng)腰椎間盤纖維環(huán)破裂時，即使髓核未直接壓迫到神經(jīng)根，也會出現(xiàn)神經(jīng)根損傷的臨床表現(xiàn)，這是因為機械壓迫并不是產(chǎn)生疼痛的主導(dǎo)原因，疼痛的主要發(fā)生原因是由于局部的炎癥反應(yīng)所致[6]。本次研究的造模方法用了大鼠的自體髓核混懸液注射到大鼠體內(nèi)造成非壓迫性腰椎間盤突出癥大鼠模型，利用腰椎硬膜外穿刺技術(shù)，將自體髓核混懸液注入到大鼠腰椎硬膜外腔，髓核基質(zhì)里的部分蛋白成為抗原，如糖蛋白和韌皮蛋白等，機體組織受到這些抗原的不斷刺激，從而引發(fā)免疫反應(yīng)誘發(fā)疼痛，這一過程包括了NPY、SP等在內(nèi)的各種細(xì)胞因子和化學(xué)因子在內(nèi)的致炎因子參與[7]。

SP是一種由11個氨基酸組成的多肽，是痛覺傳導(dǎo)的神經(jīng)遞質(zhì)，主要傳遞銳痛，是非腎上腺素能非膽堿能神經(jīng)末梢所釋放的一種神經(jīng)肽[8]。SP在中樞神經(jīng)、外周神經(jīng)系統(tǒng)和組織中廣泛分布，在整個疼痛傳遞過程中，將疼痛信號由初級神經(jīng)元傳遞到次級神經(jīng)元，在疼痛的產(chǎn)生和發(fā)展過程中起著十分關(guān)鍵的作用[9]。李育剛[10]通過研究發(fā)現(xiàn)腰椎間盤突出癥患者SP含量明顯高于健康的人SP含量，而且SP含量與疼痛強度呈正相關(guān)。NPY同屬于神經(jīng)肽類物質(zhì)，廣泛存在于中樞和外周神經(jīng)系統(tǒng)中，研究發(fā)現(xiàn)免疫陽性神經(jīng)纖維廣泛分布于椎體、椎間盤、脊柱韌帶中，并且在纖維環(huán)外層分布最多，參與了椎間盤細(xì)胞外基質(zhì)降解、細(xì)胞凋亡與自噬、氧化應(yīng)激、新生血管生成以及免疫穩(wěn)態(tài)等過程[11]。此外，NPY還可誘導(dǎo)肥大細(xì)胞釋放5-HT，引起疼痛或加重疼痛[12]。通過本研究結(jié)果不難發(fā)現(xiàn)，對大鼠進(jìn)行造模后大鼠血清NPY、SP含量的明顯升高，經(jīng)6 d干預(yù)后大鼠血清NPY、SP的含量有所降低，且“梨狀二穴”組的大鼠血清NPY、SP的下降程度大于“環(huán)跳、秩邊”組的大鼠，因此，可以認(rèn)為“梨狀二穴”可以通過調(diào)節(jié)外周NPY、SP的含量來起到鎮(zhèn)痛的作用，且效果優(yōu)于“環(huán)跳、秩邊”。

干預(yù)6 d后將大鼠的背根神經(jīng)節(jié)進(jìn)行HE染色，并在光鏡下觀察發(fā)現(xiàn)：模型組細(xì)胞出現(xiàn)皺縮、形狀不規(guī)則，胞質(zhì)模糊，邊界不清，核固縮，尼氏小體減少，神經(jīng)纖維斷裂，髓鞘不完整;運用“梨狀二穴”治療后少量細(xì)胞核偏移，核仁大較清晰，髓鞘整體排列規(guī)則;運用“環(huán)跳、秩邊”治療后少量細(xì)胞胞質(zhì)模糊，核仁較清晰，髓鞘整體排列規(guī)則。這表示經(jīng)過治療后，電針1組和電針2組神經(jīng)節(jié)內(nèi)的因髓核的免疫炎癥反應(yīng)導(dǎo)致的病理形態(tài)學(xué)改變均得到一定程度的恢復(fù)。

綜合上述的研究結(jié)果，可以推測出，大鼠經(jīng)過硬膜外注射自體髓核后誘發(fā)了的自身免疫反應(yīng)和炎癥反應(yīng)，使得神經(jīng)節(jié)水腫，出現(xiàn)病理性改變，電針“梨狀二穴”促進(jìn)了背根神經(jīng)節(jié)的細(xì)胞組織的修復(fù)，降低了神經(jīng)肽致痛因子如NPY、SP在外周的含量，從而減輕炎癥反應(yīng)，降低疼痛程度，消除疼痛癥狀。本研究初步從外周角度揭示了“梨狀二穴”治療腰椎間盤突出癥的機制。本研究因為經(jīng)費及時間的原因，造模時間及干預(yù)時間相對較短，僅能反映LDH發(fā)病急性階段的部分指標(biāo)變化，后續(xù)研究還可從不同的腰痛病類型、不同的理論機制對“梨狀二穴”的作用機制進(jìn)行更為綜合性的論證。

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（收稿日期：2021-09-01）