梁 峰，張 瑋，王勝杰，武雪亮，岳 磊，張迎春，*

(1．河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院普通外科，河北張家口 075000；2．河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院小兒外科，河北 張家口075000)

結(jié)直腸癌(colorectal cancer，CRC)是中國(guó)常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率呈逐年上升和年輕化趨勢(shì)[1]。盡管結(jié)直腸癌的診斷與治療已經(jīng)取得了顯著進(jìn)步，但其療效及預(yù)后仍不容樂(lè)觀[2]。長(zhǎng)鏈非編碼RNA(long noncoding RNA，lncRNA)是指長(zhǎng)度大于200 nt的非編碼RNA，其在表觀遺傳調(diào)控、轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后調(diào)控等生物學(xué)過(guò)程中發(fā)揮重要作用，廣泛參與調(diào)控腫瘤細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲、遷移等多種生物學(xué)過(guò)程，這為腫瘤的早期診斷和靶向治療提供了新的研究方向[3-6]。LncRNA RUNX1-IT1是新發(fā)現(xiàn)的一種非編碼RNA，關(guān)于lncRNA RUNX1-IT1在惡性腫瘤中的報(bào)道[7]不多，且經(jīng)IntaRNA 2.0軟件分析預(yù)測(cè)miR-21為lncRNA RUNX1-IT1作用靶點(diǎn)，但lncRNA RUNX1-IT1/miR-21調(diào)控軸對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞的作用未見(jiàn)報(bào)道?；诖耍狙芯刻接憀ncRNA RUNX1-IT1在結(jié)直腸癌組織和人結(jié)直腸癌細(xì)胞系中的表達(dá)情況，并分析其對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞惡性生物學(xué)行為的影響及其與miR-21的調(diào)控關(guān)系，以期為結(jié)直腸癌的臨床診斷和治療提供參考。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象

選取2017年1月—2019年1月于河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院接受根治性手術(shù)切除的結(jié)直腸癌組織標(biāo)本62例及其相應(yīng)的癌旁正常組織標(biāo)本(距離癌組織邊緣＞5 cm)62例。結(jié)直腸癌患者發(fā)病年齡在37～86歲，男37例，女25例；其中結(jié)腸癌患者33例，直腸癌患者29例。所有納入患者的臨床資料均完整，本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(2021177)，所有研究對(duì)象均知情同意并簽署知情同意書。納入標(biāo)準(zhǔn)：①術(shù)后病理確診為結(jié)直腸癌；②患者術(shù)前未接受過(guò)介入、放化療及免疫治療；③既往無(wú)其他腫瘤病史。排除標(biāo)準(zhǔn)：①伴有嚴(yán)重心、肝、腎功能異常者；②伴有其他惡性腫瘤；③術(shù)前行放化療或免疫治療等的患者。

1.2 細(xì)胞與試劑

人結(jié)直腸癌細(xì)胞系(SW480、SW620、HCT-116)和人正常結(jié)直腸上皮細(xì)胞系(FHC)均購(gòu)自北納生物。RPMI-1640和DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)購(gòu)自美國(guó)Gibco公司，雙熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)購(gòu)自美國(guó)Promega公司，TRIzol試劑盒、LipofectamineTM2000購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司，SYBR qPCR Master Mix和逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Prime ScriptTMRT Reagent Kit)購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司。

RUNX1-IT1過(guò)表達(dá)質(zhì)粒(pcDNA-RUNX1-IT1)及陰性對(duì)照質(zhì)粒(pcDNA-control)，miR-21抑制(anti-miR-21)及陰性對(duì)照(anti-miR-con)、miR-21過(guò)表達(dá)(miR-21 mimic)及陰性對(duì)照(mimic-NC)序列均由吉滿生物科技有限公司設(shè)計(jì)合成。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染

FHC細(xì)胞用含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，結(jié)直腸癌SW480、SW620和HCT116細(xì)胞用含有10%胎牛血清RPMI-1640培養(yǎng)液培養(yǎng)，分別放置在37℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。將SW480細(xì)胞以1×105個(gè)/孔接種至6孔培養(yǎng)板進(jìn)行培養(yǎng)，待細(xì)胞生長(zhǎng)至80%左右進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染，SW480細(xì)胞轉(zhuǎn)染前1 h更換為Opti-MEM減血清培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)染分為過(guò)表達(dá)(pcDNAcontrol、pcDNA-RUNX1-IT1)和抑制表達(dá)(pcDNARUNX1-IT1、pcDNA-RUNX1-IT1+anti-miR-con、pcDNA-RUNX1-IT1+miR-21)兩種方案分組；按照Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑說(shuō)明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染操作，轉(zhuǎn)染6 h后更換為含有10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后檢測(cè)過(guò)表達(dá)/干擾效果。

1.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)RUNX1-IT1在結(jié)直腸癌及癌旁組織中的表達(dá)

使用TRIzol試劑提取組織總RNA，超微量紫外分光光度計(jì)檢測(cè)RNA純度和濃度。根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。以1 μL cDNA為模板，按照實(shí)時(shí)熒光定量PCR(quantitative real-time PCR，qPCR)試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，59℃退火30 s，72℃延伸90 s，40個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸5 min。以GAPDH和U6作為內(nèi)參，采用2-ΔΔCT法計(jì)算RUNX1-IT1和miR-21的相對(duì)表達(dá)。引物序列如下：RUNX1-IT1上 游 引 物，5′-CCTACTTCTGCACGATGTGA TG-3′，下游引物，5′-CCTTTGCTACGGTTGGTTACA TT-3′；miR-21上游引物，5′-TTGAATTCTAACACC TTCGTGGCTACAGAG-3′，下游引物，5′-TTAGATC TCATTTATCGAGGGAAGGATTG-3′。

1.5 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)

采用IntaRNA 2.0(http://rna.informatik.uni-freiburg.de/IntaRNA/Input.jsp)軟件預(yù)測(cè)RUNX1-IT1與miR-21間的靶向結(jié)合序列，分別設(shè)計(jì)合成RUNX1-IT1的野生型(WT)和突變型(MUT)結(jié)合位點(diǎn)序列并整合至pGL3載體構(gòu)建報(bào)告基因質(zhì)粒(RUNX1-IT1-WT和RUNX1-IT1-MUT)，并將其加載到pMIR-GLO?熒光素酶載體中。將SW480細(xì)胞以1×105個(gè)/孔接種在12孔板中培養(yǎng)，并通過(guò)Lipofectamine 2000將含有RUNX1-IT1-WT或RUNX1-IT1-MUT和miR-21 mimic以 及miRNC的載體轉(zhuǎn)染到SW480細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染48 h后，再根據(jù)雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行螢火蟲熒光素酶活性檢測(cè)。

1.6 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移和侵襲能力

1.6.1 遷移實(shí)驗(yàn)收集轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SW480細(xì)胞，在Transwell上層小室加入稀釋后的SW480細(xì)胞(1×l06個(gè)/mL)，下室加入含10% FBS的細(xì)胞培養(yǎng)液，37℃培養(yǎng)24 h，取出上室，去除上層小室未遷移的細(xì)胞，用70%甲醛固定30 min，結(jié)晶紫染色拍照，顯微鏡下計(jì)數(shù)穿膜細(xì)胞數(shù)。

1.6.2 侵襲實(shí)驗(yàn)將-20℃取出的Matrigel置4℃冰箱過(guò)夜液化，4℃無(wú)血清培養(yǎng)基按1∶5比例稀釋Matrigel后，取100 μL加入到Transwell小室中，37℃使其凝固，按照遷移實(shí)驗(yàn)進(jìn)行后續(xù)操作。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，符合正態(tài)分布且方差齊性的計(jì)量資料以xˉ±s表示，兩組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差及兩兩比較LSD-t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。lncRNA RUNX1-IT1和miR-21在結(jié)直腸癌組織中表達(dá)的相關(guān)性采用Pearson檢驗(yàn)分析。

2 結(jié)果

2.1 RUNX1-IT1和miR-21在結(jié)直腸癌組織和結(jié)直腸癌細(xì)胞系中的表達(dá)情況

qPCR檢測(cè)結(jié)果表明lncRNA RUNX1-IT1在結(jié)直腸癌組織中的相對(duì)表達(dá)水平(3.323±0.150)顯著低于癌旁組織(4.372±0.166)；miR-21在結(jié)直腸癌組織中的相對(duì)表達(dá)水平(3.839±0.160)顯著高于癌旁組織(3.052±0.141)，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P＜0.01，圖1A和B)。LncRNA RUNX1-IT1和miR-21在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(r=-0.275，P=0.031，圖1C)。此外，lncRNA RUNX1-IT1在3種結(jié)直腸癌細(xì)胞系(SW480、SW620、HCT-116)中的表達(dá)水平均顯著低于正常結(jié)直腸FHC細(xì)胞(均為P＜0.05，圖1D)，而miR-21在上述3種結(jié)直腸癌細(xì)胞系中的表達(dá)水平明顯高于FHC細(xì)胞(均為P＜0.05，圖1E)，SW480細(xì)胞最明顯，故后續(xù)細(xì)胞系實(shí)驗(yàn)均采用SW480細(xì)胞。上述結(jié)果也表明lncRNA RUNX1-IT1低表達(dá)和miR-21高表達(dá)可能參與結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展。

圖1 RUNX1-IT1和miR-21在結(jié)直腸癌組織和細(xì)胞系中的表達(dá)

2.2 上調(diào)lncRNA RUNX1-IT1表達(dá)抑制SW480細(xì)胞的侵襲和遷移能力

與轉(zhuǎn)染pcDNA-control對(duì)照組相比，轉(zhuǎn)染pcDNARUNX1-IT1質(zhì)粒組SW480細(xì)胞中l(wèi)ncRNA RUNX1-IT1表達(dá)水平明顯升高(t=6.347，P=0.003)，見(jiàn)圖2A。Transwell侵襲和遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染pcDNARUNX1-IT1質(zhì)粒組的侵襲細(xì)胞數(shù)和遷移細(xì)胞數(shù)均明顯少于轉(zhuǎn)染對(duì)照組(侵襲實(shí)驗(yàn)：t=12.49，P＜0.01；遷移實(shí)驗(yàn)：t=5.764，P=0.005)，見(jiàn)圖2B。結(jié)果表明上調(diào)lncRNA RUNX1-IT1的表達(dá)可抑制SW480細(xì)胞侵襲和遷移能力。

圖2 上調(diào)RUNX1-IT1表達(dá)對(duì)SW480細(xì)胞侵襲和遷移能力的影響

2.3 lncRNA RUNX1-IT1和miR-21間 存 在 靶 向關(guān)系

通過(guò)IntaRNA 2.0預(yù)測(cè)到lncRNA RUNX1-IT1與miR-21之間存在靶向結(jié)合位點(diǎn)(圖3A)。雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與轉(zhuǎn)染mimic陰性對(duì)照組相比，轉(zhuǎn)染miR-21 mimic即過(guò)表達(dá)miR-21組lncRNA RUNX1-IT1 WT(野生型)的熒光素酶活性顯著下降(P＜0.05)，而lncRNA RUNX1-IT1 MUT(突變型)熒光素酶活性無(wú)明顯變化(圖3B)。qPCR檢測(cè)結(jié)果表明，與轉(zhuǎn)染pcDNAcontrol組(1.003±0.095)相比，在轉(zhuǎn)染pcDNA-RUNX1-IT1質(zhì)粒后，miR-21表達(dá)水平在SW480細(xì)胞中的明顯下降(0.293±0.020)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=7.289，P=0.002)。上述結(jié)果表明miR-21能夠靶向結(jié)合lncRNA RUNX1-IT1。

圖3 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證lncRNA RUNX1-IT1與miR-21間的靶向關(guān)系

2.4 抑制miR-21表達(dá)可抑制SW480細(xì)胞的侵襲和遷移能力

qPCR檢測(cè)結(jié)果顯示，與轉(zhuǎn)染anti-miR-con對(duì)照組相比，轉(zhuǎn)染anti-miR-21組后SW480細(xì)胞中miR-21表達(dá) 水 平 顯 著 降 低(t=6.80，P=0.002)，見(jiàn) 圖4A。Transwell侵襲和遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，anti-miR-21組的侵襲和遷移細(xì)胞數(shù)均明顯低于對(duì)照組(侵襲實(shí)驗(yàn)：t=16.360，P＜0.01；遷移實(shí)驗(yàn)：t=7.096，P=0.002)，見(jiàn)圖4B，表明miR-21表達(dá)下調(diào)可抑制SW480細(xì)胞的侵襲和遷移能力。

圖4 下調(diào)miR-21表達(dá)對(duì)SW480細(xì)胞侵襲和遷移能力的影響

2.5 過(guò)表達(dá)miR-21逆轉(zhuǎn)RUNX1-IT1對(duì)SW480細(xì)胞侵襲和遷移能力的抑制作用

qPCR檢測(cè)結(jié)果(圖5A)顯示，與轉(zhuǎn)染miR-con對(duì)照組比較，轉(zhuǎn)染miR-21過(guò)表達(dá)組SW480細(xì)胞中miR-21表達(dá)水平顯著升高(t=12.01，P＜0.01)。為確認(rèn)lncRNA RUNX1-IT1是否通過(guò)miR-21調(diào)控SW480細(xì)胞的侵襲和遷移，我們上調(diào)RUNX1-IT1的表達(dá)同時(shí)過(guò)表達(dá)miR-21。結(jié)果(圖5B)顯示，與轉(zhuǎn)染pcDNA-RUNX1-IT1+miR-con相比，共轉(zhuǎn)染pcDNA-RUNX1-IT1+miR-21組中細(xì)胞侵襲和遷移細(xì)胞數(shù)均顯著升高(均為P＜0.05)(侵襲實(shí)驗(yàn)：t=23.860，P＜0.01；遷移實(shí)驗(yàn)：t=11.020，P＜0.01)。上述結(jié)果表明過(guò)表達(dá)miR-21可逆轉(zhuǎn)lncRNA RUNX1-IT1表達(dá)上調(diào)對(duì)SW480細(xì)胞侵襲和遷移能力的抑制作用。

圖5 過(guò)表達(dá)miR-21逆轉(zhuǎn)RUNX1-IT1對(duì)SW480細(xì)胞侵襲和遷移能力的抑制作用

3 討論

結(jié)直腸癌早期癥狀隱匿，患者就診時(shí)大多處于中晚期，治療難度較大，盡管結(jié)直腸癌的診斷與治療已經(jīng)取得了顯著進(jìn)步，但其療效及預(yù)后仍不容樂(lè)觀[8-10]。因此，探尋可靠的生物標(biāo)志物對(duì)于結(jié)直腸癌患者的早期診斷、治療以及改善預(yù)后至關(guān)重要[11]。越來(lái)越多的證據(jù)表明，lncRNA異常表達(dá)與腫瘤發(fā)生、進(jìn)展和預(yù)后不良有關(guān)，可作為腫瘤早期診斷的新型生物標(biāo)志物[12-13]。

LncRNA RUNX1-IT1是轉(zhuǎn)錄因子RUNX1的內(nèi)含子轉(zhuǎn)錄本，也稱為21號(hào)染色體開放閱讀框96(C21orF96)。盡管RUNX1的功能已在不同疾病中得到證實(shí)，但lncRNA RUNX1-IT1在多種腫瘤中的功能及其潛在機(jī)制仍不清楚[14]。有關(guān)LncRNA RUNX1-IT1在腫瘤中的相關(guān)研究報(bào)道不多，并且研究結(jié)論存在不一致情況。lncRNARUNX1-IT1在子宮內(nèi)膜癌中表達(dá)下調(diào)，并通過(guò)抑制miR-21表達(dá)來(lái)抑制癌細(xì)胞的增殖[15]。過(guò)表達(dá)lncRNA RUNX1-IT1可顯著抑制肺癌細(xì)胞增殖、克隆形成和侵襲能力，而lncRNA RUNX1-IT1的敲除則產(chǎn)生相反的效果[16]。Shi等[7]研究顯示lncRNA RUNX1-IT1在結(jié)直腸癌組織和細(xì)胞系中表達(dá)均下調(diào)，過(guò)表達(dá)lncRNA RUNX1-IT1可抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖和遷移能力，而敲除lncRNA RUNX1-IT1則反之。LncRNA RUNX1-IT1在肝細(xì)胞癌組織中表達(dá)降低，并與臨床病理特征和不良預(yù)后相關(guān)。機(jī)制研究表明RUNX1-IT1直接與miR-632結(jié)合，并作為競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)源性RNA促進(jìn)miR-632靶基因GSK-3β的表達(dá)，調(diào)控WNT/β-catenin，進(jìn)而抑制肝癌細(xì)胞的生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移和干細(xì)胞樣特征[17]。Yan等[18]研究也發(fā)現(xiàn)肝癌組織中l(wèi)ncRNA RUNX1-IT1的表達(dá)水平顯著降低。過(guò)表達(dá)lncRNA RUNX1-IT1可顯著抑制肝癌細(xì)胞的增殖并誘導(dǎo)其凋亡。然而，與上述結(jié)論截然相反的是，Wu等[19]研究證實(shí)RUNX1-IT1在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤組織中表達(dá)上調(diào)，過(guò)表達(dá)RUNX1-IT1可明顯上調(diào)細(xì)胞周期蛋白D1的表達(dá)，并促進(jìn)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的增殖。本研究結(jié)果表明lncRNA RUNX1-IT1在結(jié)直腸癌組織及細(xì)胞中低表達(dá)，過(guò)表達(dá)lncRNA RUNX1-IT1可抑制SW480細(xì)胞侵襲和遷移能力，與Shi等[7]的結(jié)論相一致。說(shuō)明lncRNA RUNX1-IT1在結(jié)直腸癌的進(jìn)展過(guò)程中發(fā)揮癌基因功能。

較多研究證實(shí)miR-21在多種實(shí)體腫瘤中表達(dá)異常，是一個(gè)潛在的腫瘤治療靶點(diǎn)和早期標(biāo)志物[20]。miR-21在宮頸癌組織和血清樣本中表達(dá)上調(diào)，而組織金屬蛋白酶抑制因子3(Tissue metalloproteinase inhibitor 3，TIMP3)在宮頸癌組織中表達(dá)下調(diào)；miR-21通過(guò)靶向TIMP3促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力[21]。miR-21在胃癌中表達(dá)明顯上調(diào)，與患者臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，可能是胃癌的預(yù)后標(biāo)志物[22]。miR-21在非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)中高表達(dá)，干擾miR-21表達(dá)可抑制細(xì)胞周期蛋白D1和E1的表達(dá)，并協(xié)同抑制癌細(xì)胞的增殖能力，且miR-21通過(guò)PTEN/Akt/GSK-3β信號(hào)通路中的關(guān)鍵分子來(lái)調(diào)控NSCLC增殖[23]。本研究結(jié)果表明，miR-21在結(jié)直腸癌組織及細(xì)胞中表達(dá)均明顯升高，抑制miR-21表達(dá)可抑制SW480細(xì)胞的侵襲和遷移能力；通過(guò)生物信息學(xué)分析和雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)lncRNA RUNX1-IT1和miR-21存在靶向結(jié)合位點(diǎn)。由此我們推測(cè)，lncRNA RUNX1-IT1可能作為競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)源RNA(competing endogenous RNA，ceRNA)吸附靶向調(diào)控miR-21表達(dá)，進(jìn)而影響結(jié)直腸癌的侵襲和遷移。并且在進(jìn)一步的回復(fù)實(shí)驗(yàn)中驗(yàn)證了這一猜想，在lncRNA RUNX1-IT1過(guò)表達(dá)同時(shí)上調(diào)miR-21的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)上調(diào)miR-21表達(dá)可逆轉(zhuǎn)過(guò)表達(dá)lncRNA RUNX1-IT1對(duì)SW480細(xì)胞侵襲和遷移的抑制作用。

綜上所述，lncRNA RUNX1-IT1在結(jié)直腸癌組織和細(xì)胞系中表達(dá)下調(diào)，lncRNA RUNX1-IT1低表達(dá)通過(guò)靶向上調(diào)miR-21表達(dá)調(diào)控SW480細(xì)胞侵襲和遷移，這意味著lncRNA RUNX1-IT1有可能成為結(jié)直腸癌的分子治療靶點(diǎn)，其在體內(nèi)的具體作用及分子機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。