張海智，溫曉芬，黃彬亮，林 慧，薛文武，曾 德，林丹霞，*

(1．高州市人民醫(yī)院腫瘤內(nèi)科一區(qū)，廣東 茂名 525000；2．汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬腫瘤醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，廣東 汕頭515041)

乳腺癌是影響女性健康最常見的惡性腫瘤，2020年全球有約226萬新增確診女性乳腺癌患者，發(fā)病人數(shù)超越肺癌成為第一，它是癌癥死亡的主要原因之一[1]。在我國，乳腺癌發(fā)病率也處于女性惡性腫瘤的第1位，且近年來迅速上升[2-3]。目前乳腺癌的預(yù)后監(jiān)測方式與治療靶點仍較局限，臨床上廣泛應(yīng)用的有CA153、CEA、CA125等腫瘤標(biāo)志物，這些腫瘤標(biāo)志物在乳腺癌患者中的預(yù)后價值較為肯定，但其敏感性與特異性仍有爭議[4-5]。有研究分析了癌癥基因組圖譜(The Cancer Genome Atlas，TCGA)數(shù)據(jù)庫中730例乳腺癌組織和82例癌旁組織的數(shù)據(jù)，通過建立癌癥基因組學(xué)數(shù)據(jù)的概率整合(Probabilistic Integration of Cancer Genomics Data，PINCAGE)模型分析，發(fā)現(xiàn)溶質(zhì)載體超家族50蛋白成員1(solute carrier family 50 member 1，SLC50A1)基因在乳腺癌組織與癌旁正常組織中的表達(dá)水平具有顯著差異[6]。后來Wang等[7]對血液SLC50A1蛋白濃度的研究發(fā)現(xiàn)，乳腺癌患者的血清中SLC50A1蛋白含量明顯升高，SLC50A1水平升高的特異性為100%，敏感性為75.3%，ROC曲線下面積為0.915(P＜0.01)。為進(jìn)一步了解SLC50A1在早期及晚期乳腺癌患者中的預(yù)后價值，本研究通過動態(tài)檢測早期和晚期乳腺癌患者的SLC50A1水平，為SLC50A1蛋白在乳腺癌的預(yù)后監(jiān)測、療效評估以及治療等方面的應(yīng)用作初步探索。

1 材料與方法

1.1 研究對象

選取2019年6月8日—2020年3月18日汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬腫瘤醫(yī)院新收治的病理確診為乳腺癌的患者39例；其中26例為晚期乳腺癌，13例為早期乳腺癌，記錄患者臨床信息，對周期性返院行抗腫瘤治療的晚期乳腺癌患者進(jìn)行動態(tài)記錄及電話隨訪，隨訪時間截止至2021年4月1日，隨訪結(jié)果：死亡5例(12.8%)，存 活34例(87.2%)，復(fù) 發(fā) 或 進(jìn) 展25例(64.1%)，隨訪率100%。入組的乳腺癌患者均為浸潤性導(dǎo)管癌，其中早期乳腺癌患者均通過手術(shù)切除腫瘤病理確診；入組標(biāo)準(zhǔn)主要包括留取血漿樣本期間患者無感染征象、無合并其他原發(fā)惡性腫瘤、預(yù)計生存期大于3個月的患者。本研究入組的39例乳腺癌患者臨床特征數(shù)據(jù)見表1。

1.2 研究方法

經(jīng)本院倫理委員會審批及患者知情同意，收集患者治療前空腹時的外周靜脈血10 mL，棄去前1 mL，標(biāo)本存于EDTA管中，使用離心機(jī)600 g離心5 min，取上清液分裝置于-80℃保存?zhèn)溆谩Ｊ褂妹嘎?lián)免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)對患者血漿SLC50A1蛋白進(jìn)行定量測定，ELISA試劑盒購自Andy Gene Biotechnology公司，該試劑盒應(yīng)用雙抗體夾心法測定SLC50A1水平，用純化的人SLC50A1抗體包被微孔板，制成固相抗體，往包被單抗的微孔中依次加入血漿樣本，每個樣本作復(fù)孔3個，形成抗體-抗原-酶標(biāo)抗體復(fù)合物，經(jīng)過徹底洗滌后加入底物顯色。用酶標(biāo)儀在450 nm波長下測定吸光度，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計算血漿中SLC50A1含量。本試驗測定過程遵循試劑盒說明書操作步驟要求，記錄測定結(jié)果用于后續(xù)統(tǒng)計學(xué)分析。

從基因組數(shù)據(jù)共享(genomic data commons，GDC)官網(wǎng)下載TCGA數(shù)據(jù)庫截至2021年4月25日更新的1 109例浸潤性乳腺癌和113例癌旁組織的mRNA數(shù)據(jù)，使用Activeperl 5.26軟件進(jìn)行識別并轉(zhuǎn)換成矩陣數(shù)據(jù)，R3.6.2軟件提取其中SLC50A1基因表達(dá)數(shù)據(jù)后，采用Wilcoxon秩和檢驗進(jìn)行差異分析。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

使用SPSS 26.0軟件對入組患者的臨床數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，采用非參數(shù)檢驗中的Mann-WhitneyU檢驗及配對樣本的Wilcoxon符號秩檢驗對SLC50A1濃度進(jìn)行不同分組間的差異性分析。采用線性相關(guān)分析SLC50A1水平與CA153、CEA水平的相關(guān)性后，進(jìn)一步使用Kendall’s tau-b作相關(guān)性分析。預(yù)后分析主要采用無病生存期(disease free survival，DFS)時間繪制Kaplan-Meier曲線，并參考各單因素的log-rank檢驗結(jié)果與P值，篩選有統(tǒng)計學(xué)意義的變量進(jìn)行多因素Cox回歸比例風(fēng)險模型分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 乳腺癌患者血漿中SLC50A1蛋白水平的差異

經(jīng)正態(tài)性檢驗，本研究入組患者的SLC50A1濃度水平不服從正態(tài)分布，根據(jù)患者的臨床特征分組，使用Mann-WhitneyU檢驗作差異性分析，結(jié)果如表1所示，SLC50A1蛋白水平在乳腺癌雌激素(ER)高表達(dá)(≥10%)與低表達(dá)(＜10%)、早期(M0)與晚期組(M1)、Ki67高表達(dá)(≥15%)與低表達(dá)組(＜15%)間的差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，其中早期乳腺癌患者，ER高表達(dá)患者和Ki67低表達(dá)患者的SLC50A1水平較低，預(yù)后較好。SLC50A1濃度在不同年齡組、孕激素(PR)高表達(dá)與低表達(dá)組、不同腫瘤家族史組、不同母乳喂養(yǎng)時長組、人表皮生長因子受體2(Her-2)陽性與陰性組間的差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。

表1 不同臨床特征組的乳腺癌患者血漿中的SLC50A1蛋白水平

使用Recist 1.1實體瘤療效評估標(biāo)準(zhǔn)對晚期乳腺癌患者隨診期間(25人次，有患者未返院隨訪)的血漿SLC50A1蛋白濃度進(jìn)行分組，復(fù)診期間療效評估結(jié)果符合疾病穩(wěn)定(stable disease，SD)組共17人次、符合疾病進(jìn)展(progressive disesse，PD)組共6人次、符合部分緩解(partial response，PR)組2人次，因僅有2人次療效評估符合PR標(biāo)準(zhǔn)，故僅分析了SD組及PD組情況。采用配對樣本的Wilcoxon符號秩檢驗對不同組治療前、后的SLC50A1蛋白水平進(jìn)行差異性分析。結(jié)果提示，SD組治療前及治療后的SLC50A1水平中位數(shù)分別為253.04和275.07 pg/mL，差值的中位數(shù)為21.42 pg/mL，Wilcoxon符號秩檢驗顯示，Z=-1.491，P=0.136，說明晚期乳腺癌患者抗腫瘤治療后的療效評估為SD時，SLC50A1水平變化不明顯(圖1A)。PD組治療前及治療后的SLC50A1水平中位數(shù)分別為220.29和267.11 pg/mL，差 值 的 中 位 數(shù) 為10.83 pg/mL，Wilcoxon符號秩檢驗顯示，Z=-1.153，P=0.249，說明晚期乳腺癌患者抗腫瘤治療后的療效評估為PD時，SLC50A1水平變化差異無統(tǒng)計學(xué)意義(圖1B)。

圖1 晚期乳腺癌患者疾病穩(wěn)定組和疾病進(jìn)展組治療前后SLC50A1水平變化

2.2 SLC50A1水平與腫瘤標(biāo)志物的相關(guān)性分析

首先對相關(guān)分析的配對指標(biāo)(SLC50A1與CA153、SLC50A1與CEA、SLC50A1與CA125)進(jìn)行雙變量正態(tài)分布檢驗，結(jié)果提示均不符合雙變量正態(tài)分布；通過繪制散點圖發(fā)現(xiàn)SLC50A1水平與CA153、CA125、CEA水平無顯著單調(diào)線性相關(guān)關(guān)系，使用Kendall’s tau-b相關(guān)分析對上述配對的指標(biāo)進(jìn)行分析，結(jié)果如表2所示，在上述相關(guān)性分析的因素中，SLC50A1水平與CA153濃度存在較弱的正相關(guān)關(guān)系。

表2 SLC50A1水平與CA153、CEA、CA125的相關(guān)性分析

2.3 影響乳腺癌預(yù)后的多因素Cox回歸分析

使用患者的一般臨床特征(包括SLC50A1水平、年齡、腫瘤分期、ER、PR、Her-2、Ki67、哺乳史)繪制Kaplan-Meier曲線并進(jìn)行l(wèi)og-rank檢驗，篩選出單因素分析有統(tǒng)計學(xué)意義的變量為SLC50A1水平、Ki67(P＜0.05)，對這兩個變量進(jìn)一步作多因素Cox回歸分析，結(jié)果顯示，SLC50A1水平、Ki67指標(biāo)是影響乳腺癌預(yù)后的獨立因素(P＜0.05)，與血漿SLC50A1水平升高組相比，低SLC50A1水平組的術(shù)后復(fù)發(fā)或進(jìn)展的風(fēng)險 降 低[HR=0.385，95%CI(0.163，0.912)，P=0.03]；與免疫組化結(jié)果的Ki67低表達(dá)組(Ki67＜15%)相比，高Ki67表達(dá)組的術(shù)后復(fù)發(fā)或進(jìn)展的風(fēng)險升高[HR=2.918，95%CI(1.023，8.324)，P=0.045]，提示Ki67預(yù)后預(yù)測價值與SLC50A1一致。

2.4 TCGA數(shù)據(jù)庫的SLC50A1表達(dá)數(shù)據(jù)分析

為了解大樣本數(shù)據(jù)關(guān)于SLC50A1表達(dá)的情況，對相關(guān)數(shù)據(jù)庫收錄的乳腺癌數(shù)據(jù)下載并分析。因目前尚無公開的血漿SLC50A1蛋白濃度的數(shù)據(jù)庫信息，選擇TCGA數(shù)據(jù)庫(https://portal.gdc.cancer.gov/)中的mRNA數(shù)據(jù)分析作參考。從TCGA數(shù)據(jù)庫(https://portal.gdc.cancer.gov/)下載截至2021年4月25日更新的1 109例浸潤性乳腺癌和113例癌旁組織的SLC50A1基因表達(dá)量數(shù)據(jù)，采用Wilcoxon秩和檢驗作差異性分析結(jié)果如圖2所示，乳腺癌組織中SLC50A1表達(dá)量較癌旁正常組織明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。

圖2 癌旁正常組織與乳腺癌組織SLC50A1表達(dá)的差異分析

3 討論

乳腺癌已成為女性最常見的惡性腫瘤，且發(fā)病率仍在不斷上升，對女性健康威脅極大[8]，目前臨床上用于乳腺癌隨訪的檢查仍以影像學(xué)檢查為主，相對而言通過血液中的腫瘤標(biāo)志物檢測隨訪與指導(dǎo)治療具有更高的可及性。乳腺癌的腫瘤標(biāo)志物主要包括CA153、CA125、CEA，它們主要用于晚期乳腺癌的預(yù)后判斷[9]。癌細(xì)胞的活動與增殖離不開糖的轉(zhuǎn)運與代謝，有薈萃分析認(rèn)為乳腺癌的預(yù)后與糖代謝異常密切相關(guān)[10]，糖的轉(zhuǎn)運代謝有賴于細(xì)胞膜上的糖轉(zhuǎn)運蛋白來實現(xiàn)[11]。

隨著糖跨膜轉(zhuǎn)運蛋白研究的不斷深入，Chen等[12]利用HEK293T細(xì)胞的胞內(nèi)傳感器識別了在人類細(xì)胞中具有7個跨膜螺旋結(jié)構(gòu)的同系物，命名為SLC50A1，又稱SWEET1、RAG1AP1，他們的研究認(rèn)為SLC50A1蛋白在人卵母細(xì)胞中主要參與調(diào)控糖的外排，這種單向的對胞外進(jìn)行糖轉(zhuǎn)運，是目前已知的人SLC50A1蛋白的主要功能。還有學(xué)者研究認(rèn)為SLC50A1蛋白能參與特異性免疫中V(D)J重排的激活，這一激活過程涉及RAG1的特異性免疫信號傳導(dǎo)[13]，提示它與臨床上乳腺癌的免疫治療可能存在相關(guān)性。SLC50A1蛋白在糖轉(zhuǎn)運功能上跟其他糖轉(zhuǎn)運體相互配合[14]，但目前關(guān)于該蛋白的作用機(jī)制尚未明確。Wang等[7]研究認(rèn)為，在正常人的血清中也可檢測到SLC50A1的表達(dá)，但乳腺癌患者的血清中SLC50A1蛋白的含量明顯升高，若ROC曲線特異性為100%時，敏感性為75.3%，ROC曲線下面積達(dá)0.915(P＜0.01)。該研究的樣本量不大，為繼續(xù)摸索血液中SLC50A1蛋白的預(yù)后價值，我們留取了潮汕地區(qū)乳腺癌患者不同疾病狀態(tài)的血漿樣本，通過檢測發(fā)現(xiàn)晚期乳腺癌患者的SLC50A1蛋白濃度為(215.07±115.65)pg/mL，早期乳腺癌患者為(161.1±91.05)pg/mL，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。且SLC50A1水平在ER、Ki67表達(dá)不同的分組中也具有統(tǒng)計學(xué)差異，反映出SLC50A1水平與ER之間存在關(guān)聯(lián)性，這些結(jié)果與Wang等[7]的研究結(jié)果具有一致性。不同的是，我們的研究側(cè)重于探索SLC50A1的預(yù)后價值，通過動態(tài)隨訪、監(jiān)測同一患者不同治療反應(yīng)狀態(tài)下的SLC50A1濃度來研究它與臨床指標(biāo)的關(guān)聯(lián)。對于SLC50A1蛋白的檢測研究目前還處于探索階段，選擇血清與血漿尚無定論，早期的研究報道認(rèn)為，血漿與血清相比，血漿檢測更能代表患者的疾病狀態(tài)[15]。為避免SLC50A1蛋白在血液的凝血過程中發(fā)生的相關(guān)反應(yīng)干擾檢測結(jié)果[16]，故我們留取患者血漿進(jìn)行檢測。通過對入組患者動態(tài)復(fù)查的CA153、CA125、CEA水平與相應(yīng)時期SLC50A1水平進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果表明SLC50A1水平與CA153濃度存在一定的正相關(guān)關(guān)系(Kendall’s tau-b=0.257，P=0.004)。將入組的晚期乳腺癌患者血漿SLC50A1水平根據(jù)每次返院治療期間的療效評估結(jié)果進(jìn)行分組，由于樣本量不大，晚期乳腺癌治療后療效評估為PR組的僅2人次，我們將SD組、PD組的數(shù)據(jù)進(jìn)行治療前后的差異性分析。結(jié)果顯示，晚期乳腺癌患者抗腫瘤治療后的療效評估為SD時，SLC50A1水平變化無統(tǒng)計學(xué)差異，符合SLC50A1的預(yù)后價值，但治療后的療效評估為PD時，雖中位數(shù)提示治療后PD的乳腺癌患者SLC50A1水平升高，但差異仍無統(tǒng)計學(xué)意義，可能與樣本量少有關(guān)。Cox回歸分析結(jié)果顯示，SLC50A1水平是乳腺癌患者的獨立預(yù)后因素，與SLC50A1水平升高組相比，低SLC50A1水平組的術(shù)后復(fù)發(fā)或進(jìn)展的風(fēng)險降低。進(jìn)一步表明SLC50A1水平可作為乳腺癌的預(yù)后判斷因素。我們的研究不足之處主要在于樣本量較少，且早期乳腺癌患者組僅收集了術(shù)后的血漿，有待后續(xù)的研究進(jìn)一步完善。

另外，通過TCGA數(shù)據(jù)庫的大樣本數(shù)據(jù)分析表明，該基因在乳腺癌組織中的表達(dá)量明顯高于正常的癌旁組織(P＜0.01)，提示了以SLC50A1作為靶點的靶向治療對癌細(xì)胞可能具有更高的選擇性。目前也有研究發(fā)現(xiàn)SLC50A1基因與Abelson鼠白血病病毒致癌基因同源物1(ALB1)基因共突變的乳腺癌患者的總生存期相對延長，并認(rèn)為這種突變類型的乳腺癌患者對博舒替尼的敏感性增高相關(guān)[17]。惡性腫瘤的生物標(biāo)志物從研究到應(yīng)用經(jīng)歷了大量的研究試驗，這個過程中也有一部分生物標(biāo)志物在藥物精準(zhǔn)治療方面作出了重要貢獻(xiàn)，糖轉(zhuǎn)運體作為近年的研究熱點，為了限制癌細(xì)胞的糖酵解，已先后開發(fā)了很多以糖轉(zhuǎn)運體或代謝酶為作用靶點的靶向藥物[18-19]，以SLC50A1作為治療靶點值得進(jìn)一步探索。

綜上所述，本研究探索了SLC50A1表達(dá)水平在乳腺癌中的預(yù)后價值，初步分析認(rèn)為SLC50A1是乳腺癌的獨立預(yù)后指標(biāo)，SLC50A1表達(dá)水平升高提示乳腺癌患者的預(yù)后不良。雖然本研究的樣本量較少，通過下載TCGA數(shù)據(jù)庫的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析驗證，已初步表明了我們的研究結(jié)果與大樣本檢測結(jié)果的一致性。以SLC50A1為作用靶點的靶向藥物能否為乳腺癌患者帶來新的選擇，有待進(jìn)一步的作用機(jī)制研究與臨床試驗探索。