孫令驍，劉香東，劉增祥，王鸞鸞，朱福余，孫曉霞，劉成虎*

(山東省醫(yī)療器械和藥品包裝檢驗(yàn)研究院，國(guó)家藥品監(jiān)督管理局生物材料器械安全性評(píng)價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東省醫(yī)療器械生物學(xué)評(píng)價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 濟(jì)南250101)

體內(nèi)堿性彗星試驗(yàn)是一項(xiàng)直接檢測(cè)核DNA損傷的敏感試驗(yàn)方法，可以在強(qiáng)堿性條件下(pH≥13)檢測(cè)DNA單鏈和雙鏈的斷裂。由于體內(nèi)堿性彗星試驗(yàn)可以檢測(cè)單細(xì)胞水平的DNA損傷，因此具有很高的靈敏度，而且該方法所需的樣本量少、操作簡(jiǎn)便，在食品、藥品和化學(xué)品的遺傳毒性檢測(cè)中均有廣泛的應(yīng)用，2014年經(jīng)濟(jì)合作與發(fā)展組織(Organization for Economic Co-operation and Development，OECD)發(fā)表了針對(duì)化學(xué)品進(jìn)行體內(nèi)堿性彗星試驗(yàn)的指導(dǎo)原則，但是目前國(guó)內(nèi)尚無(wú)針對(duì)醫(yī)療器械及其材料進(jìn)行體內(nèi)堿性彗星試驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)方法。

本研究結(jié)合醫(yī)療器械臨床使用的特性，采用0.9%氯化鈉注射液(0.9% sodium chloride injection，SC)和棉籽油(cottonseed oil，CSO)兩種介質(zhì)制備聚醚醚酮(polyether ether ketone，PEEK)材料的極性和非極性試驗(yàn)液，分別采用靜脈和腹腔注射對(duì)受試動(dòng)物進(jìn)行染毒，參考《OECD化學(xué)品測(cè)試指南489：體內(nèi)堿性彗星試驗(yàn)》對(duì)兩種PEEK材料試驗(yàn)液的遺傳毒性進(jìn)行初步評(píng)價(jià)，為醫(yī)療器械及其材料遺傳毒性體內(nèi)堿性彗星試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)化的建立提供可靠的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物

SPF級(jí)健康SD大鼠70只，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(京)2016-00060。大鼠10～13周齡，雌雄各半，在20～26℃，濕度40%～70%，控制循環(huán)燈光(12 h亮，12 h暗)的屏障環(huán)境[許可證號(hào)：SYXK(魯)20190013]下采用大鼠飼料[購(gòu)自北京科澳協(xié)力飼料有限公司，許可證號(hào)：SCXK(京)2019-0003]按性別分籠群飼，每籠5只，自由飲水和攝食。

1.2 主要試劑和儀器

PEEK材料A(適用于加工齒科種植體等醫(yī)療器械，批號(hào)R202001)，PEEK材料B(適用于加工椎間融合器等醫(yī)療器械，批號(hào)21060202)；0.9%氯化鈉注射液(辰欣藥業(yè)股份有限公司)；棉籽油(河北百靈威超精細(xì)材料有限公司)；甲基磺酸甲酯(methyl methanesulfonate，MMS，Sigma)；彗星試驗(yàn)試劑盒(英國(guó)Abcam公司，型號(hào)ab238544)；PBS(不含Ca2+、Mg2+和酚紅，Sigma)；無(wú)水乙醇(分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；10%磷酸鹽緩沖中性福爾馬林固定液(濟(jì)南百博生物技術(shù)股份有限公司)；Labtub真空采血管(0.109 mol/L檸檬酸鈉溶液，力因精準(zhǔn)醫(yī)療產(chǎn)品有限公司)。

壓力蒸汽滅菌器(德國(guó)Systec公司，型號(hào)VE-75)；電子天平(瑞士梅特勒-托利多公司，型號(hào)XPE105)；水平電泳槽、電泳儀(美國(guó)Bio-Rad公司，型號(hào)Power Pac)；倒置熒光顯微鏡(日本Olympus公司，型號(hào)IX73)；離心機(jī)(德國(guó)Sigma公司，型號(hào)1-14)；恒溫水浴鍋(常州國(guó)華電器有限公司，型號(hào)HH-1)；制冰機(jī)(日本Sanyo公司，型號(hào)SIM-F140AY65)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 試驗(yàn)液和對(duì)照溶液制備[1]參考GB/T 16886.12規(guī)定，基于0.2 g/mL的比例，將兩種PEEK材料分別置于SC和CSO中，于(121±2)℃浸提(1.0±0.1)h，取浸提液作為試驗(yàn)液。陰性對(duì)照為不含試驗(yàn)樣品的SC和CSO，同法制備。試驗(yàn)液在制備后立即使用，以防止吸附在浸提容器上或成分發(fā)生其他變化。陽(yáng)性對(duì)照為MMS，將MMS(1.3 g/mL)用SC稀釋至1 mg/mL，配制完成后在2 h內(nèi)使用。

1.3.2 動(dòng)物分組及處理將70只SD大鼠隨機(jī)分為7組，分別為：①SC陰性對(duì)照組；②CSO陰性對(duì)照組；③PEEK材料A生理鹽水試驗(yàn)組(PEEK SCA試驗(yàn)組)；④PEEK材料A棉籽油試驗(yàn)組(PEEK CSOA試驗(yàn)組)；⑤PEEK材料B生理鹽水試驗(yàn)組(PEEK SCB試驗(yàn)組)；⑥PEEK材料B棉籽油試驗(yàn)組(PEEK CSOB試驗(yàn)組)；⑦陽(yáng)性對(duì)照MMS組，每組10只，雌雄各半。SC陰性對(duì)照組、PEEK SC試驗(yàn)組和MMS組分別按照10 mL/kg的劑量由靜脈途徑染毒，CSO陰性對(duì)照組和PEEK CSO試驗(yàn)組分別按照5 mL/kg的劑量由腹腔途徑染毒。第1次染毒24 h后進(jìn)行第2次染毒，末次染毒3 h后取材。

動(dòng)物一般觀察：分別在第1次染毒前一天、第1次染毒和第2次染毒后對(duì)所有動(dòng)物稱體質(zhì)量，并在染毒期間每天對(duì)所有動(dòng)物進(jìn)行兩次觀察，包括動(dòng)物是否死亡、皮膚與被毛、眼與黏膜的改變，以及呼吸、循環(huán)、自主和中樞神經(jīng)系統(tǒng)、軀體運(yùn)動(dòng)神經(jīng)活動(dòng)性和行為模式等狀況[2]。

1.3.3標(biāo)本制備將動(dòng)物處死后從腹主動(dòng)脈采血1 mL，轉(zhuǎn)移入采血管內(nèi)反轉(zhuǎn)振搖數(shù)次，迅速摘取大鼠肝臟和腎臟，稱取質(zhì)量后分別剪下肝臟和腎臟的一小塊組織，每只動(dòng)物剪下的組織塊大小應(yīng)盡量一致，將剪下的組織塊放入提前預(yù)冷的PBS(不含Ca2+、Mg2+和酚紅)中充分清洗以清除殘留的血液。清洗干凈的肝臟和腎臟組織塊放入5 mL預(yù)冷的PBS中，使用眼科剪將組織塊盡量剪碎以釋放細(xì)胞，放置5 min后去掉組織碎片進(jìn)行離心，離心后收集細(xì)胞。制備肝臟、腎臟和外周血的單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×105個(gè)/mL，將單細(xì)胞懸液置于冰上保存待用[3-4]。

另取一部分肝臟和腎臟組織置于固定液中用于組織病理學(xué)分析。

1.3.4 制片、裂解、解旋與電泳單細(xì)胞懸液制備后在低溫條件下1 h內(nèi)完成制片。取潔凈載玻片，在磨砂面一側(cè)滴加75 μL瓊脂糖，常規(guī)涂片，在4℃環(huán)境下放置15 min凝固后備用。將單細(xì)胞懸液與瓊脂糖按1∶10(V/V)比例混勻，在制備好的瓊脂糖凝膠層上滴加75 μL細(xì)胞與瓊脂糖的混合液，在4℃環(huán)境下避光放置15 min，每個(gè)樣本制備3張玻片備用。

根據(jù)彗星試驗(yàn)試劑盒的操作說(shuō)明，將玻片浸沒(méi)于預(yù)冷的裂解液，在4℃環(huán)境下避光作用至少1 h后使用PBS漂洗玻片2次，每次2 min，除去殘留的洗滌劑和鹽類物質(zhì)。漂洗后將玻片浸沒(méi)于預(yù)冷的電泳緩沖液(pH≥13)，置于冰上避光解旋30 min，將玻片轉(zhuǎn)移到置于冰上的水平電泳槽中，緩緩加入預(yù)冷的新鮮配制的電泳緩沖液，采用電勢(shì)1 V/cm、啟動(dòng)電流300 mA、電泳時(shí)間為20 min的電泳條件進(jìn)行避光電泳。電泳結(jié)束后用預(yù)冷的純水漂洗玻片2次，每次2 min，將玻片放入預(yù)冷的70%乙醇中固定5 min，空氣中自然干燥。

1.3.5 染色、閱片與數(shù)據(jù)處理每張玻片加入試劑盒提供的DNA鏈熒光染料100 μL，室溫孵育15 min，在倒置熒光顯微鏡下用適當(dāng)?shù)姆糯蟊稊?shù)(100倍或200倍)觀察玻片。DNA結(jié)合熒光染料后受到激發(fā)產(chǎn)生綠色熒光，未受損的DNA電泳時(shí)無(wú)法遷移太遠(yuǎn)從而留在細(xì)胞核中，而損傷的DNA片段會(huì)在電場(chǎng)作用下從細(xì)胞核中遷出形成可視的彗星尾形狀。在熒光顯微鏡下可以觀察到DNA片段從細(xì)胞的“彗頭”移到“彗尾”，“彗頭”為圓形光斑，邊緣整齊，“彗尾”呈散點(diǎn)狀拖尾。彗星顯微圖像中的細(xì)胞可分為3類，可評(píng)分細(xì)胞(細(xì)胞的“彗頭”、“彗尾”輪廓清晰，且未受鄰近細(xì)胞干擾)、不可評(píng)分細(xì)胞(細(xì)胞的“彗頭”、“彗尾”不清晰或重疊的細(xì)胞等)和“刺猬”狀細(xì)胞(顯微圖像下由小或不存在的頭部以及大的彌漫性尾部組成的細(xì)胞)[5]。選擇玻片中間位置且密度適中的區(qū)域進(jìn)行閱片，確保細(xì)胞無(wú)重疊，避免在玻片的邊緣進(jìn)行閱片。

采用OpenComet軟件分析細(xì)胞圖像[6]，以尾部DNA百分比、尾矩和Olive尾矩作為分析指標(biāo)衡量DNA的損傷程度，每個(gè)樣本對(duì)150個(gè)可評(píng)分細(xì)胞進(jìn)行分析，計(jì)算每個(gè)樣本每張玻片可評(píng)分細(xì)胞尾部DNA百分比、尾矩和Olive尾矩中位數(shù)的平均數(shù)，得出每個(gè)樣本可評(píng)分細(xì)胞的尾部DNA百分比、尾矩和Olive尾矩，每個(gè)樣本計(jì)數(shù)150個(gè)細(xì)胞來(lái)單獨(dú)記錄“刺猬”狀細(xì)胞的發(fā)生頻率。計(jì)算每只大鼠肝臟和腎臟的質(zhì)量與體質(zhì)量之比作為肝臟系數(shù)和腎臟系數(shù)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，試驗(yàn)結(jié)果用xˉ±s表示，對(duì)每個(gè)樣本可評(píng)分細(xì)胞的尾部DNA百分比、尾矩、Olive尾矩和“刺猬”狀細(xì)胞發(fā)生頻率進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，如果P＜0.05則認(rèn)為兩組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PEEK的全身毒性

2.1.1 大鼠的臨床觀察和體質(zhì)量變化在研究過(guò)程中，各試驗(yàn)組和對(duì)照組的大鼠均未見(jiàn)死亡和明顯的異常癥狀，所有動(dòng)物體質(zhì)量均有增加。各試驗(yàn)組、陽(yáng)性對(duì)照組大鼠的平均體質(zhì)量分別和SC、CSO陰性對(duì)照組相比差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

2.1.2 大鼠肝臟系數(shù)、腎臟系數(shù)和病理學(xué)檢查各試驗(yàn)組和陽(yáng)性對(duì)照組的大鼠肝臟系數(shù)、腎臟系數(shù)與SC和CSO陰性對(duì)照組相比差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，結(jié)果見(jiàn)表1。所有大鼠的肝臟和腎臟均未見(jiàn)肉眼可見(jiàn)的大體病理學(xué)改變，組織病理學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)各組大鼠的肝細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)正常，未見(jiàn)肝細(xì)胞腫脹，肝細(xì)胞間界線清晰，肝細(xì)胞核未見(jiàn)固縮、溶解、消失，未見(jiàn)肝細(xì)胞變性壞死，肝鎖排列整齊呈條索狀，間質(zhì)未見(jiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，未見(jiàn)肝血竇擴(kuò)張，肝被膜未見(jiàn)增厚，各組大鼠的腎小球形態(tài)結(jié)構(gòu)正常，系膜細(xì)胞未見(jiàn)增生，未見(jiàn)基底膜增厚，腎小管上皮細(xì)胞未見(jiàn)變性、壞死，腎小管未見(jiàn)擴(kuò)張，管腔內(nèi)未見(jiàn)蛋白管型等病變，間質(zhì)未見(jiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)和纖維組織增生，腎臟被膜未見(jiàn)增厚，各組大鼠的肝臟和腎臟未見(jiàn)明顯的組織病理學(xué)改變，結(jié)果見(jiàn)圖1和圖2。

表1 連續(xù)染毒2 d后各組大鼠肝臟系數(shù)和腎臟系數(shù)(%，±s，n=5)

表1 連續(xù)染毒2 d后各組大鼠肝臟系數(shù)和腎臟系數(shù)(%，±s，n=5)

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圖1 各組大鼠肝臟組織病理檢查結(jié)果(HE染色)

圖2 各組大鼠腎臟組織病理檢查結(jié)果(HE染色)

2.2 體內(nèi)堿性彗星試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 彗星顯微圖像觀察結(jié)果圖3～圖5是大鼠肝細(xì)胞、腎細(xì)胞和外周血淋巴細(xì)胞的彗星顯微圖像，分別從SC陰性對(duì)照組、PEEK SCA試驗(yàn)組、PEEK SCB試驗(yàn)組和MMS陽(yáng)性對(duì)照組的肝細(xì)胞、腎細(xì)胞和外周血淋巴細(xì)胞中各選擇一張圖片進(jìn)行比較。與SC陰性對(duì)照組相比，MMS陽(yáng)性對(duì)照組細(xì)胞出現(xiàn)明顯的拖尾現(xiàn)象，表明細(xì)胞產(chǎn)生較多的受損DNA片段，“刺猬”狀細(xì)胞數(shù)量明顯增多，各試驗(yàn)組肝細(xì)胞、腎細(xì)胞和外周血淋巴細(xì)胞未出現(xiàn)明顯的拖尾現(xiàn)象。

圖3 大鼠肝細(xì)胞彗星顯微圖像觀察結(jié)果

圖4 大鼠腎細(xì)胞彗星顯微圖像觀察結(jié)果

圖5 大鼠外周血淋巴細(xì)胞彗星顯微圖像觀察結(jié)果

2.2.2 細(xì)胞尾部DNA百分比、尾矩和Olive尾矩分析結(jié)果與SC陰性對(duì)照組相比，MMS陽(yáng)性對(duì)照組大鼠的肝、腎和外周血的細(xì)胞尾部DNA百分比值、尾矩和Olive尾矩明顯升高，與SC陰性對(duì)照組間的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。兩種PEEK試驗(yàn)組大鼠的肝、腎、外周血的尾部DNA含量百分比值、尾矩、Olive尾矩和“刺猬”狀細(xì)胞發(fā)生頻率分別與SC和CSO陰性對(duì)照組相比，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，見(jiàn)表2～表4。結(jié)果表明在本研究體系中兩種PEEK材料的試驗(yàn)液未誘導(dǎo)SD大鼠肝臟組織細(xì)胞DNA鏈斷裂。

表2 各組大鼠肝細(xì)胞體內(nèi)堿性彗星試驗(yàn)分析結(jié)果(±s，n=10)

表2 各組大鼠肝細(xì)胞體內(nèi)堿性彗星試驗(yàn)分析結(jié)果(±s，n=10)

與陰性對(duì)照組比較，*P＜0.05.

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表3 各組大鼠腎細(xì)胞體內(nèi)堿性彗星試驗(yàn)分析結(jié)果(±s，n=10)

表3 各組大鼠腎細(xì)胞體內(nèi)堿性彗星試驗(yàn)分析結(jié)果(±s，n=10)

與陰性對(duì)照組比較，*P＜0.05.

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表4 各組大鼠外周血淋巴細(xì)胞體內(nèi)堿性彗星試驗(yàn)分析結(jié)果(±s，n=10)

表4 各組大鼠外周血淋巴細(xì)胞體內(nèi)堿性彗星試驗(yàn)分析結(jié)果(±s，n=10)

與陰性對(duì)照組比較，*P＜0.05.

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3 討論

截至2021年，我國(guó)已有八萬(wàn)八千多個(gè)國(guó)產(chǎn)醫(yī)療器械取得注冊(cè)證，其中大部分醫(yī)療器械使用時(shí)直接或間接與患者接觸并帶來(lái)一定的風(fēng)險(xiǎn)，為保證醫(yī)療器械不對(duì)患者造成生物學(xué)毒害，上市前必須開(kāi)展生物學(xué)評(píng)價(jià)。遺傳毒性是生物材料和醫(yī)療器械生物學(xué)評(píng)價(jià)的重要內(nèi)容，對(duì)評(píng)價(jià)生物材料和器械的生物安全性尤其是潛在的致癌可能性有重要意義。根據(jù)相關(guān)規(guī)定，具體的遺傳毒性試驗(yàn)方法建議按照GB/T 16886.3進(jìn)行[7-8]。

哺乳動(dòng)物體內(nèi)堿性彗星試驗(yàn)是一種體內(nèi)遺傳毒性試驗(yàn)方法，目前大部分研究均按照OECD發(fā)布的體內(nèi)堿性彗星試驗(yàn)的指導(dǎo)原則進(jìn)行，該指導(dǎo)原則是針對(duì)化學(xué)品特性制定的，試驗(yàn)介質(zhì)為極性溶劑，而醫(yī)療器械在發(fā)揮治療/輔助治療疾病的過(guò)程中，可通過(guò)多種途徑(如腸道、血液、吸入、植入、生殖器官、皮膚等)與人體接觸，單一介質(zhì)并不能反映醫(yī)療器械的臨床使用特性，同時(shí)該指導(dǎo)原則并未給出醫(yī)療器械及其材料試驗(yàn)液制備的方法，在染毒劑量等方面與醫(yī)療器械及其材料也有較大的差異，因此該指導(dǎo)原則不適宜直接用于醫(yī)療器械/材料的檢測(cè)。但是適用于醫(yī)療器械及其材料進(jìn)行遺傳毒性試驗(yàn)的GB/T 16886.3標(biāo)準(zhǔn)并未給出哺乳動(dòng)物體內(nèi)堿性彗星試驗(yàn)的詳細(xì)試驗(yàn)方法，目前國(guó)內(nèi)也沒(méi)有關(guān)于醫(yī)療器械及其材料進(jìn)行哺乳動(dòng)物體內(nèi)堿性彗星試驗(yàn)的相關(guān)文獻(xiàn)可以參考，因此本研究依據(jù)醫(yī)療器械臨床使用的特點(diǎn)，對(duì)常用的體內(nèi)堿性彗星試驗(yàn)方法進(jìn)行了改良，給出了樣品制備、試驗(yàn)液和陽(yáng)性對(duì)照物的染毒劑量等詳細(xì)的試驗(yàn)步驟，建立了適用于醫(yī)療器械及其材料的哺乳動(dòng)物體內(nèi)堿性彗星試驗(yàn)的關(guān)鍵檢測(cè)技術(shù)并獲得了相關(guān)的數(shù)據(jù)，填補(bǔ)了該方法在醫(yī)療器械及其材料檢測(cè)應(yīng)用中的空缺，為其他醫(yī)療器械及其材料進(jìn)行哺乳動(dòng)物體內(nèi)堿性彗星試驗(yàn)提供了參考依據(jù)。

聚醚醚酮(PEEK)是一種聚芳香族半結(jié)晶熱塑性高分子材料，其彈性模量與人皮質(zhì)骨的彈性模量接近，可有效降低應(yīng)力遮擋引起的骨吸收風(fēng)險(xiǎn)，是生物假體植入物的理想材料之一，被廣泛地應(yīng)用于脊柱外科、矯形外科、頜面外科等領(lǐng)域[9]。GB/T 16886.1規(guī)定對(duì)醫(yī)療器械進(jìn)行生物學(xué)評(píng)價(jià)時(shí)，與組織/骨接觸的植入類醫(yī)療器械均需要進(jìn)行遺傳毒性評(píng)價(jià)。本研究參考GB/T 16886.12的規(guī)定，選擇0.2 g/mL的浸提比例，采用極性溶劑SC和非極性溶劑CSO兩種介質(zhì)在(121±2)℃下浸提(1.0±0.1)h，取浸提液作為PEEK的試驗(yàn)液，對(duì)PEEK中是否含有潛在遺傳毒性物質(zhì)進(jìn)行了研究。

目前彗星試驗(yàn)大多采用定性分析和定量分析兩種方法進(jìn)行結(jié)果評(píng)價(jià)，本研究認(rèn)為定性分析人為干擾影響較大，可能導(dǎo)致試驗(yàn)結(jié)果不準(zhǔn)確。尾部DNA百分比、尾矩和Olive尾矩是目前比較常用的彗星試驗(yàn)的分析指標(biāo)，有研究表明這3個(gè)指標(biāo)具有良好的相關(guān)性且無(wú)顯著差異，尾矩和Olive尾矩可以將DNA損傷量和遺傳物質(zhì)在尾部的遷移距離用一個(gè)數(shù)字來(lái)表示，而同一個(gè)細(xì)胞的尾部DNA百分比在不同的彗星圖像分析軟件中的值基本相同，因此本研究決定采用定量分析的方法，以尾部DNA百分比、尾矩和Olive尾矩作為分析指標(biāo)[10-12]。由表2～表4可以看出，本研究中各組的尾部DNA百分比、尾矩和Olive尾矩均具有良好的相關(guān)性。本研究對(duì)醫(yī)療器械及其材料試驗(yàn)液的制備、陽(yáng)性對(duì)照物、染毒劑量、取材時(shí)間等關(guān)鍵變量作了明確，將SD大鼠的體質(zhì)量變化、臟器的相對(duì)質(zhì)量、臨床觀察、病理學(xué)檢查等指標(biāo)與體內(nèi)堿性彗星試驗(yàn)結(jié)果相結(jié)合，對(duì)PEEK的全身毒性和遺傳毒性進(jìn)行綜合分析，建立了適用于醫(yī)療器械及其材料哺乳動(dòng)物體內(nèi)堿性彗星試驗(yàn)的研究體系。

從彗星顯微圖像觀察結(jié)果圖3～圖5中可以看出，MMS陽(yáng)性對(duì)照組的肝臟、腎臟和外周血中均出現(xiàn)較多的“刺猬”狀細(xì)胞，大鼠肝細(xì)胞、腎細(xì)胞和外周血淋巴細(xì)胞的體內(nèi)堿性彗星試驗(yàn)分析結(jié)果也顯示MMS陽(yáng)性對(duì)照組和SC陰性對(duì)照組相比“刺猬”狀細(xì)胞的發(fā)生頻率存在顯著性差異(如表2～表4所示)?！按题睜罴?xì)胞被認(rèn)為是嚴(yán)重受損的細(xì)胞，但其成因目前尚不明確，有研究表明“刺猬”狀細(xì)胞是由可修復(fù)的DNA損傷造成的[13]，也有研究認(rèn)為“刺猬”狀細(xì)胞是由樣品相關(guān)的細(xì)胞毒性或樣品制備過(guò)程中開(kāi)始的機(jī)械/酶誘導(dǎo)損傷導(dǎo)致的[14]?？紤]到細(xì)胞毒性也可能導(dǎo)致DNA遷移程度增加，而且已知的遺傳毒性物質(zhì)也大都存在低等或中等的細(xì)胞毒性，因此本研究對(duì)所有動(dòng)物的肝臟和腎臟進(jìn)行了組織病理學(xué)檢查[15]，圖1和圖2的結(jié)果顯示陽(yáng)性對(duì)照組的肝臟和腎臟未觀察到明顯的組織病理學(xué)改變，陽(yáng)性對(duì)照組和陰性對(duì)照組相比未見(jiàn)明顯異常。本研究結(jié)果顯示所有試驗(yàn)動(dòng)物未見(jiàn)明顯的全身毒性，陽(yáng)性對(duì)照組和陰性對(duì)照組間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明試驗(yàn)體系成立。

彗星試驗(yàn)可分為中性彗星試驗(yàn)和堿性彗星試驗(yàn)，一般認(rèn)為中性彗星試驗(yàn)?zāi)軌驒z測(cè)DNA雙鏈的斷裂，而堿性彗星試驗(yàn)?zāi)軌驒z測(cè)DNA單鏈和雙鏈的斷裂以及大部分的脫嘌呤嘧啶(apurinic/apyrimidinic，AP)位點(diǎn)，因而具有更高的靈敏度。由于肝臟和腎臟是物質(zhì)在體內(nèi)代謝、吸收和排泄的主要器官，同時(shí)也是高頻致癌靶組織，而本研究采用靜脈和腹腔途徑染毒，因此將肝臟、腎臟和外周血作為靶組織。除此之外，體內(nèi)堿性彗星試驗(yàn)還可根據(jù)醫(yī)療器械/材料預(yù)期的臨床用途選擇胃、十二指腸、空腸、皮膚或膀胱等作為合適的靶器官[16-18]。

由于未檢索到兩種PEEK材料的毒代動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)，本研究采用了連續(xù)兩次染毒(間隔24 h)的染毒方法。根據(jù)OECD發(fā)布的體內(nèi)堿性彗星試驗(yàn)的指導(dǎo)原則，體內(nèi)堿性彗星試驗(yàn)的染毒時(shí)間應(yīng)根據(jù)血藥濃度達(dá)到峰值的時(shí)間來(lái)確定，因此不同醫(yī)療器械/材料的染毒時(shí)間可能會(huì)有差異，從而對(duì)試驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生影響。為滿足動(dòng)物福利要求，減少動(dòng)物使用量，體現(xiàn)“3R”原則(減少、優(yōu)化、替代)，體內(nèi)堿性彗星試驗(yàn)可與體內(nèi)微核試驗(yàn)、重復(fù)接觸全身毒性試驗(yàn)等研究進(jìn)行結(jié)合，實(shí)現(xiàn)多終點(diǎn)的檢測(cè)[19-20]。但是在與其他毒性研究結(jié)合時(shí)應(yīng)特別注意體內(nèi)彗星試驗(yàn)的取材時(shí)間，取材時(shí)間應(yīng)選在DNA鏈被誘導(dǎo)斷裂之后，且在斷裂被去除/修復(fù)之前，有研究表明一些導(dǎo)致DNA鏈斷裂的損傷持續(xù)時(shí)間可能非常短[21-23]，但大部分毒性研究的取材時(shí)間為末次染毒后24 h取材，這就導(dǎo)致體內(nèi)彗星試驗(yàn)與其他毒性研究結(jié)合時(shí)可能會(huì)漏檢此類DNA損傷，因此應(yīng)根據(jù)試驗(yàn)樣品和靶器官仔細(xì)設(shè)計(jì)體內(nèi)彗星試驗(yàn)的染毒時(shí)間和取材時(shí)間。下一步，我們將研究不同醫(yī)療器械及其材料的染毒時(shí)間對(duì)DNA損傷的影響，并通過(guò)將體內(nèi)彗星試驗(yàn)與體內(nèi)微核試驗(yàn)、重復(fù)接觸全身毒性試驗(yàn)相結(jié)合來(lái)更加科學(xué)合理地進(jìn)行醫(yī)療器械及其材料的遺傳毒性評(píng)價(jià)。

隨著“后疫情時(shí)代”的到來(lái)，生物技術(shù)與多學(xué)科交叉匯聚融合發(fā)展的態(tài)勢(shì)越來(lái)越明顯，前沿生物技術(shù)引領(lǐng)醫(yī)療器械領(lǐng)域的創(chuàng)新突破加速演進(jìn)，大批新型的生物材料和醫(yī)療器械例如動(dòng)物源性材料、可吸收/可降解材料、復(fù)合材料、3D打印生物材料、納米材料等層出不窮。某些傳統(tǒng)的生物學(xué)評(píng)價(jià)方法對(duì)這些新型材料已經(jīng)不再適用，例如由于納米材料的攝取和DNA接觸的不確定性，常用的細(xì)菌回復(fù)突變?cè)囼?yàn)就不適用于納米材料的致突變性檢測(cè)。因此迫切需要更全面、準(zhǔn)確的檢測(cè)方法來(lái)科學(xué)合理的評(píng)價(jià)醫(yī)療器械及其材料的臨床前安全性。本研究為體內(nèi)堿性彗星試驗(yàn)在醫(yī)療器械及其材料遺傳毒性評(píng)價(jià)中的應(yīng)用提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，提升了醫(yī)療器械及其材料遺傳毒性評(píng)價(jià)的研究水平，具有重要的參考價(jià)值。