黃美慧，許圳南，薛家健，杜則澎，許海雄，劉明發(fā)，*

(1．汕頭市中心醫(yī)院中心實驗室，廣東 汕頭 515031；2．汕頭市中心醫(yī)院神經(jīng)外科，廣東 汕頭515031)

惡性腫瘤的發(fā)生與發(fā)展，是多基因、多種信號通路以及細胞代謝改變等多因素共同參與導(dǎo)致的一種病理改變，死亡率較高，嚴(yán)重威脅著人民群眾的生命健康。腫瘤細胞處于快速分裂增殖過程，對于能量的需求明顯高于正常組織，因而腫瘤細胞可以通過改變自身代謝過程來適應(yīng)生存。眾所周知，一碳代謝的異?？梢詽M足腫瘤細胞對高增殖率和生存的需求[1]。一碳代謝包括葉酸循環(huán)和甲硫氨酸循環(huán)，可以產(chǎn)生一碳單位，用于核苷酸的合成、DNA甲基化反應(yīng)和還原性代謝過程。

亞甲基四氫葉酸脫氫酶2(methylenetetrahydrofolate dehydrogenase 2，MTHFD2)屬于MTHFD家族(包含MTHFD1L、MTHFD1、MTHFD2L和MTHFD2)的成員，在腹水腫瘤細胞中首次被發(fā)現(xiàn)，不同于胞質(zhì)中以煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸作為輔酶的MTHFD1，MTHFD2主要依賴于煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide，NAD+)[2]。MTHFD2由 一 個功能性前體失去合成酶的結(jié)構(gòu)域形成[3]，具有亞甲基四氫葉酸脫氫酶和甲基四氫葉酸環(huán)化水解酶的雙重酶活性，在線粒體一碳代謝途徑中，可以將亞甲基四氫葉酸氧化為10-甲酰四氫葉酸[4]。在快速增殖的細胞中，MTHFD2活性較高，與葉酸代謝等途徑中的其他分子共同表達升高，使嘌呤、三磷酸腺苷、還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH)的含量增加，從而促進細胞的快速增殖[5]。Nilsson等[6]分析了19種癌癥(共1 981例人類腫瘤樣本)的表達譜，發(fā)現(xiàn)MTHFD2是1 454種代謝酶中表達上調(diào)最為穩(wěn)定的酶，這些均提示了MTHFD2在惡性腫瘤中可能發(fā)揮重要的生物學(xué)功能。因此，本文就MTHFD2在腫瘤細胞增殖、遷移侵襲、死亡及其臨床意義等方面的相關(guān)研究進展進行綜述。

1 MTHFD2的結(jié)構(gòu)、定位及表達

人類MTHFD2(別名NMDMC)基因定位于2p13.1染色體，基因全長16 736 bp，含9個外顯子，8個內(nèi)含子。MTHFD2蛋白由350個氨基酸構(gòu)成，相對分子質(zhì)量約為37 kD。MTHFD2為二聚體結(jié)構(gòu)，其X-射線晶體結(jié)構(gòu)顯示，該蛋白由兩個長α螺旋連接兩個結(jié)構(gòu)域組成，并由一個小的D2螺旋在兩結(jié)構(gòu)域之間形成一個大縫隙，配體的結(jié)合位點則位于大縫隙中[7]。可結(jié)合的配體包括NAD+、無機磷酸鹽和LY345899。

MTHFD2主要定位在線粒體，在線粒體中發(fā)揮脫氫酶活性作用，為核苷酸合成和其他甲基化反應(yīng)提供一碳單位[8]。而Sheppard等[9]通過亞細胞分離技術(shù)發(fā)現(xiàn)，MTHFD2還可以定位在細胞核，且與DNA復(fù)制位點相同；Liu等[10]同樣證實了MTHFD2可以定位于細胞核，并參與細胞周期調(diào)控，但是對于細胞核內(nèi)MTHFD2發(fā)揮的更多潛在功能仍不清楚。

值得注意的是，MTHFD2在胚胎發(fā)育過程中表達，在大多數(shù)正常成人組織中很少或者不表達[4]，但MTHFD2在乳腺癌、肺癌、卵巢癌和結(jié)直腸癌等惡性腫瘤中較正常癌旁組織的表達均升高[11-14]，且與這些腫瘤的預(yù)后不良密切相關(guān)。Koufaris等[15]研究者利用放線菌酮處理細胞，驗證了MTHFD2的半衰期明顯低于其他一碳代謝酶；另外，MTHFD2可被生長因子誘導(dǎo)表達。所以理論上MTHFD2抑制劑的作用相比于其他一碳代謝途徑抑制劑如甲氨蝶呤(methotrexate，MTX)更具有選擇性[16]，MTHFD2可能是癌癥治療的安全靶標(biāo)[17]。

2 MTHFD2與腫瘤表型關(guān)系的研究

惡性腫瘤具有持續(xù)性增殖、異常信號通路激活、凋亡減弱、細胞能量異常、基因組不穩(wěn)定、持續(xù)的血管生成、組織的浸潤與轉(zhuǎn)移等表型特征，其中一碳代謝的異?？娠@著影響腫瘤細胞的惡性表型[1]。近年來，研究表明MTHFD2在多種腫瘤比如乳腺癌、肝癌和結(jié)直腸癌中表達上調(diào)，且在腫瘤中能夠作為獨立預(yù)后因子，與預(yù)后不良相關(guān)。此外，MTHFD2表達的缺失，可以消除腫瘤的惡性表型，如增殖、遷移、侵襲和轉(zhuǎn)移等[18]。值得探討的是，本課題組研究MTHFD2在惡性膠質(zhì)瘤中的生物學(xué)功能及機制時，發(fā)現(xiàn)MTHFD2可能與惡性膠質(zhì)瘤細胞的遷移、侵襲和增殖等生物學(xué)功能密切相關(guān)(數(shù)據(jù)待發(fā)表)。

2.1 MTHFD2與細胞增殖

腫瘤細胞的持續(xù)性增殖能力，是腫瘤惡性進展的指標(biāo)之一，臨床中常用的TNM分期中的T是指腫瘤的大小。Huang等[11]利用報告基因和集落形成等實驗技術(shù)發(fā)現(xiàn)，乳腺癌MCF-7細胞中MTHFD2顯著過表達后，蛋白激酶B(protein kinase B，PKB/AKT)活性增強進而促進MCF-7細胞的增殖和集落形成。而Lehtinen等[19]則發(fā)現(xiàn)，MTHFD2對乳腺癌MDA-MB-231細胞的增殖并不產(chǎn)生明顯影響。在結(jié)直腸癌細胞中，MTHFD2水平增加引起S期細胞比例增加，細胞增殖加快，反之則細胞增殖減慢[14]。在卵巢癌中，Li等[13]發(fā)現(xiàn)抑制MTHFD2表達導(dǎo)致細胞周期蛋白B1/細胞分裂周期基因2復(fù)合物活性降低，引起G2/M期阻滯，進而抑制細胞增殖。在非小細胞肺癌中，Yu等[12]通過生物信息學(xué)分析并證實了MTHFD2敲降后，細胞周期蛋白A2、微小染色體維持蛋白7和S期激酶相關(guān)蛋白2的表達水平下調(diào)，進而抑制細胞增殖。在鼻咽癌中，MTHFD2敲降后，明顯抑制HK1、HNE1和6-10B細胞的增殖和集落形成能力[20]。但是，MTHFD2對肝癌細胞的增殖和周期分布無顯著作用[21]。由此可見，MTHFD2對腫瘤細胞增殖能力的影響并不一致，而因腫瘤類型或細胞類型的不同而作用不同。

2.2 MTHFD2與細胞遷移和侵襲

上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)過程對于腫瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移是必不可少的[22]。多項研究表明，MTHFD2主要通過調(diào)節(jié)EMT和/或EMT相關(guān)信號通路的變化參與調(diào)控腫瘤細胞的遷移和侵襲過程。Liu等[21]的研究顯示，肝癌細胞Huh-7和HepG2中MTHFD2的表達被抑制后，上皮標(biāo)志物E-鈣黏蛋白表達水平升高，間葉標(biāo)志物N-鈣黏蛋白和波形蛋白表達水平降低，EMT過程受阻，導(dǎo)致細胞遷移和侵襲能力減弱。Shi等[23]在肺腺癌細胞H1299和H1975中敲降MTHFD2后，發(fā)現(xiàn)EMT的變化與在肝癌中的研究結(jié)果類似，即EMT過程被抑制。隨后該團隊通過基因集富集分析和Western-blot技術(shù)驗證了MTHFD2可以激活A(yù)KT/糖原合成激酶3β/β-連環(huán)蛋白信號通路進而促進肺腺癌細胞的遷移。在卵巢癌細胞SKOV3和OVCAR8中，Li等[13]利用Western-blot技術(shù)發(fā)現(xiàn)MTHFD2表達下調(diào)引起信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄活化蛋白3誘導(dǎo)的EMT過程受阻，進而抑制卵巢癌細胞的惡性進展。

血管生成是指新生血管形成的過程，在腫瘤惡性進展中起著重要作用。Hitzel等[24]團隊在研究用氧化磷脂處理內(nèi)皮細胞后的代謝重編程過程中，通過建立貝葉斯(Bayesian)網(wǎng)絡(luò)模型發(fā)現(xiàn)了MTHFD2這一關(guān)鍵驅(qū)動因子；后續(xù)利用體外小鼠類器官模型，發(fā)現(xiàn)用siRNA敲降MTHFD2后，血管形成減少，若同時加入甘氨酸處理，血管形成能力有所恢復(fù)，表明依賴于MTHFD2的甘氨酸合成是血管生成所必備的；此外，該團隊在斑馬魚胚胎中敲降MTHFD2后，斑馬魚胚胎脈管系統(tǒng)的形態(tài)發(fā)生異常，進一步確認了MTHFD2對血管生成的重要性。血管生成在一定程度上與腫瘤的進展、侵襲和轉(zhuǎn)移能力密切相關(guān)[25]，MTHFD2極有可能通過參與代謝的重編程影響血管的生成，從而加速腫瘤的惡性進展過程。以上研究均提示MTHFD2在腫瘤細胞遷移和侵襲方面具有較一致的促進作用，但是由于腫瘤細胞所處微環(huán)境的復(fù)雜性，MTHFD2調(diào)節(jié)細胞遷移和侵襲的機制各不相同，仍需深入研究。

2.3 MTHFD2與細胞死亡

細胞死亡如凋亡、壞死、自噬等是被周密調(diào)控的復(fù)雜過程[26]。在持續(xù)的外界或自身不良因素作用下，細胞死亡的調(diào)控被打亂，異常的細胞可能會出現(xiàn)增殖加快，死亡減少等現(xiàn)象，最后導(dǎo)致細胞向惡性轉(zhuǎn)變。在卵巢癌中敲降MTHFD2表達后采用凋亡檢測顯示凋亡細胞比例明顯增加[13]。在肺腺癌中，Shi等[23]在體內(nèi)外，分別利用流式細胞術(shù)及TUNEL實驗證明，MTHFD2敲降后，肺腺癌細胞PC-9和H1975凋亡顯著增加。同樣地，在結(jié)直腸癌RKO和SW-480細胞中過表達MTHFD2后，與對照組比較，過表達MTHFD2組中凋亡細胞顯著減少[14]；但也有報道[21]表明，MTHFD2對肝癌細胞的凋亡并不產(chǎn)生顯著影響，提示MTHFD2對凋亡的影響可能跟腫瘤類型相關(guān)。然而MTHFD2對其他細胞死亡形式的作用鮮少報道，有待深入探索挖掘。

2.4 MTHFD2與腫瘤治療

因MTHFD2是一碳代謝中的主要酶之一，且其生物學(xué)功能不斷被挖掘，研究者開始致力于探索其在治療上的作用。在肝癌細胞中，Liu等[21]發(fā)現(xiàn)抗腫瘤代謝藥物MTX不僅能夠降低MTHFD2的表達，同時在MTHFD2敲降的細胞中用MTX處理后，細胞的增殖活性降低更顯著。Lin等[2]在腎癌細胞中做了類似的實驗，發(fā)現(xiàn)在MTHFD2敲降的786-O細胞中，用MTX或5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil，5-FU)處理后，細胞增殖活性被顯著抑制。這在一定程度上表明，MTHFD2的表達與化療藥物MTX和5-FU的敏感性值得被關(guān)注。

DS18561882是一種可口服的MTHFD2特異性抑制劑，Lee等[27]將DS18561882與細胞周期檢查點激酶1抑制劑結(jié)合起來，在體內(nèi)外驗證了二者協(xié)同誘導(dǎo)三陰乳腺癌細胞凋亡的作用。Ju等[28]構(gòu)建了結(jié)直腸癌人源性異種移植小鼠模型，并使用MTHFD2抑制劑LY345899處理，發(fā)現(xiàn)腫瘤生長受到抑制、細胞凋亡增加、腸系膜轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)明顯減少。Bonagas等[29]在體內(nèi)急性髓系白血病(acute myelogenous leukemia，AML)動物模型上，應(yīng)用強效MTHFD2小分子抑制劑TH9619，并與AML的標(biāo)準(zhǔn)治療藥物阿糖胞苷(cytosine arabinoside，AraC)的效果進行比較，發(fā)現(xiàn)TH9619處理的小鼠體質(zhì)量未發(fā)生改變且生存時間更長，而AraC處理的小鼠體質(zhì)量減輕，提示TH9619在體內(nèi)的毒性更小。Yang等[30]制備了一種新型的納米平臺，以酮縮硫醇交聯(lián)的氟化聚乙烯亞胺作為基因載體，形成包含MTHFD2和谷胱甘肽過氧化酶4敲降質(zhì)粒的活性氧反應(yīng)納米顆粒，并利用這兩種顆粒的促凋亡和誘導(dǎo)鐵死亡的作用共同處理癌細胞，在理論上安全有效且毒性小。這些報道為MTHFD2作為惡性腫瘤治療靶標(biāo)，將其抑制劑或敲降質(zhì)粒用于惡性腫瘤的臨床治療提供了有力證據(jù)和思路。

3 小結(jié)與展望

MTHFD2作為一碳代謝途徑中至關(guān)重要的酶，其功能活躍，與核苷酸合成、NADPH產(chǎn)生和氧化還原防御等密切相關(guān)。MTHFD2在多種惡性腫瘤中異常表達，且與患者的預(yù)后相關(guān)，但其分子機制各不相同，甚至有個別報道表明，MTHFD2很有可能不依賴其酶活性參與到腫瘤的惡性進展中。因此，在惡性腫瘤中，MTHFD2很有可能是具有雙重功能的蛋白，在特定的腫瘤微環(huán)境通過影響著腫瘤的惡性表型，進而影響腫瘤的惡性進展。

另外，影響腫瘤代謝是抗腫瘤藥物研發(fā)的重要環(huán)節(jié)，盡管已經(jīng)有MTHFD2相關(guān)抑制劑的報道，但是應(yīng)用到腫瘤本身的體內(nèi)外研究仍較少，MTHFD2抑制劑的發(fā)現(xiàn)、制備以及在MTHFD2高表達的腫瘤中對其有效性和毒性進行體內(nèi)外的驗證等問題，仍需進一步深入探討。MTHFD2若真正應(yīng)用到臨床，亟需解決的問題還較多。例如，MTHFD2作為一碳代謝的主要酶類，能否直接作為臨床上的靶標(biāo)；了解MTHFD2酶活性缺如狀態(tài)下生物學(xué)功能改變的具體機制；以及解決MTHFD2抑制劑的臨床應(yīng)用等難題。總之，以MTHFD2為靶標(biāo)以及以干擾腫瘤異常代謝為目的的治療方法，勢必成為未來惡性腫瘤預(yù)防診斷以及治療的新策略，真正的完善還需要更多的研究。