江 漪，吳劍輝，朱素珍，李培寧，劉香梅*

(廣州質(zhì)量監(jiān)督檢測(cè)研究院，廣東 廣州511447)

染發(fā)類化妝品屬于特殊化妝品，需經(jīng)國務(wù)院藥品監(jiān)督管理部門注冊(cè)后方可生產(chǎn)、進(jìn)口。按化妝品注冊(cè)和備案檢驗(yàn)項(xiàng)目要求，氧化型染發(fā)產(chǎn)品需進(jìn)行細(xì)菌回復(fù)突變?cè)囼?yàn)(或體外哺乳動(dòng)物細(xì)胞基因突變?cè)囼?yàn))和體外哺乳動(dòng)物細(xì)胞染色體畸變?cè)囼?yàn)檢測(cè)致突變性。

2021年，全國藥品監(jiān)督管理部門對(duì)染發(fā)類、洗發(fā)護(hù)發(fā)類、彩妝類、防曬類等11類化妝品抽檢，其中染發(fā)類產(chǎn)品合格率最低，為87.6%，其他類產(chǎn)品合格率均達(dá)到96%以上[1]。說明在不同種類的化妝品中，染發(fā)類產(chǎn)品存在較高的安全風(fēng)險(xiǎn)，需要監(jiān)管部門重視。2018—2020年通告的染發(fā)類不合格樣品中，不合格原因主要是染發(fā)劑檢驗(yàn)結(jié)果與配方或標(biāo)簽標(biāo)識(shí)的染發(fā)劑成分不符、超限量使用染發(fā)劑或添加禁用染發(fā)劑[2-3]。染料組分實(shí)測(cè)值與配方值不相符、甚至實(shí)測(cè)值超限值，提示染發(fā)劑存在較高的質(zhì)量與安全隱患。氧化型染發(fā)劑中的染料前體、偶合劑等成分具有不同程度的致癌、致敏和遺傳毒性[4]。本文旨在根據(jù)2021年廣州質(zhì)量監(jiān)督檢測(cè)研究院檢測(cè)的178件染發(fā)類化妝品細(xì)菌回復(fù)突變?cè)囼?yàn)結(jié)果，確定檢出致突變陽性較多的菌株和劑量，分析染發(fā)類化妝品的致突變?cè)?，探索染發(fā)類化妝品的安全風(fēng)險(xiǎn)因素。

1 材料與方法

1.1 材料

178件染發(fā)類化妝品為2021年企業(yè)送廣州質(zhì)量監(jiān)督檢測(cè)研究院檢測(cè)的產(chǎn)品，涵蓋33個(gè)品牌。試驗(yàn)前按產(chǎn)品使用說明書將1劑染發(fā)膏和2劑雙氧奶按比例混合均勻后，用滅菌水配制12.5、25、50、100、200 mg/mL的受試物溶液備用。預(yù)設(shè)染發(fā)劑的最高劑量為20 mg/皿(+S9)、10 mg/皿(-S9)，以下按2倍梯度分別設(shè)3個(gè)劑量組。根據(jù)抑菌情況和受試物沉淀情況，調(diào)整劑量。

1.2 試驗(yàn)菌株

鼠傷寒沙門氏菌組氨酸缺陷型TA97a、TA98、TA100、TA102和TA1535菌株，購自美國MOLTOX公司。試驗(yàn)前，5種菌株均經(jīng)過本實(shí)驗(yàn)室鑒定，菌株的生物特性符合試驗(yàn)要求。

1.3 主要試劑

疊氮鈉和2-氨基芴購于美國Sigma Aldrich公司，敵克松購于美國ChemService公司，1,8-二羥基蒽醌購于阿拉丁試劑有限公司，2-氨基蒽購于日本TCI公司，S9購于江蘇齊氏生物科技有限公司，輔酶Ⅱ購于上海源葉生物科技有限公司，6-磷酸葡萄糖購于阿拉丁試劑有限公司。

1.4 代謝物活化系統(tǒng)

S9加相應(yīng)的輔助因子(6-磷酸葡萄糖、輔酶Ⅱ)配制成含10% S9的混合液(S9mix)，作為體外代謝活化系統(tǒng)。臨用時(shí)配制，保存于冰浴中，備用。

1.5 主要儀器

全自動(dòng)Ames試驗(yàn)儀購于北京慧榮和科技有限公司；菌落計(jì)數(shù)儀購于杭州迅數(shù)科技有限公司；HVE-50高壓蒸汽滅菌器購于日本Hirayama公司；SHEL LAB生化培養(yǎng)箱購于美國SHEL LAB公司；SBS40振蕩水浴購于英國BIBBY STUART公司。

1.6 方法

依據(jù)《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》(2015年版)[5]細(xì)菌回復(fù)突變?cè)囼?yàn)，檢測(cè)178件染發(fā)類化妝品的致突變性。

1.6.1 增菌培養(yǎng)分別于TA97a、TA98、TA100、TA102、TA1535主平板取生長良好的單個(gè)菌落接種于營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，混勻，37℃振蕩(100 r/min)培養(yǎng)10 h。

1.6.2 平板摻入法采用全自動(dòng)Ames試驗(yàn)儀，將頂層瓊脂培養(yǎng)基2.0 mL加入試管中，然后每管依次加入0.1 mL受試物溶液、0.1 mL試驗(yàn)菌株增菌液和0.5 mL磷酸鹽緩沖液或者0.5 mL S9混合液(需代謝活化時(shí))，充分混勻，迅速傾入底層培養(yǎng)基平板上，轉(zhuǎn)動(dòng)平板，使之分布均勻。水平放置待冷凝固化后，倒置于37℃培養(yǎng)箱里培養(yǎng)48 h，記錄每皿回變菌落數(shù)。

試驗(yàn)在加和不加S9混合液的條件下進(jìn)行，除設(shè)受試物各劑量組外，同時(shí)設(shè)空白對(duì)照組、溶劑對(duì)照組、陽性對(duì)照組和無菌對(duì)照組。每個(gè)劑量均做3個(gè)平行平板。

1.6.3 數(shù)據(jù)處理計(jì)算各菌株各劑量3個(gè)平板回變菌落數(shù)的均值和標(biāo)準(zhǔn)差。

1.6.4 結(jié)果評(píng)價(jià)受試物誘發(fā)的TA97a、TA98、TA100、TA102回變菌落數(shù)是溶劑對(duì)照組的2倍或2倍以上，受試物誘發(fā)的TA1535的回變菌落數(shù)是溶劑對(duì)照組的3倍或3倍以上，并出現(xiàn)以下情形之一，則該染發(fā)劑判定為致突變陽性：①呈劑量-反應(yīng)關(guān)系；②任何一個(gè)劑量條件下，出現(xiàn)陽性反應(yīng)并有可重復(fù)性。染發(fā)劑經(jīng)上述5個(gè)試驗(yàn)菌株測(cè)定后，只要有1個(gè)試驗(yàn)菌株，無論在加S9或不加S9條件下為陽性，均可報(bào)告該染發(fā)劑細(xì)菌回復(fù)突變?cè)囼?yàn)為致突變陽性。如果染發(fā)劑經(jīng)5個(gè)試驗(yàn)菌株檢測(cè)后，無論加S9和不加S9均為陰性，則可報(bào)告該染發(fā)劑為致突變陰性。

1.6.5 數(shù)據(jù)分析錄入染發(fā)類化妝品信息(名稱、品牌、加或不加S9、最高劑量、陽性菌株、陽性劑量)，采用Microsoft Excel進(jìn)行數(shù)據(jù)整理分析。

2 結(jié)果

2.1 178件染發(fā)類化妝品細(xì)菌回復(fù)突變?cè)囼?yàn)的最高劑量

178件染發(fā)類化妝品中，在加S9條件下，無細(xì)菌毒性、最高劑量為20 mg/皿的有99件，占比55.62%，平皿中無抑菌、沉淀輕微可見。有細(xì)菌毒性、最高劑量為10 mg/皿的有72件，占比40.45%。在不加S9條件下，20 mg/皿會(huì)產(chǎn)生細(xì)菌毒性，最高的劑量為10 mg/皿，占比9.55%；最高劑量5 mg/皿占比最高，為60.67%，有108件。最高劑量的分布情況見表1。

表1 178件染發(fā)類化妝品細(xì)菌回復(fù)突變?cè)囼?yàn)最高劑量的分布

2.2 178件染發(fā)類化妝品細(xì)菌回復(fù)突變?cè)囼?yàn)的陽性率

178件染發(fā)類化妝品中，在加S9的條件下，細(xì)菌回復(fù)突變?cè)囼?yàn)陽性的樣品數(shù)為35件，這35件中的7件，不加S9的條件下，致突變性亦為陽性。剩下的143件染發(fā)類化妝品，在加S9和不加S9條件下均為致突變陰性。因此，178件染發(fā)類化妝品中致突變陽性的有35件，陽性率為19.67%。

2.3 5種試驗(yàn)菌株測(cè)定細(xì)菌回復(fù)突變?cè)囼?yàn)的陽性結(jié)果

35件致突變陽性的染發(fā)類化妝品中，5個(gè)菌株的陽性檢出數(shù)量分別為：TA98 35件，TA97a 15件，TA100 2件，TA102 0件，TA1535 2件。TA97a、TA100、TA1535致突變性陽性的樣品，TA98致突變性也為陽性。

2.4 5種試驗(yàn)菌株陽性結(jié)果的劑量分布情況

致突變陽性的染發(fā)類化妝品，隨著劑量的升高，回變菌落數(shù)升高，陽性反應(yīng)出現(xiàn)在高劑量組。35件致突變陽性的染發(fā)類化妝品中，加S9的條件下，TA97a出現(xiàn)陽性反應(yīng)最多的劑量為10 mg/皿，TA98出現(xiàn)陽性反應(yīng)最多的劑量為5 mg/皿；不加S9的條件下，TA98出現(xiàn)陽性反應(yīng)最多的劑量為2.5 mg/皿。結(jié)果見表2。

表2 35件細(xì)菌回復(fù)突變?cè)囼?yàn)陽性的染發(fā)類化妝品陽性劑量分布(件)

2.5 不同品牌細(xì)菌回復(fù)突變?cè)囼?yàn)致突變陽性結(jié)果的分布情況

33個(gè)品牌178件染發(fā)類化妝品的陽性檢出結(jié)果如表3。不同品牌染發(fā)類化妝品細(xì)菌回復(fù)突變?cè)囼?yàn)陽性檢出率差異較大，最低的為0，最高的達(dá)60%。

表3 不同品牌染發(fā)類化妝品細(xì)菌回復(fù)突變?cè)囼?yàn)陽性結(jié)果分布

3 討論

染發(fā)劑最高劑量由溶解度和細(xì)菌毒性決定，178件染發(fā)類化妝品細(xì)菌回復(fù)突變?cè)囼?yàn)最高劑量的結(jié)果顯示，在加S9的條件下，96.07%的染發(fā)類化妝品最高劑量為20或10 mg/皿；在不加S9的條件下，60.67%的染發(fā)類化妝品最高劑量為5 mg/皿。此數(shù)據(jù)可為染發(fā)劑的劑量設(shè)計(jì)提供參考。加S9后，染發(fā)類化妝品細(xì)菌毒性降低，說明S9中的生物轉(zhuǎn)化酶作用染發(fā)類化妝品后對(duì)細(xì)菌產(chǎn)生減毒作用。

178件染發(fā)類化妝品細(xì)菌回復(fù)突變?cè)囼?yàn)致突變陽性率為19.67%(35件)，且均在加S9下致突變陽性，說明染發(fā)類化妝品中具有致突變性的多為需要代謝活化的染料組分。在35件致突變陽性的染發(fā)類化妝品中，TA98、TA97a的陽性檢出數(shù)量較高，陽性劑量多出現(xiàn)在10和5 mg/皿。TA97a和TA98能檢測(cè)移碼突變，說明致突變陽性的染發(fā)類化妝品中含有同時(shí)導(dǎo)致TA97a、TA98突變的染料組分，且TA98能檢測(cè)出更多需要代謝活化的致突變物。有研究表明在S9的參與下，經(jīng)由過氧化氫處理后，染發(fā)劑配方中鄰苯二胺、對(duì)-氯-鄰苯二胺、間苯二胺、對(duì)-甲氧基-間苯二胺的致突變活性明顯增加[6-7]。還有相關(guān)研究表示，氧化型染發(fā)劑染料前體被過氧化氫氧化后，其氧化產(chǎn)物經(jīng)代謝活化后對(duì)TA98具有較強(qiáng)的回復(fù)致突變作用[8]。本次研究結(jié)果與該結(jié)論一致。

送檢的13個(gè)品牌(送檢染發(fā)類化妝品數(shù)量不小于5件)致突變陽性檢出率差異較大，范圍涵蓋0～60%，分析可能與染發(fā)劑配方中染料前體的含量有較大關(guān)聯(lián)。因此，在染發(fā)劑的配方開發(fā)中，需加強(qiáng)對(duì)著色劑成分含量與組合的研究，在保證染色效果的情況下，提高染發(fā)劑的安全性。