井子良，吳純宇，張慧敏，孫建博*

（1.中國(guó)藥科大學(xué)中藥學(xué)院，江蘇南京 210009）（2.江蘇盛世康禾生物技術(shù)有限公司，江蘇常州 213032）

在腫瘤治療過(guò)程中，中草藥以及天然植物毒副作用少、臨床應(yīng)用廣、提高免疫能力明顯，是輔助腫瘤治療的最佳藥物。靈芝是一味歷史悠久的中藥，最早記載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，被列為上品藥材，是最受推崇的中藥之一。靈芝孢子油是從破壁的靈芝孢子粉中提取得到的油狀脂質(zhì)物，含有三萜及甾醇類、核苷類、脂肪酸、維生素等多種成分[1]?，F(xiàn)代藥理和臨床研究表明靈芝具有調(diào)節(jié)血脂、提高免疫力、改善心腦血管和呼吸功能等功效[1]。此外，靈芝及其提取物不僅可通過(guò)提高免疫力抑制腫瘤，還具有直接抗腫瘤作用，且其抑瘤作用呈濃度依賴性[1]。番茄紅素結(jié)構(gòu)中存在的大量不飽和雙鍵，能夠有效地吸收長(zhǎng)波和淬滅單線態(tài)氧，是自然界中抗氧化能力極強(qiáng)的疏水性無(wú)環(huán)類胡蘿卜素，抗氧化能力是維生素E的100倍[2]。番茄紅素具有防治糖尿病血管并發(fā)癥、增強(qiáng)免疫力、預(yù)防前列腺癌和心血管疾病等功能[3,4]。已有研究證實(shí)，番茄紅素還能在一定程度上抑制胃癌、卵巢癌等癌癥的進(jìn)展[3,4]。

靈芝孢子油番茄紅素復(fù)合物（LZFQ）是將靈芝孢子油作為主要成分，加入適量番茄紅素作為輔料復(fù)合配比組成，復(fù)方中總?cè)坪空急?2.22%，番茄紅素含量占比16.67%。該復(fù)合物有望通過(guò)靈芝孢子油和番茄紅素的協(xié)同作用發(fā)揮有效的抗腫瘤活性。本實(shí)驗(yàn)研究了LZFQ對(duì)人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞（A549）、人胃癌細(xì)胞（BGC823）、人乳腺癌細(xì)胞（MCF-7）和人結(jié)腸癌細(xì)胞（HCT116）的生長(zhǎng)活性影響，通過(guò)裸鼠移植瘤模型研究LZFQ在體內(nèi)對(duì)腫瘤的抑制作用，并對(duì)LZFQ的抗腫瘤活性機(jī)制進(jìn)行初步探討，旨在證實(shí)靈芝孢子油和番茄紅素復(fù)合物具有開(kāi)發(fā)為優(yōu)良抗腫瘤活性制劑的潛力，以期為靈芝孢子油和番茄紅素藥學(xué)研究和臨床應(yīng)用提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥品和試劑

靈芝孢子油番茄紅素復(fù)合物（批號(hào)：20210326），購(gòu)自康道生物（南通）有限公司；RPMI-1640不完全培養(yǎng)基（貨號(hào)：KGM31800-500）、DMEM不完全培養(yǎng)基（貨號(hào)：KGM12800NH-500）、胰蛋白酶（貨號(hào)：KGY0012）、PBS（貨號(hào)：KGB5001）、Annexin V-FITC/PI雙染細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒（貨號(hào)：KGA108），江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司；胎牛血清（貨號(hào)：04-001-1ACS），Biological Industries；四甲基噻唑藍(lán)（ST316），碧云天；DMSO，國(guó)藥試劑公司；環(huán)磷酰胺（批號(hào)：SLBC0666V），杭州吉諾醫(yī)藥生物科技有限公司。

1.2 細(xì)胞株

人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞（A549）、人胃癌細(xì)胞（BGC823）、人乳腺癌細(xì)胞（MCF-7）和人結(jié)腸癌細(xì)胞（HCT116）來(lái)源于凱基生物技術(shù)股份有限公司。

1.3 儀器與設(shè)備

60L/TOMSX-700高壓蒸汽滅菌鍋，Tomy Digital Biology；ESCO ISOtherm烘箱，新加坡藝思高科技有限公司；MSC-Advantage生物安全柜，Thermo；HERAcell 150i CO2培養(yǎng)箱，Thermo；TDZ4A-WS臺(tái)式低速離心機(jī)，湘儀；Ts100倒置顯微鏡，Nikon；MX-F漩渦混勻儀，賽洛捷克；POLARstar多功能酶標(biāo)儀，Omega；Ts2R倒置熒光顯微鏡，Nikon；Accuri C6小型流式細(xì)胞儀，BD Biosciences；FV3000激光共聚焦顯微鏡，Olympus。

1.4 MTT實(shí)驗(yàn)

細(xì)胞培養(yǎng)在含10%體積分?jǐn)?shù)的胎牛血清（FBS）的DMEM培養(yǎng)液中，并孵育在含體積分?jǐn)?shù)5% CO2的恒溫（37 ℃）孵箱內(nèi)。細(xì)胞培養(yǎng)一段時(shí)間后，首先用顯微鏡觀察，判斷細(xì)胞狀態(tài)是否良好和數(shù)量是否達(dá)到80%以上，若符合以上條件，即可進(jìn)行傳代，首先將舊培養(yǎng)基除去，PBS清洗；其次加入1 mL胰酶（含EDTA）消化，均勻搖晃培養(yǎng)盤，保證胰酶能與培養(yǎng)盤表面充分接觸，根據(jù)細(xì)胞種類的不同，在培養(yǎng)箱中消化不同時(shí)間（本實(shí)驗(yàn)所用細(xì)胞消化時(shí)間為1～3 min），消化結(jié)束后可進(jìn)行鏡檢；加入完全培養(yǎng)基終止消化，通過(guò)吹打可見(jiàn)細(xì)胞成流沙狀掉落，收集細(xì)胞，1 000 r/min，離心5 min，除上清；最后使用培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，將適量懸液打入培養(yǎng)盤中，放置在37 ℃培養(yǎng)箱中。當(dāng)細(xì)胞狀態(tài)處于指數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)準(zhǔn)備接種，先傾倒培養(yǎng)液，PBS洗滌1次，加入1 mL 0.25%胰蛋白酶消化液消化約2 min，加入1 mL含10%胎牛血清的完全培養(yǎng)基，1 000 r/min離心5 min，傾倒上清液，細(xì)胞計(jì)數(shù)并稀釋至每毫升5×103個(gè)，并將細(xì)胞懸液以每孔200 μL接種于96孔板上，置恒溫CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。加入不同濃度（0.125、0.25、0.50 mg/mL）的LZFQ和對(duì)照藥物靈芝孢子油（LZBZ），每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)24 h。將MTT試劑加入96孔板中（每孔20 μL），培養(yǎng)箱孵育4 h。用酶標(biāo)儀在570 nm波長(zhǎng)處測(cè)吸光值（OD值），并計(jì)算細(xì)胞抑制率和受試化合物的IC50值。

1.5 細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)

將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A549細(xì)胞消化下來(lái)，接種于6孔板中（每孔4×105個(gè)細(xì)胞），置于恒溫CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，然后吸去舊的培養(yǎng)基，根據(jù)組別設(shè)置加入不同濃度（0.125、0.25、0.50 mg/mL）的LZFQ含藥培養(yǎng)基，同時(shí)設(shè)立陰性對(duì)照組（DMSO）。在藥物作用48 h后，用不含EDTA的胰酶消化液消化細(xì)胞，加入1 mL的完全培養(yǎng)基終止消化，根據(jù)組別設(shè)置，轉(zhuǎn)移至相應(yīng)的5 mL離心管中，2 000 r/min離心5 min。吸去上清液，加入1 mL的PBS，將細(xì)胞團(tuán)塊吹打均勻后轉(zhuǎn)移至1.5 mL的離心管中，2 000 r/min離心5 min，吸去上清液，加入1 mL的PBS，再次離心沉淀細(xì)胞。吸去上清液，然后將細(xì)胞重懸于500 μL緩沖液中，依次加入Annexin V-FITC（5 μL）和碘化丙啶PI（5 μL），室溫避光條件下孵育15 min后用流式細(xì)胞儀在488 nm處檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。

1.6 Western blot實(shí)驗(yàn)

將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A549細(xì)胞消化下來(lái)，接種于6孔板中（每孔4×105個(gè)細(xì)胞），置恒溫CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，然后吸去舊的培養(yǎng)基，根據(jù)組別設(shè)置加入不同濃度（0.125、0.25、0.50 mg/mL）的LZFQ含藥培養(yǎng)基，同時(shí)設(shè)立陰性對(duì)照組（DMSO）。在藥物作用24 h后，收集并用細(xì)胞裂解液（RAPI）裂解細(xì)胞，提取蛋白，將蛋白濃度稀釋至3 mg/mL（BCA定量方法），金屬浴100 ℃變性10 min。在SDS-PAGE泳道中每孔上樣10 μL，電泳1.5 h，轉(zhuǎn)膜，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%的BSA溶液封閉。一抗4 ℃孵育過(guò)夜，吸去一抗，加入二抗孵育1 h，天能凝膠成像系統(tǒng)顯影并拍照，用Image J軟件處理數(shù)據(jù)。

1.7 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與飼養(yǎng)條件

BALB/c Nude裸小鼠，購(gòu)自南京青龍山動(dòng)物繁殖場(chǎng)，許可證號(hào)：SCXK（滬）2018-0004。飼養(yǎng)條件：室溫22～25 ℃，相對(duì)濕度：60%±10%，自然光線，自由飲水進(jìn)食，適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d。本實(shí)驗(yàn)已獲得中國(guó)藥科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.8 動(dòng)物模型的建立及分組

分別將6×106個(gè)A549細(xì)胞皮下接種于Balb/c裸鼠的小鼠背部右側(cè)皮下。飼養(yǎng)7 d后，取小鼠稱體質(zhì)量，隨機(jī)分為5組，每組6只。第1組為模型對(duì)照組，第2組為L(zhǎng)ZFQ低劑量組（0.50 g/kg），第3組為L(zhǎng)ZFQ中劑量組（1.00 g/kg），第4組為L(zhǎng)ZFQ高劑量組（2.00 g/kg），第5組為環(huán)磷酰胺組（0.075 g/kg）。每2 d測(cè)量一次體質(zhì)量，在連續(xù)14 d的灌胃喂食后，將所有小鼠處死并稱其質(zhì)量，解剖剝離瘤塊，并稱其質(zhì)量。根據(jù)公式（1）計(jì)算腫瘤抑制率。

式中：

S——腫瘤抑制率，%；

C——給藥組平均瘤重，g；

T——對(duì)照組平均瘤重，g。

1.9 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有的數(shù)據(jù)結(jié)果均以±s表示，采用SPSS 21.0數(shù)據(jù)處理軟件行組間單因素方差分析，多組間比較行F值檢驗(yàn)，組間對(duì)比行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，若p＜0.05則表示存在顯著性差異。

2 結(jié)果與討論

2.1 MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果

采用MTT法對(duì)LZFQ進(jìn)行了體外抗腫瘤活性測(cè)試，并以LZBZ為陽(yáng)性對(duì)照，測(cè)定了它們對(duì)人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞（A549）、人胃癌細(xì)胞（BGC823）、人乳腺癌細(xì)胞（MCF-7）和人結(jié)腸癌細(xì)胞（HCT116）的抑制活性（表1）。結(jié)果如表1所示，相較于靈芝孢子油，LZFQ對(duì)人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞（IC50=0.49 mg/mL）、人乳腺癌細(xì)胞（IC50=0.53 mg/mL）和人結(jié)腸癌細(xì)胞（IC50=0.61 mg/mL）有不同程度的提高。其中LZFQ對(duì)A549細(xì)胞的IC50值為0.49 mg/mL，在四種癌細(xì)胞中抗腫瘤活性最好，因此，選取A549細(xì)胞對(duì)LZFQ進(jìn)行抗腫瘤機(jī)制研究。

表1 LZFQ對(duì)4種腫瘤細(xì)胞的抗增殖作用Table 1 Antiproliferative effects of LZFQ on four tumor cells(mg/mL,±s, n=3)

表1 LZFQ對(duì)4種腫瘤細(xì)胞的抗增殖作用Table 1 Antiproliferative effects of LZFQ on four tumor cells(mg/mL,±s, n=3)

注：*p＜0.05，**p＜0.01 vs A549 by LZFQ。

組別 IC50/(mg/mL)A549 BGC823 MCF-7 HCT116 LZFQ 0.49±0.02 0.58±0.04* 0.53±0.01* 0.61±0.04**LZBZ 0.54±0.03 0.56±0.04 0.58±0.05 0.66±0.03

2.2 LZFQ誘導(dǎo)A549細(xì)胞凋亡

為了確定LZFQ是否誘導(dǎo)A549細(xì)胞凋亡，在A549細(xì)胞中采用annexin V-FITC/PI雙染色法來(lái)研究。如圖1所示，A549細(xì)胞在不同濃度（0.125、0.25、0.50 mg/mL）的LZFQ作用48 h后，早期（annexin-V+/PI）和晚期（annexin-V+/PI+）凋亡細(xì)胞比例分別為11.20%、20.50%和25.30%。結(jié)果表明LZFQ可以濃度依賴性的誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，發(fā)揮抗腫瘤作用。

圖1 不同濃度LZFQ對(duì)A549細(xì)胞凋亡的影響Fig.1 Effect of different concentration of LZFQ on apoptotic in A549 cell (±s, n=3)

2.3 LZFQ對(duì)凋亡相關(guān)蛋白的影響

表2 LZFQ對(duì)凋亡相關(guān)蛋白的影響Table 2 Effects of LZFQ on the apoptosis related proteins.(±s, n=3)

表2 LZFQ對(duì)凋亡相關(guān)蛋白的影響Table 2 Effects of LZFQ on the apoptosis related proteins.(±s, n=3)

注：*p＜0.05；**p＜0.01 vs DMSO group。

LZFQ/(mg/mL) Ratio of apoptosis related proteins/GAPDH Bcl-2 Bax Cleaved-caspase-3 0 0.91±0.07 0.18±0.01 0.25±0.03 0.125 0.85±0.08 0.23±0.03 0.37±0.05*0.25 0.60±0.04* 0.36±0.02* 0.59±0.02**0.50 0.42±0.05** 0.44±0.04** 0.68±0.04**

下調(diào)Bcl-2（抗凋亡蛋白）水平及上調(diào)Bax（促凋亡蛋白）水平可激活凋亡通路。為進(jìn)一步闡明LZFQ的促凋亡機(jī)制，測(cè)試了其對(duì)凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Bax及Cleaved-Caspase-3的影響作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表2所示，隨著給藥濃度逐漸升高（0、0.125、0.25、0.50 mg/mL），LZFQ濃度依賴性地降低抑凋亡蛋白Bcl-2的水平（Bcl-2/GAPDH為0.91、0.85、0.60、0.42）、并提高促凋亡蛋白Bax（Bax/GAPDH為0.18、0.23、0.36、0.44）及Caspase-3（Cleaved-Caspase-3/GAPDH為0.25、0.37、0.59、0.68）的水平。本實(shí)驗(yàn)表明，LZFQ能夠影響癌細(xì)胞中凋亡相關(guān)蛋白的水平，從而發(fā)揮誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡的作用。

2.4 LZFQ對(duì)小鼠體內(nèi)移植瘤的影響

為了評(píng)價(jià)LZFQ在體內(nèi)的抗腫瘤活性，將A549細(xì)胞接種于小鼠背部右側(cè)皮下，建立小鼠肺腺癌異種移植瘤模型。結(jié)果如表3所示，LZFQ低、中、高劑量組對(duì)A549荷瘤小鼠抑瘤率分別為43.27%、51.92%、60.58%，三種劑量組明顯減小了腫瘤質(zhì)量，與模型對(duì)照組相比有顯著性差異（p＜0.01）。陽(yáng)性對(duì)照組腫瘤顯著減小，與模型對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p＜0.01）。另外，LZFQ低、中、高劑量給藥荷瘤小鼠與模型組實(shí)驗(yàn)前后各組體重基本一致（分別為22.52、22.49和23.08 g），而環(huán)磷酰胺組體重有所降低（18.34 g），表明LZFQ對(duì)體重沒(méi)有顯著影響。

靈芝孢子油是從破壁的靈芝孢子中提取的脂質(zhì)活性物，目前主要的提取方法包括索式提取法、超臨界CO2萃取法、超聲波提取法以及水酶法。靈芝孢子油富含三萜類、核苷類及部分多糖類化合物，是靈芝孢子有效成分的集合體[5,6]。隨著靈芝孢子油提取工藝和方法的進(jìn)步，人們對(duì)靈芝孢子油的研究日益重視和深入?，F(xiàn)代藥理研究表明，靈芝孢子油具有抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)、神經(jīng)調(diào)節(jié)、降血脂和保肝護(hù)肝等活性[6,7]。在抗腫瘤方面，靈芝孢子油能顯著誘導(dǎo)多種腫瘤細(xì)胞凋亡，這與其上調(diào)Bax同時(shí)下調(diào)Bcl-2和VEGF的mRNA表達(dá)水平，降低線粒體膜電位和細(xì)胞色素c的釋放等關(guān)鍵因素有關(guān)[8-13]。番茄紅素是一種天然類胡蘿卜素，是由11個(gè)共軛雙鍵和2個(gè)非共軛雙鍵組成的直鏈碳?xì)浠衔?，主要存在于成熟的番茄、西瓜、番石榴、玫瑰果、木瓜和葡萄柚等果?shí)中[14]。人體自身不能合成番茄紅素，其攝入量的85%來(lái)源于番茄和以番茄為基礎(chǔ)的產(chǎn)品[15]。藥理研究表明，番茄紅素在抗氧化、提高機(jī)體免疫力等方面具有較好的作用[16-26]，因而被廣泛應(yīng)用于保健品、化妝品中。

表3 LZFQ對(duì)A549荷瘤小鼠腫瘤質(zhì)量的影響Table 3 Inhibitory effects of LZFQ on tumor growth in A549 tumor-bearing mice (±s, n=6)

表3 LZFQ對(duì)A549荷瘤小鼠腫瘤質(zhì)量的影響Table 3 Inhibitory effects of LZFQ on tumor growth in A549 tumor-bearing mice (±s, n=6)

注：與模型對(duì)照組相比*p＜0.05，**p＜0.01。

組別 劑量/(g/kg) 腫瘤質(zhì)量/g 平均抑瘤率/% 小鼠體質(zhì)量/g模型對(duì)照組 - 1.04±0.09 - 23.16±0.14 LZFQ低劑量組 0.50 0.59±0.03** 43.27 22.52±0.19 LZFQ中劑量組 1.00 0.50±0.03** 51.92 22.49±0.23 LZFQ高劑量組 2.00 0.41±0.02** 60.58 23.08±0.21 LZBZ組 2.00 0.45±0.03** 56.73 21.27±0.17 CTX組 0.075 0.38±0.04** 63.46 18.34±0.16

體外抗腫瘤活性實(shí)驗(yàn)表明靈芝孢子油番茄紅素復(fù)合物具有和靈芝孢子油本身類似或更好的抗腫瘤活性。體內(nèi)移植瘤實(shí)驗(yàn)也證明，靈芝孢子油番茄紅素復(fù)合物與靈芝孢子油本身一樣也能夠抑制體內(nèi)移植瘤的生長(zhǎng)。這可能和靈芝孢子油與番茄紅素發(fā)揮協(xié)同作用有關(guān)。

3 結(jié)論

本研究表明靈芝孢子油番茄紅素復(fù)合物（LZFQ）在體內(nèi)外均表現(xiàn)出一定的抗腫瘤活性，LZFQ對(duì)A549細(xì)胞抑制活性最佳（IC50=0.49 mg/mL），優(yōu)于環(huán)磷酰胺（IC50=0.51 mg/mL）。LZFQ可以通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡來(lái)抑制腫瘤細(xì)胞，并且濃度依賴性地降低抑凋亡蛋白Bcl-2的水平并提高促凋亡蛋白Bax、Caspase-3的水平。體內(nèi)移植瘤實(shí)驗(yàn)表明，LZFQ能夠抑制體內(nèi)移植瘤的生長(zhǎng)。在后續(xù)研究中，將從靈芝孢子油和番茄紅素的協(xié)同作用入手，進(jìn)一步深入探究二者相互作用。總的來(lái)說(shuō)，本研究成果可為靈芝孢子油類復(fù)合物產(chǎn)品的研發(fā)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。