葛城，周榮杰，詹勝群，周鈞，儲(chǔ)曉剛

（澳優(yōu)乳業(yè)（中國(guó)）有限公司，湖南長(zhǎng)沙 410200）

乳粉跨境國(guó)際貿(mào)易對(duì)于產(chǎn)品中的關(guān)鍵營(yíng)養(yǎng)成分的含量控制技術(shù)要求高。乳粉是全球貿(mào)易中重要的一部分，在跨境貿(mào)易中，各國(guó)為保護(hù)消費(fèi)者的食用安全，出口到我國(guó)的乳粉既需要滿足原產(chǎn)國(guó)的法規(guī)要求，又需要滿足進(jìn)口國(guó)的法規(guī)要求。我國(guó)制定了食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)，其中就含有百余項(xiàng)關(guān)于乳粉及乳制品的檢測(cè)方法，其中大部分的乳粉檢測(cè)方法為強(qiáng)制性標(biāo)準(zhǔn)。對(duì)于暫無(wú)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法的物質(zhì)則使用推薦性標(biāo)準(zhǔn)或補(bǔ)充方法。

在國(guó)外，則通行采用ISO國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)方法、AOAC方法及各國(guó)的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)等，對(duì)于乳粉中很多營(yíng)養(yǎng)成分，如：維生素B1、維生素B2、維生素C、膽堿、左旋肉堿等，國(guó)際方法和我國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法存在較多的差異甚至個(gè)別檢測(cè)方法的差異還很大[1-8]，而不同的檢測(cè)方法、不同的實(shí)驗(yàn)室、不同的檢測(cè)人員的都會(huì)使實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生偏差，導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果存在差異，因此，對(duì)方法進(jìn)行等效性研究和分析顯得十分必要。

方法等效性分析[9]一般從兩種方法的精密度（方法性能）、實(shí)驗(yàn)結(jié)果（顯著性檢驗(yàn)）入手，并通過(guò)獲取大量重復(fù)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)比對(duì)，分析兩種或多種方法檢測(cè)結(jié)果的差異顯著性；通過(guò)精密度評(píng)價(jià)兩種或多種方法精密度的差異及通過(guò)F檢驗(yàn)法判斷兩者的差異的顯著性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果評(píng)價(jià)則是考察兩種檢測(cè)方法所得結(jié)果的一致性程度，一般有顯著性檢驗(yàn)[10]、雙因素方差檢驗(yàn)[11]、雙向單側(cè)t檢驗(yàn)（TOST）[12,13]等多種方式方法，雙因素方差分析是在分析兩種方法差異的時(shí)候同時(shí)考慮兩種變量，側(cè)重去思考造成檢測(cè)結(jié)果差異的最主要原因是什么；TOST參考了醫(yī)、藥學(xué)方面等效性驗(yàn)證方式，該檢驗(yàn)方法需對(duì)參比方法結(jié)果設(shè)立等效邊界，邊界可以參考對(duì)應(yīng)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法或者通過(guò)Horwitz方程[14]進(jìn)行設(shè)置，其檢驗(yàn)假設(shè)與經(jīng)典顯著性假設(shè)中的位置正好相反。TOST一般優(yōu)于顯著性檢測(cè)方法，因?yàn)樵摍z驗(yàn)方法可以避免當(dāng)樣本量過(guò)小或精密度過(guò)高而引起的顯著性誤判。

對(duì)維生素B1、維生素B2、維生素B3、維生素B6四種維生素，由于AOAC Official Methods 2015.14[1]有更高效的檢測(cè)效率，且其檢測(cè)機(jī)理與國(guó)標(biāo)方法有所差異，為探究該AOAC方法與我國(guó)國(guó)標(biāo)方法GB 5009.84-2016第一法（維生素B1）、GB 5009.85-2016第一法（維生素B2）、GB 5009.89-2016第二法（維生素B3）、GB 5009.154-2016 第一法（維生素B6）[4,5,15,16]之間是否等效，本研究首先通過(guò)對(duì)所涉及的五個(gè)檢測(cè)方法進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證，然后就方法精密度進(jìn)行比較分析，再進(jìn)行了各方法的對(duì)比試驗(yàn)并對(duì)結(jié)果進(jìn)行了統(tǒng)顯著性分析，對(duì)于存在顯著性差異的指標(biāo)通過(guò)TOST進(jìn)一步分析以避免精密度過(guò)高而引起的顯著性誤判，在確認(rèn)某指標(biāo)國(guó)標(biāo)與AOAC方法等效不好后對(duì)兩種方法的機(jī)理主要差異進(jìn)行比對(duì)分析，找出檢測(cè)結(jié)果偏差的主要原因。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

嬰幼兒配方奶粉、液態(tài)純牛奶、液態(tài)純羊奶，市售。

正丁醇、冰乙酸、氫氧化鈉、氯化鈣，均為分析純，天津科密歐公司。鐵氰化鉀、濃鹽酸、偏磷酸、磷酸，均為分析純，國(guó)藥集團(tuán)。氫氧化鉀，分析純，天津恒興公司。高氯酸，優(yōu)級(jí)純，天津鑫源公司。乙二胺四乙酸二鈉鹽、磷酸氫二鉀，均為優(yōu)級(jí)純，德國(guó)CNW公司。乙酸鈉、辛烷磺酸鈉、甲醇、異丙醇、庚烷磺酸鈉、三乙胺，均為色譜純，德國(guó)CNW公司。甲酸銨、甲醇，均為質(zhì)譜級(jí)，德國(guó)CNW公司。

高峰淀粉酶（148 U/mg）、α-淀粉酶（米曲霉中，150 U/mg）、酸性磷酸酶（馬鈴薯中的II型，0.5～3.0 U/mg），美國(guó)Sigma公司。木瓜蛋白酶（番木瓜，≥3 U/mg），上海滬試公司。

煙酰胺，德國(guó)Dr公司；煙酸、鹽酸吡哆胺，美國(guó)Sigma公司；鹽酸吡哆醛，美國(guó)Chemservice公司；鹽酸吡哆醇、核黃素、鹽酸硫胺素，美國(guó)Supelco公司；2H4-煙酰胺、2H4-煙酸、13C4-吡哆醇，加拿大CDN ISOTOPES公司；2H3-吡哆醛、2H3-吡哆胺、13C4-硫胺素、13C4,15N2-核黃素，美國(guó)IsoScience公司。

1.2 設(shè)備與儀器

高效液相色譜儀（配備紫外檢測(cè)器、熒光檢測(cè)器），美國(guó)Agilent公司，超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀（配備ESI源、TSQ ENDURA三重四極桿），美國(guó)ThermoFisher公司。

分析天平（感量0.1 mg）、pH計(jì)（精度0.01），瑞士Mettler Toledo公司；離心機(jī)（轉(zhuǎn)速≥4 000 r/min），德國(guó)Sigma公司；電熱恒溫干燥箱（溫度可達(dá)121 ℃），美國(guó)Thermo Fisher公司；恒溫水浴鍋（可控溫37 ℃），常州普天儀器制造有限公司；分光光度計(jì)，日本日立集團(tuán)；超聲波振蕩器，昆山市超聲儀器有限公司；渦旋混合器，德國(guó)IKA公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

采用的國(guó)標(biāo)方法有：中華人民共和國(guó)食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB 5009.84-2016第一法（維生素B1），GB 5009.85-2016第一法（維生素B2），GB 5009.89-2016第二法（維生素B3），GB 5009.154-2016第一法（維生素B6）。

采用的國(guó)際方法有：AOAC Official Methods 2015.14。

為避免實(shí)驗(yàn)室間引起的誤差所涉及的所有標(biāo)準(zhǔn)方法驗(yàn)證和實(shí)際樣品檢測(cè)均在同一實(shí)驗(yàn)室（具備CNAS實(shí)驗(yàn)室認(rèn)可資質(zhì)）進(jìn)行。方法間差異的探究依次從方法間性能評(píng)價(jià)、顯著性檢驗(yàn)、等效性檢驗(yàn)、方法差異對(duì)照實(shí)驗(yàn)逐步展開。

2 結(jié)果與討論

實(shí)驗(yàn)室對(duì)維生素B1、B2、B3、B6的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)和國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)AOAC Officials Methods 2015.14進(jìn)行了方法驗(yàn)證，首先獲得了相應(yīng)的方法性能參數(shù)，在保證所有方法均滿足檢測(cè)要求之后，開始了對(duì)樣品進(jìn)行比對(duì)實(shí)驗(yàn)分析。

對(duì)于所有樣品的檢測(cè)結(jié)果，以項(xiàng)目對(duì)應(yīng)分組，每組數(shù)據(jù)采用t檢驗(yàn)法的進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，從而檢驗(yàn)方法差異的顯著性，同時(shí)對(duì)方法等效性進(jìn)行分析。

2.1 方法技術(shù)指標(biāo)評(píng)價(jià)

方法技術(shù)指標(biāo)評(píng)價(jià)可以通過(guò)比較參與比較的一組方法的實(shí)驗(yàn)室內(nèi)精密度進(jìn)行，采用F檢驗(yàn)法，實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)5個(gè)標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行方法驗(yàn)證，結(jié)果均滿足檢測(cè)需求，其中所有方法精密度驗(yàn)證標(biāo)準(zhǔn)偏差如表1所示，精密度實(shí)驗(yàn)采用7平行實(shí)驗(yàn)，自由度為6。

表1 方法精密度評(píng)價(jià)Table 1 Method precision evaluation

查表可知，F(xiàn)0.05(6,6)=5.82，故F0.95(6,6)=0.17。由表1所示，維生素B1滿足F0.95(6,6)＜Fr＜F0.05(6,6)，因此沒有證據(jù)表明維生素B1國(guó)標(biāo)第一法和AOAC方法在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)精密度上有顯著差異；而對(duì)于維生素B2、維生素B3、維生素B6均存在Fr＞F0.05/2(6,6)，也就是說(shuō)，對(duì)于這三種維生素兩種方法均有顯著差異，維生素B2國(guó)標(biāo)第一法、維生素B3國(guó)標(biāo)第二法在實(shí)驗(yàn)室精密度上均優(yōu)于AOAC方法，維生素B6國(guó)標(biāo)第一法在實(shí)驗(yàn)室精密度上不及AOAC方法。

2.2 檢測(cè)結(jié)果評(píng)價(jià)

2.2.1 顯著性檢驗(yàn)

采用國(guó)標(biāo)方法與AOAC方法分別對(duì)8組樣品進(jìn)行檢測(cè)，每個(gè)指標(biāo)的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均兩兩成對(duì)，可采用成對(duì)樣本t檢驗(yàn)分析，采用統(tǒng)計(jì)工具SPSS 23對(duì)表2的實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，分析結(jié)果見表2所示。

表2 維生素B1、B2、B3、B6顯著性檢驗(yàn)Table 2 Significance test of vitamin B1, B2, B3 and B6 (mg/100 g)

表中的p代表顯著性水平概率，從表2中可見，維生素B1、維生素B3、維生素B6的國(guó)標(biāo)方法和AOAC方法p均大于0.05，也就是說(shuō)這三種維生素采用國(guó)標(biāo)方法和AOAC方法不具顯著性差異；而維生素B2的國(guó)標(biāo)方法和AOAC方法p=0.041＜0.05，因此證明維生素B2的國(guó)標(biāo)方法和AOAC方法存在顯著性差異。

2.2.2 維生素B2等效性檢驗(yàn)

對(duì)方法進(jìn)行等效性檢驗(yàn)引用了醫(yī)藥學(xué)檢驗(yàn)常用的雙向單側(cè)t檢驗(yàn)法（TOST）進(jìn)行分析。TOST法首先需要設(shè)立參比組和試驗(yàn)組，并設(shè)立等效邊界（即等效上限和等效下線）才能使整個(gè)檢驗(yàn)具有意義。對(duì)于等效邊界的設(shè)定，可以參考對(duì)應(yīng)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法或者通過(guò)Horwitz方程[14]進(jìn)行計(jì)算。

由于維生素B1、維生素B3、維生素B6這三個(gè)指標(biāo)采用對(duì)應(yīng)國(guó)標(biāo)方法和AOAC方法并沒有顯著差異，結(jié)果趨于一致，而維生素B2兩種檢測(cè)方法的檢測(cè)結(jié)果存在顯著性差異，因此，對(duì)維生素B2需進(jìn)行進(jìn)一步考察。采用AOAC方法和GB 5009.85-2016第一法對(duì)同一樣品進(jìn)行增大樣本檢測(cè)，以GB法為參比組，AOAC法為試驗(yàn)組，進(jìn)行Horwitz邊界計(jì)算，實(shí)驗(yàn)結(jié)果和計(jì)算結(jié)果統(tǒng)計(jì)如表3。

表3 維生素B2等效性檢驗(yàn)數(shù)據(jù)Table 3 Equivalence test data of vitamins B2

通過(guò)對(duì)不同等效邊界進(jìn)行TOST分析，以顯著差異概率p值作為結(jié)果，分析結(jié)果如表4所示。從表中結(jié)果可以看出，當(dāng)以目標(biāo)值的±5%、±10%、±15% GB為等效邊界時(shí)，AOAC的檢測(cè)結(jié)果均不落在邊界范圍以內(nèi)，可不進(jìn)行下一步AOAC檢測(cè)結(jié)果與兩側(cè)等效邊界的t檢驗(yàn)，而GB 5009.85-2016第一法對(duì)于維生素B2的檢測(cè)精密度要求為10%，因此，在此情況下，AOAC 2015.14與GB 5009.85-2016第一法不等效；當(dāng)以Horwitz計(jì)算結(jié)果作為邊界時(shí)（目標(biāo)值±7.066%），AOAC的檢測(cè)結(jié)果同樣也均不落在邊界范圍以內(nèi)，因此，在此情況下AOAC 2015.14與GB 5009.85-2016第一法仍不等效。此外，從表2、表3的實(shí)驗(yàn)結(jié)果還可以看出，AOAC法維生素B2的檢測(cè)結(jié)果普遍偏高于國(guó)標(biāo)檢測(cè)結(jié)果。

表4 維生素B2 TOST分析結(jié)果Table 4 TOST analysis results of vitamins B2

2.3 維生素B2方法差異分析

從檢測(cè)方法原理上觀察，維生素B2國(guó)標(biāo)第一法采用了液相色譜法，樣品通過(guò)在弱酸(稀鹽酸)的環(huán)境中水解，然后調(diào)節(jié)pH值至6.0～6.5，再通過(guò)蛋白酶和淀粉酶進(jìn)行酶解，從而釋放出維生素B2，最后經(jīng)過(guò)高效液相色譜熒光檢測(cè)器檢測(cè)，國(guó)標(biāo)方法所適用的樣品為各類食品；而AOAC法是液質(zhì)法，前處理過(guò)程則是通過(guò)事先配制pH值4.0～4.5的混合酶液，通過(guò)酶液稀釋并過(guò)夜酶解樣液，最后再次稀釋便可進(jìn)樣分析，AOAC方法所適用的樣品為嬰幼兒配方乳粉和相關(guān)營(yíng)養(yǎng)品。

對(duì)于維生素B2檢測(cè)前處理過(guò)程中，最值得關(guān)注的差異點(diǎn)為兩種方法所使用的酶。國(guó)標(biāo)方法采用了木瓜蛋白粉和高峰淀粉酶，AOAC方法使用的是木瓜蛋白粉、α-淀粉酶、以及酸性磷酸酶，AOAC方法中有說(shuō)明酸性磷酸酶的作用是水解蛋白質(zhì)和復(fù)合碳水化合物，并將磷酸結(jié)合態(tài)維生素轉(zhuǎn)為游離態(tài)。其中酸性磷酸酶的有無(wú)為兩種方法的關(guān)鍵差異點(diǎn)。為探究酸性磷酸酶的有無(wú)是否會(huì)顯著影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果，本研究又繼續(xù)設(shè)計(jì)了三輪對(duì)照實(shí)驗(yàn)。

2.3.1 配方乳粉基質(zhì)AOAC法酸性磷酸酶有無(wú)使用對(duì)照實(shí)驗(yàn)

第一輪實(shí)驗(yàn)為AOAC法酸性磷酸酶對(duì)照實(shí)驗(yàn)。完全按照AOAC實(shí)驗(yàn)方法對(duì)嬰幼兒配方乳粉樣品進(jìn)行維生素B2的檢測(cè)，并將該組實(shí)驗(yàn)設(shè)置為參比組（Reference Group）；不加酸性磷酸酶，其余步驟按照AOAC實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行，該組實(shí)驗(yàn)設(shè)置為試驗(yàn)組（Test Group）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1所示。

圖1 第一輪實(shí)驗(yàn)比對(duì)情況(n=2)Fig.1 Comparison of the first round of experiments (n=2)

結(jié)果顯示，對(duì)嬰幼兒配方牛奶粉（Formula Cow Milk Powder），AOAC方法是否添加酸性磷酸酶影響較小，添加酸性磷酸酶和不添加酸性磷酸酶的維生素B2檢測(cè)結(jié)果不具顯著性差異（p=0.57＞0.05），而對(duì)于嬰幼兒配方羊奶粉（Formula Goat Milk Powder），添加酸性磷酸酶維生素B2檢測(cè)結(jié)果普遍高于未添加酸性磷酸酶的檢測(cè)結(jié)果，且差異顯著（p=0.00＜0.05）。這表明嬰幼兒配方羊奶粉（Formula Goat Milk Powder）可能有磷酸結(jié)合態(tài)維生素B2的存在。

2.3.2 配方乳粉基質(zhì)國(guó)標(biāo)第一法酸性磷酸酶有無(wú)使用對(duì)照實(shí)驗(yàn)

第二輪實(shí)驗(yàn)為國(guó)標(biāo)第一法酸性磷酸酶對(duì)照實(shí)驗(yàn)。完全按照GB第一法對(duì)嬰幼兒配方乳粉樣品進(jìn)行維生素B2的檢測(cè)，并將該組實(shí)驗(yàn)設(shè)置為參比組（Reference Group）；不加酸性磷酸酶，pH調(diào)節(jié)為4.0～4.5，其余步驟按照國(guó)標(biāo)第一法進(jìn)行，該組實(shí)驗(yàn)設(shè)置為試驗(yàn)組1（Test Group 1）；添加酸性磷酸酶，其余步驟按照國(guó)標(biāo)第一法實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行，該組實(shí)驗(yàn)設(shè)置為試驗(yàn)組2（Test Group 2）；添加酸性磷酸酶，pH值調(diào)節(jié)為4.0～4.5，其余步驟按照國(guó)標(biāo)第一法實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行，該組實(shí)驗(yàn)設(shè)置為試驗(yàn)組3（Test Group 3）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2所示。

圖2 第二輪實(shí)驗(yàn)比對(duì)情況(n=2)Fig.2 Comparison of the second round of experiments (n=2)

結(jié)果顯示，對(duì)嬰幼兒配方乳粉基質(zhì)，前處理酶解環(huán)境pH值在4.0～4.5之間和在6.0～6.5之間對(duì)于維生素B2的檢測(cè)結(jié)果沒有明顯差異（參比組和試驗(yàn)組1，試驗(yàn)組2和試驗(yàn)組3），在固定pH的情況下添加酸性磷酸酶，對(duì)于嬰幼兒配方牛奶粉而言，維生素B2檢測(cè)結(jié)果略微有提升，而對(duì)于嬰幼兒配方羊奶粉而言，添加酸性磷酸酶的檢測(cè)結(jié)果比不添加酸性磷酸酶的檢測(cè)結(jié)果高出11.87%。再次證明了乳粉基質(zhì)中有磷酸結(jié)合態(tài)維生素B2的可能，而且酸性磷酸酶在維生素B2的檢測(cè)前處理過(guò)程中能夠釋放出該中狀態(tài)的維生素B2。

2.3.3 液態(tài)純牛奶、純羊奶AOAC法酸性磷酸酶有無(wú)使用對(duì)照實(shí)驗(yàn)

圖3 第三輪實(shí)驗(yàn)比對(duì)情況(n=2)Fig.3 Comparison of the third round of experiments (n=2)

考慮到嬰幼兒配方乳粉中的維生素B2有在生產(chǎn)過(guò)程中進(jìn)行強(qiáng)化的可能性，第三輪實(shí)驗(yàn)將以液態(tài)純牛奶（Pure Cow Milk）和液態(tài)純羊奶（Pure Goat Milk）進(jìn)行考察。本輪實(shí)驗(yàn)采用AOAC法為檢測(cè)方法，針對(duì)液態(tài)純牛奶、液態(tài)純羊奶進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，以完全按照AOAC方法檢測(cè)為參比組（Reference Group），不添加酸性磷酸酶其余步驟完全按照AOAC方法檢測(cè)為試驗(yàn)組（Test Group），實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3所示。

結(jié)果顯示，對(duì)于液態(tài)奶而言，實(shí)驗(yàn)前處理過(guò)程中未添加酸性磷酸酶時(shí)維生素B2的檢測(cè)結(jié)果低于添加了酸性磷酸酶的參比組，而且兩組數(shù)據(jù)存在顯著性差異（p=0.02＜0.05），也就是說(shuō)，在未強(qiáng)化維生素B2的液態(tài)奶中，前處理過(guò)程添加酸性磷酸酶能夠顯著提高維生素B2的檢測(cè)結(jié)果，也證明了液態(tài)奶中存在著磷酸結(jié)合態(tài)的維生素B2，且酸性磷酸酶在檢測(cè)前處理過(guò)程中發(fā)揮了作用。

3 結(jié)論

本研究先后通過(guò)方法驗(yàn)證、精密度評(píng)估、顯著性差異分析、TOST檢驗(yàn)等方式對(duì)GB 5009.84-2016第一法（維生素B1）、GB 5009.85-2016第一法（維生素B2）、GB 5009.89-2016第二法（維生素B3）、GB 5009.154-2016第一法（維生素B6）和AOAC 2015.13進(jìn)行等效性分析，分析結(jié)果表明：就乳粉基質(zhì)而言，維生素B1的國(guó)標(biāo)第一法與AOAC方法等效；維生素B2的國(guó)標(biāo)第一法與AOAC方法不等效；維生素B3的國(guó)標(biāo)第二法與AOAC方法等效，但國(guó)標(biāo)方法的精密度優(yōu)于AOAC方法；維生素B6的國(guó)標(biāo)第一法與AOAC方法等效，但AOAC方法的精密度優(yōu)于國(guó)標(biāo)方法。另外，對(duì)于維生素B2而言，AOAC 2015.13方法與GB 5009.85-2016第一法存在顯著差異，這體現(xiàn)在酸性磷酸酶這一變量上，對(duì)于乳和乳粉樣品，存在磷酸結(jié)合態(tài)維生素B2，實(shí)驗(yàn)前處理過(guò)程中添加酸性磷酸酶可以釋放出磷酸結(jié)合態(tài)維生素B2從而提升維生素B2的檢測(cè)結(jié)果，進(jìn)而可以得到更接近真實(shí)的維生素B2含量結(jié)果。此外，在研究過(guò)程中還發(fā)現(xiàn)采用超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法檢測(cè)乳粉中多種維生素有著更高的檢測(cè)效率，是乳粉檢測(cè)值得發(fā)展的方向。