查 帆，李倩文，孫廣祿，余子豪，王曉潔，余旭平

（浙江大學動物科學學院，浙江 杭州 310058）

豬繁殖與呼吸綜合征（Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS）是由PRRS 病毒（PRRSV）引起的豬傳染病。世界動物衛(wèi)生組織（OIE）將其列為法定報告動物疫病，也是我國重點防范的動物疫病。根據(jù)基因組和抗原性差異，PRRSV 分為歐洲型（I 型）和美洲型（II 型），兩者基因組同源性僅55%～70%[1-3]。在我國的流行株主要為美洲型，且美洲株毒力強、傳播速度快、死亡率高，因此需要建立快速檢測美洲型PRRSV 的檢測方法。

現(xiàn)有報道的PRRSV 熒光定量PCR 檢測方法通常只設計一對引物進行優(yōu)化，而PRRSV 易變異[4]，盡管選取保守區(qū)設計引物，但該區(qū)域基因序列仍存在變異的可能性，為此本研究團隊前期針對美洲型PRRSV ORF6 篩選了3 對擴增效果較優(yōu)引物，本研究建立了基于3 對引物的SYBR Green I 熒光定量PCR 方法，以期通過增加引物覆蓋面，提高檢測結果的可靠性和準確性。

1 材料與方法

1.1 主要實驗材料美洲型PRRSV CH-1R 株cDNA、大腸桿菌JM109 菌株、豬圓環(huán)病毒2 型（PCV2）和偽狂犬病毒（PRV）DNA、豬瘟病毒（CSFV）和歐洲型PRRSV 弱毒株cDNA 均由本實驗室保存；DL1000 DNA Marker、dNTP、PremixTaq、pMD18-T 載 體 均購自寶生物工程（大連）有限公司；T4 DNA 連接酶、限制性內切酶均購自New England Biolabs 公司；質粒DNA 提取試劑盒、體液病毒DNA/RNA 共提取試劑盒均購自愛思進生物公司；RNA 反轉錄酶、SYBR qPCR Master Mix 酶購自南京諾唯贊生物有限公司；6 份臨床組織樣品來自浙江省不同豬場，已經(jīng)過第三方預檢，分別判定1 號、2 號為HP-PRRSV 感染，3、4、5 號為NADC30-like PRRSV 感染，6 號為經(jīng)典型PRRSV 感染，樣品保存于-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2 引物設計及合成根據(jù)GenBank 中60 株美洲型PRRSV（經(jīng)典型、高致病性、NADC30-like 等）的3'端序列，選擇其保守區(qū)域設計8 對引物，前期通過常規(guī)PCR 篩選出的擴增效果相對最好的3 對引物（擴增區(qū)域均對應于ORF6），引物信息見表1。引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。

表1 引物信息Table 1 Primer information

1.3 重組質粒標準品的構建以PRRSV CH-1R 株的cDNA 作為模板，利用表1 中3 對引物分別進行常規(guī)PCR 擴增相應目的片段。PCR 產(chǎn)物回收純化后連接至pMD18-T 載體，構建重組質粒，經(jīng)鑒定正確后分別命名為pMD-C1、pMD-C2 和pMD-C3。質粒由華大基因公司測序確認序列正確性，測定相應質粒濃度后，稀釋到同一標準濃度作為母液，并計算質粒標準品的拷貝數(shù)，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 熒光定量PCR 反應條件的優(yōu)化以1.3 構建的重組質粒標準品為模板，采用1.2 中的引物，利用方陣法進行熒光定量PCR 反應條件優(yōu)化。采用20 μL反應體系，其中2×SYBR qPCR Master Mix 10 μL、模板2 μL、上下游引物（10 μmol/L）各0.05 μL、0.1 μL、0.2 μL、0.4 μL、0.6 μL、0.8 μL、1.0 μL、1.2 μL，加ddH2O 至20 μL。反應條件為：95 ℃3 min；95 ℃10 s、退火溫度設置65 ℃～69 ℃30 s，72 ℃40 s，40個循環(huán)。進一步采用方陣法對引物濃度和退火溫度進行優(yōu)化，確定該熒光定量PCR 的最佳反應條件。

1.5 熒光定量PCR 標準曲線的建立分別以10 倍倍比稀釋（1.228×108拷貝/μL～1.228×101拷貝/μL）的重組質粒標準品為模板，利用1.2 中的引物和1.4 優(yōu)化后的反應條件進行熒光定量PCR 擴增，獲得相應模板量的Ct 值，通過CFX Manager 軟件繪制Ct 值與質粒標準品拷貝數(shù)間對應關系的標準曲線。

1.6 熒光定量PCR 的特異性試驗分別以PCV2、PRV 的基因組DNA，CSFV 及歐洲型PRRSV 弱毒株的cDNA 和美洲型PRRSV 的重組質粒pMD-C1、pMDC2、pMD-C3作為模板，利用優(yōu)化后的熒光定量PCR反應條件進行擴增，同時設置陰性對照，評估該方法的特異性。

1.7 熒光定量PCR 的敏感性試驗分別以10 倍倍比稀釋（1.228×108拷貝/μL～1.228×100拷貝/μL）的重組質粒標準品為模板，用1.2 中的引物和1.4 優(yōu)化后的條件進行熒光定量PCR 擴增，評估該熒光定量PCR方法的敏感性。同時以上述引物進行常規(guī)PCR 擴增，并參照GB/T 35912-2018 PRRSV 熒光定量RTPCR 國標檢測方法對上述重組質粒標準品進行測定[5]，比較不同方法的檢測敏感性。

1.8 熒光定量PCR 重復性試驗分別以10 倍倍比稀釋（1.228×107拷貝/μL～1.228×104拷貝/μL）的重組質粒標準品為模板，利用1.2 中的引物和1.4 優(yōu)化后的反應條件進行擴增。組內重復性試驗：每個稀釋度設3 個重復，重復檢測3 次，計算平均值、標準差和變異系數(shù)。組間重復性試驗：上述重組質粒標準品連續(xù)檢測3 次，每次間隔1 d，每個稀釋度設3 個重復，計算平均值、標準差和變異系數(shù)，以評估該方法的重復性。

1.9 臨床樣品的檢測將經(jīng)過第三方預檢的6 份豬臨床組織樣品研磨后離心取上清，利用DNA/RNA 共提取試劑盒提取核酸，反轉錄為cDNA 后作為模板，利用本研究建立的熒光定量方法檢測，同時利用常規(guī)PCR 方法和國標熒光定量PCR 方法檢測。對于檢測Ct 值偏差較大的預檢樣品，應用上下游引物擴增并由GenScript 公司測序，對測序結果進行比對，特別關注引物位點的突變情況。

2 結 果

2.1 重組質粒標準品的構建與鑒定結果以PRRSV CH-1R 株的cDNA 為模板，利用1.2 中的3 對引物經(jīng)PCR 擴增出相應大小的片段（圖1），1～3 號引物擴增片段大小分別為441 bp、558 bp、467 bp，結果均與預期一致。將擴增產(chǎn)物克隆至pMD18-T 載體，并經(jīng)測序鑒定，測序結果與預期相符，結果表明分別正確構建并獲得重組質粒標準品pMD-C1、pMD-C2 和pMD-C3，并計算拷貝數(shù)均為1.228×108拷貝/μL。

圖1 重組質粒標準品的PCR鑒定結果Fig.1 PCR identification results of recombinant plasmids

2.2 熒光定量PCR 反應條件的優(yōu)化結果通過對SYBR Green I 熒光定量PCR 反應條件的優(yōu)化，確定1 號和2 號引物20 μL 反應體系為：2×SYBR qPCR Master Mix 酶10 μL，10 μmol/L 上、下 游 引 物 各0.2 μL，模板2 μL，加ddH2O 至20 μL。3 號引物20 μL 反 應 體 系 為：2×SYBR qPCR Master Mix 酶10 μL，10 μmol/L 上、下游引物各0.4 μL，模板2 μL，加ddH2O 至20 μL。反 應 程 序 均 為：95 ℃3 min；95 ℃10 s、68 ℃30 s、72 ℃40 s，40 個循環(huán)。

2.3 熒光定量PCR 標準曲線的建立分別以10 倍倍比稀釋（1.228×108拷貝/μL～1.228×101拷貝/μL）的重組質粒標準品pMD-C1、pMD-C2、pMD-C3 為模板，利用2.2 優(yōu)化后的反應條件進行SYBR Green I 熒光定量PCR 擴增，以模板拷貝數(shù)的對數(shù)為X 軸，Ct值為Y 軸繪制標準曲線。結果顯示，基于1 號引物繪制的標準曲線的回歸方程為y=-3.480x+43.815，相關系數(shù)（R2）為0.992；基于2號引物繪制的標準曲線的回歸方程為y=-3.721x+42.012，相關系數(shù)（R2）為0.999；基于3 號引物繪制的標準曲線回歸方程為y=-3.599x+41.919，相關系數(shù)（R2）為0.999（圖2）。表明熒光定量Ct值與重組質粒標準品濃度之間存在良好的線性關系。

圖2 熒光定量PCR 方法的標準曲線Fig.2 Standard curves of the real-time PCR

2.4 熒光定量PCR 特異性試驗結果以PCV2、PRV的基因組DNA，CSFV、歐洲型PRRSV 弱毒株cDNA和美洲型PRRSV 重組質粒標準品pMD-C1、pMDC2、pMD-C3 為模板，采用建立的SYBR Green I 熒光定量PCR 方法進行擴增。結果顯示僅美洲型PRRSV質粒標準品出現(xiàn)特異性擴增，其他病毒及陰性對照均為陰性（圖3），表明建立的方法特異性較強。

圖3 熒光定量PCR方法的特異性試驗結果Fig.3 Specificity test of the real-time PCR assay

2.5 熒光定量PCR 敏感性試驗結果分別以10 倍倍比稀釋（1.228×108拷貝/μL～1.228×100拷貝/μL）的重組質粒標準品pMD-C1、pMD-C2、pMD-C3 為模板，分別采用建立的SYBR Green I 熒光定量PCR 方法、國標熒光定量PCR 方法和常規(guī)PCR 方法擴增，熒光定量PCR 結果顯示，3 對引物的檢測下限均為1.228×101拷貝/μL（圖4A）；與國標熒光定量PCR 方法檢測結果的敏感性相同（圖4B）；常規(guī)PCR 結果顯示，1 號引物的檢測下限為1.228×103拷貝/μL；2 號、3 號引物的檢測下限為1.228×104拷貝/μL（圖4C）。表明本研究建立的方法敏感性較高，與國標方法相當，但比常規(guī)PCR 方法高100 倍和1 000 倍。經(jīng)多次重復試驗，發(fā)現(xiàn)基于這3 對引物的熒光定量PCR 方法在檢測1.228×100拷貝/μL 質粒模板及陰性（純水）時，在40 個循環(huán)內未檢測到擴增熒光信號（無Ct 值，即Ct值大于40.0），因此本研究將40 個循環(huán)內是否出現(xiàn)Ct值作為陰陽性的判定標準。

圖4 熒光定量PCR方法的敏感性試驗結果Fig.4 The results of sensitivity analysis

2.6 熒光定量PCR 重復性試驗結果分別以10 倍倍比稀釋后（1.228×107拷貝/μL～1.228×104拷貝/μL）的重組質粒標準品pMD-C1、pMD-C2、pMD-C3 為模板，利用優(yōu)化后的條件進行組內與組間重復性試驗。結果顯示，3 對引物的組內與組間重復性試驗的變異系數(shù)均小于2%（表2），表明建立的方法重復性較好。

表2 熒光定量PCR方法的重復性試驗結果Table 2 The repeatability test of the real-time PCR

2.7 臨床樣品的檢測結果利用建立的SYBR Green I熒光定量PCR方法和常規(guī)PCR方法分別對經(jīng)過第三方預檢的6 份豬臨床樣品進行檢測，結果顯示，熒光定量PCR 方法的陽性檢出率均為100%（6/6）。常規(guī)PCR 方法檢測的陽性率分別為50%（3/6）、50%（3/6）、83.3%（5/6），進一步表明本研究建立的SYBR Green I熒光定量PCR 檢測方法比常規(guī)PCR 方法敏感性更高。國標熒光定量PCR 方法的陽性檢出率為100%（6/6），從檢出率角度看，本實驗建立的熒光定量PCR方法與國標方法相當。檢測結果顯示，同一樣品經(jīng)不同引物擴增的Ct 值有差異：可能經(jīng)典株的突變率相對較低，3對引物擴增6號樣品的Ct 值基本相當；而1號、2號引物擴增3、4、5 號樣品（NADC30-like 樣品）均出現(xiàn)了Ct 值偏高的現(xiàn)象（檢測3 號樣品1 號引物偏高，4 號樣品2 號引物偏高，5 號樣品1 號、2 號引物均偏高）；對于HP-PRRSV 樣品，3 對引物檢測2 號樣品的Ct 值基本相當，2 號引物檢測1 號樣品出現(xiàn)Ct 值偏高的現(xiàn)象。利用國標熒光定量PCR方法對樣品的平行檢測結果顯示，其對5 號樣品檢測也出現(xiàn)了Ct 值偏高的現(xiàn)象，相對地不如本實驗基于3號引物的方法（表3）。對ORF6測序結果顯示，1、3、4、5號預檢樣品的ORF6基因序列在對應引物位置出現(xiàn)了堿基突變，同一樣品經(jīng)不同引物擴增的Ct值出現(xiàn)明顯偏差是引物結合位點有一定突變的結果。

表3 熒光定量PCR檢測預檢樣品的結果Table 3 Detection of pre-tested field samples by real-time PCR

3 討 論

PRRSV 易發(fā)生突變與重組，加之豬場廣泛使用包括經(jīng)典和高致病性PRRSV 的多種疫苗，因此PRRS的防控異常復雜[6-8]。PRRS 的防控需要可靠的檢測方法，熒光定量PCR 直接檢測病毒核酸，具有快速、敏感性高、可定量等優(yōu)點。其中SYBR Green I 方法，相比較于TaqMan 探針法，僅設計2 條上下游引物，省略中間雜交探針的設計與合成，相對簡單且價格便宜。

SYBR Green I 法熒光定量PCR 檢測的是總核酸量，因此保證擴增產(chǎn)物的特異性唯一性尤為重要，本研究前期實驗針對GenBank 中不同基因亞型的60 株美洲型PRRSV 3'端序列保守區(qū)設計8 對引物，以PRRSV CH-1R 株、JXA1-R 株cDNA 為模板，經(jīng)常規(guī)PCR 篩選特異擴增單一條帶（甚至無引物二聚體）效果較好的3 對引物，在此基礎上，摸索條件，建立了3 對引物的熒光定量PCR 方法。實驗結果顯示，建立的3 條標準曲線線性關系良好，檢測下限達101拷貝/μL，與國標方法相當，較常規(guī)PCR（103拷貝/μL與104拷貝/μL）敏感性提高100 倍以上，變異系數(shù)小于2%，重復性和特異性均較好。本研究建立的熒光定量PCR 方法的敏感性是王小武等依據(jù)PRRSV N 基因建立的通用檢測經(jīng)典株和高致病性病毒株熒光定量RT-PCR 方法（102拷貝/μL）的10 倍[9]；與侯月娥、伍建敏等[10]利用TaqMan 探針及楊峰、周宏超等[11]利用EvaGreen 染料建立的PRRSV 熒光定量PCR 方法（101拷貝/μL）的敏感性相當。

利用建立的熒光定量PCR 方法初步檢測了經(jīng)過第三方預檢的6 份樣品，結果顯示，盡管3 對引物均能100%檢出，但也發(fā)現(xiàn)同一樣品不同引物檢測的Ct值出現(xiàn)明顯偏差，如1 號引物檢測3 號樣品（36.16）和5 號樣品（37.72）Ct 值偏高；2 號引物檢測1 號樣品（33.94）、4 號樣品（36.99）和5 號樣品（37.75）Ct 值偏高。經(jīng)測序確認，對應樣品PRRSV ORF6 基因的引物位置序列出現(xiàn)堿基突變。6 個樣品的檢測結果顯示，3 號引物相對較好，但如果檢測的樣品數(shù)量較多，則不能保證因突變的隨機性，也有導致3 號引物擴增樣品后出現(xiàn)Ct 值偏高的可能性。同樣，國標方法的檢測結果顯示，國標方法總體上優(yōu)于1 號、2號引物的熒光定量PCR 方法，但略遜于3 號引物的方法，特別是檢測5 號樣品時，也出現(xiàn)了引物結合力下降問題，其Ct 值偏高為35.92，而3 號引物檢測5 號樣品時Ct 值為30.93（對應1 號引物和2 號引物擴增的Ct 值也偏高，分別為37.72 和37.75）。

本研究建立3 對引物熒光定量PCR 方法的初衷是盡量減少因某一對引物的結合位點突變而可能導致漏檢、定量不準的問題。相對于僅使用1 對引物，3 對引物增加了引物序列的覆蓋面，降低了漏檢錯檢的可能性。采用3 對引物檢測某一樣品（在排除實驗室污染的前提下）時，若出現(xiàn)了某1 對引物的檢測結果為陽性，該樣品即判定為陽性樣品。實際檢測時，可用3 對引物（甚至更多對，包括國標引物）預檢，選取效果最好（Ct 值最小且穩(wěn)定）的引物對這一批次樣品進一步檢測和定量。鑒于PRRSV 易變異的特點，本研究建立的3 對引物的熒光定量PCR 方法，為PRRS 的防控與檢測提供了思路和技術支持。