徐 偉，施 慧，汪 瑋*，張鼎元，許文軍，柴學(xué)軍

（1.浙江海洋大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，浙江 舟山 316022；2.浙江省海洋水產(chǎn)研究所浙江省海水增養(yǎng)殖重點實驗室，浙江 舟山 316021）

小黃魚（Larimichthys polyactis），隸屬于石首魚科（Sciaenidae）、黃魚屬（Larimichthys），暖溫性近底層魚類，廣泛分布于黃海、渤海、東海以及朝鮮半島西岸等海域，是我國四大海產(chǎn)之一[1]。隨著其人工養(yǎng)殖規(guī)模的擴大，病害問題日益突出。本研究室近年來先后從網(wǎng)箱養(yǎng)殖小黃魚中分離到殺香魚假單胞菌（Pseudomonas plecoglossicida）、虹彩病毒（Iridoviruses）、淀粉卵甲藻（Amyloodinium ocellatum）、刺激隱核蟲（Cryptocaryon irritans）、盾纖毛蟲（Scuticociliatida ciliates）等石首魚科常見病原。

海豚鏈球菌（Streptococcus iniae）是一種重要的水生動物病原菌，主要引起魚類腦膜炎和敗血癥等[2]。海豚鏈球菌宿主廣泛，現(xiàn)已報道的感染海豚鏈球菌的魚類多達30 余種，其中包括羅非魚（Tilapia）[3]、黃顙魚（Pelteobagrus fulvidraco）[4]、牙鲆（Paralichthys olivaceus）[5]、尖 吻 鱸（Lates calcarifer）[6]、卵 形 鯧 鲹（Trachinotus ovatus）[7]、高首鱘（Acipenser transmontanus）[8]等重要的淡水及海水經(jīng)濟魚類。但迄今為止，尚未見小黃魚感染海豚鏈球菌的報道。

2020 年9 月，舟山地區(qū)網(wǎng)箱養(yǎng)殖小黃魚出現(xiàn)持續(xù)性死亡，一周內(nèi)累計死亡率達20%，發(fā)病魚主要癥狀與海豚鏈球菌感染癥狀相似，表現(xiàn)為體色發(fā)黑，眼周充血或眼球突出，鰭條出血，解剖可見腦和肝臟部位嚴重充血。本研究對采集的小黃魚發(fā)病樣品進行病原學(xué)及組織病理學(xué)分析，以期查明該暴發(fā)性疾病的病因，為網(wǎng)箱養(yǎng)殖小黃魚的病害防控提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要實驗材料50 余尾患病小黃魚來自舟山登步島小黃魚網(wǎng)箱養(yǎng)殖點；健康小黃魚由浙江省海洋水產(chǎn)研究所西軒實驗基地育苗車間提供，體長15 cm～20 cm，平均體質(zhì)量50 g～75 g，實驗前隨機取5 尾魚進行細菌、病毒和寄生蟲檢測，確認無病原攜帶。

血瓊脂培養(yǎng)基購自廣東環(huán)凱生物科技有限公司；常規(guī)胰蛋白胨大豆瓊脂（TSA）細菌培養(yǎng)基和藥敏紙片購自杭州微生物試劑有限公司；10×ExTaqBuffer（2.5 mmol/L），ExTaq酶（5 U/μL）、DL2000 DNA Marker、細菌基因組提取試劑盒均購自TaKaRa 公司；API 20 Strep 試劑盒購自生物梅里埃法國股份有限公司；MS-222購自河南南華千牧生物科技有限公司。

1.2 發(fā)病小黃魚的組織病理學(xué)觀察取自然發(fā)病有典型病征的瀕死小黃魚的腦、肝、脾、腎組織，切成約0.5 cm×1 cm×0.5 cm 的小塊，Bouin 氏液固定24 h，經(jīng)75%乙醇沖洗數(shù)次后利用梯度濃度酒精脫水，移入二甲苯溶液中透明，石蠟包埋切片，HE 染色，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察各組織病理變化。

1.3 病原菌的分離純化將1.2 病變組織剪碎后于常規(guī)細菌培養(yǎng)基（TSA）和血瓊脂培養(yǎng)基上劃線，28 ℃培養(yǎng)24 h～48 h 后，選取優(yōu)勢單菌落進行純化培養(yǎng)后接種于血瓊脂培養(yǎng)基，28 ℃培養(yǎng)48 h，挑單菌落經(jīng)革蘭氏染色，顯微鏡下觀察細菌的形態(tài)特征。

1.4 分離菌的生化鑒定用無菌生理鹽水將血平板上培養(yǎng)的分離菌制成菌懸液，利用API 20 Strep 試劑盒對其進行生化鑒定。

1.5 動物回歸試驗將健康小黃魚暫養(yǎng)于700 L 養(yǎng)殖桶中，水溫為23 ℃±1 ℃，每日換水70%，連續(xù)充氣，每日投餌1 次，馴化一周。利用麥氏比濁法將分離菌株分別調(diào)整至1×105cfu/mL～1×109cfu/mL。將實驗魚分為6 組，每組12 尾，1～5 組分別腹腔注射上述稀釋度的菌液100 μL，第6 組為對照組，注射等量無菌生理鹽水。觀察統(tǒng)計一周內(nèi)魚的發(fā)病和死亡情況，用寇氏法計算半數(shù)致死劑量（LD50）。用漁用麻醉劑MS-222 對瀕死魚麻醉后剖殺觀察剖檢癥狀和細菌再分離。

1.6 分離菌的分子特征鑒定利用細菌基因組提取試劑盒提取分離菌的全基因組DNA 為模板，參照文獻[9]，采用細菌16S rRNA 基因通用引物27F/1492R進行PCR 擴增，PCR 產(chǎn)物由上海華大基因科技有限公司測序，利用NCBI 中BLAST 在線軟件對測序結(jié)果進行同源性分析；同時參照GenBank 中相關(guān)基因序列，利用MEGA7.0 軟件進行遺傳進化分析，采用鄰接法構(gòu)建該基因的分子發(fā)育樹。

另外，參照文獻[10]，利用PCR 方法擴增lctO基因。PCR 產(chǎn)物由上海華大基因科技有限公司測序后，利用DNAMAN 7 分析軟件比對分析。

1.7 分離菌血清型及毒力基因檢測以分離菌株全基因組DNA 為模板，采用文獻[11]建立的隨機擴增多態(tài)性DNA（RAPD）分型方法分析分離菌株血清型，采用文獻[12，13]中PCR 方法檢測分離菌株毒力基因pgmA、scpI、simA、cpsD、sagA、pdi、cfi。

1.8 分離菌的藥物敏感性試驗采用紙片瓊脂擴散法，參考2020 年美國臨床和實驗室標準化協(xié)會（CLSI）推薦的操作標準及判定方法檢測分離菌對25 種常見藥物的敏感性。

2 結(jié) 果

2.1 自然發(fā)病小黃魚臟器組織的病理變化制備自然發(fā)病典型病征小黃魚腦及臟器組織的病理切片，觀察可見，病魚腦、肝、脾、腎組織出現(xiàn)嚴重病理變化：患病魚肝竇淤血，肝細胞之間界限模糊，空泡化明顯，伴隨有炎性細胞浸潤（圖1A）；脾臟淀粉樣變性，間質(zhì)淤血，大量炎性細胞浸潤（圖1C）；腎臟淤血，腎小管上皮細胞崩解、脫落、管腔變窄；腎小球萎縮（圖1E）；腦組織疏松，毛細血管擴張淤血，伴隨有炎性細胞浸潤（圖1G）。結(jié)果表明患病魚腦及各臟器組織均呈現(xiàn)不同程度的出血及炎癥病變。

圖1 自然感染小黃魚的組織病變觀察（標尺=10 μm）Fig.1 Histological observation for natural infection of small yellow croaker(bar=10 μm)

2.2 病原菌分離與形態(tài)學(xué)觀察經(jīng)純化培養(yǎng)，從患病魚肝臟、腦組織中均分離到優(yōu)勢菌株DB2009001，該菌株在綿羊血瓊脂平板上培養(yǎng)24 h 長出表面光滑、乳白色隆起的菌落，呈β型溶血（圖2A）。革蘭氏染色可見菌體呈球形，鏈狀排列，呈革蘭氏陽性（圖2B）。

圖2 分離菌表型特征Fig.2 Phenotype of isolated strain

2.3 病原菌的生化鑒定生化鑒定結(jié)果顯示，菌株DB2009001 不能水解馬尿酸；七葉靈、精氨酸等水解反應(yīng)陽性，VP 試驗陰性；阿拉伯糖、山梨醇、乳糖、菊糖、棉子糖等產(chǎn)酸反應(yīng)陰性；核糖、甘露醇等產(chǎn)酸反應(yīng)陽性，與S.iniae（ATCC29178）[14]基本一致。根據(jù)《伯杰氏系統(tǒng)細菌學(xué)手冊》關(guān)于典型海豚鏈球菌的特征表述，綜合分離菌株的形態(tài)學(xué)和生化鑒定，初步判定分離菌株為海豚鏈球菌。

2.4 動物回歸試驗結(jié)果將分離的菌株DB2009001以腹腔注射方式感染小黃魚，結(jié)果顯示從感染后第2 d 起，各濃度感染組陸續(xù)出現(xiàn)發(fā)病和死亡，感染前期（1 d～3 d），死亡魚無明顯體表癥狀，解剖見肝臟充血、脾臟腫大；感染后期（4 d～7 d），發(fā)病魚表現(xiàn)出與自然發(fā)病魚類似的病癥，包括眼球充血或突出、腹鰭出血、內(nèi)臟組織充血等。從發(fā)病瀕死的魚肝臟、脾臟、腎臟中均分離到單一的菌株DB2009001。生理鹽水對照組魚在7 d 實驗期內(nèi)均無發(fā)病癥狀。對7 d 內(nèi)各組的死亡情況進行統(tǒng)計，并經(jīng)寇氏法計算出菌株DB2009001對小黃魚的LD50為8.3×104cfu/尾，即LD50為1.66×103cfu/g。結(jié)果表明，菌株DB2009001可引起健康小黃魚發(fā)病及死亡，為該小黃魚暴發(fā)性疾病的致病菌。

2.5 分離菌的分子特征鑒定分離菌株經(jīng)PCR 擴增后獲得約1 400 bp 的16S rRNA 基因片段，測序結(jié)果顯示菌株DB2009001與GenBank中海豚鏈球菌（S.iniae）（ATCC29178）的16S rRNA 基因序列同源性最高，達99.5%。將該基因序列上傳至NCBI，獲得GenBank 登錄號為MW455461。構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹結(jié)果顯示，菌株DB2009001 與S.iniae（ATCC29178）聚為一支（圖3）。對分離菌lctO基因的PCR 擴增結(jié)果顯示，獲得了約870 bp 的單一目的條帶產(chǎn)物，與文獻報道[12]的lctO基因大小一致，測序結(jié)果顯示其與S.iniaeGX005 株（CP032401）lctO基因的同源性達99.6%。上述結(jié)果進一步表明，分離菌株DB2009001 為海豚鏈球菌。

圖3 基于菌株DB2009001 16S rRNA基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree analysis based on 16S rRNA gene sequence of DB2009001 strain

2.6 分離菌的血清型及毒力基因檢測結(jié)果對分離菌株DB2009001 進行RAPD 的PCR 擴增，結(jié)果顯示，從分離菌株提取的總DNA樣本中擴增出約750 bp的目的片段，與Bachrach 等[15]報道的S.iniaeⅠ型特征一致；毒力基因檢測結(jié)果顯示，可擴增出S.iniae的7種主要毒力基因，分別為pgmA、scpI、simA、cpsD、sagA、pdi、cfi（圖4）。上述結(jié)果表明，DB2009001 為S.iniaeⅠ型，且為攜帶多種毒力基因的強毒力株。

圖4 分離菌DB2009001 RAPD及毒力基因的PCR擴增結(jié)果Fig.4 The PCR amplification results of RAPD and virulence genes of DB2009001

2.7 分離菌的藥敏試驗結(jié)果對菌株DB2009001 進行藥敏檢測，結(jié)果顯示，分離菌株對氧氟沙星、新生霉素、四環(huán)素、阿莫西林、氟苯尼考等17 種抗生素敏感，對制霉菌素、慶大霉素、羅紅霉素、妥布霉素等8 種抗生素耐藥（表1）。

表1 分離菌藥敏試驗結(jié)果Table 1 Results for the drug sensitivity test of isolated strain

3 討 論

本研究從患暴發(fā)性疾病的小黃魚中分離到一株S.iniaeDB2009001，并對其病理學(xué)和致病性進行了初步研究，這是首例S.iniae感染小黃魚并引起暴發(fā)性死亡的報道。分離到的菌株DB2009001各項特征均與S.iniae的典型特征吻合。16S rRNA和lctO基因檢測結(jié)果也進一步確定菌株DB2009001為S.iniae。

現(xiàn)有研究表明，S.iniae各菌株之間分型較為復(fù)雜，Barnes 等根據(jù)精氨酸雙水解酶（ADH）測試結(jié)果的不同將S.iniae分為2 種生物型，Ⅰ型為ADH 陽性，Ⅱ型為ADH 陰性[16]。隨后Wang 等發(fā)現(xiàn)，ADH 陽性的菌株在RAPD 擴增中出現(xiàn)750 bp 大小的條帶，而ADH陰性菌株則無法擴增出同樣條帶[11]。然而國內(nèi)學(xué)者對分離自卵形鯧鲹、羅非魚、鱘魚的多株S.iniae的檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ADH陰性的部分菌株也能通過RAPD 擴增出750 bp 條帶，反之，也存在部分ADH 陽性的菌株無法擴增出該特征條帶，因而ADH 屬性與RAPD 檢測結(jié)果之間并無必然聯(lián)系[7,17-18]。本研究分離自小黃魚的菌株DB2009001 經(jīng)生化測試，呈ADH 陽性，同時RAPD 也擴增出750 bp 條帶，這與Barnes 及Bachrach 等建議的S.iniaeⅠ型特征均吻合，綜合上述分類方法判定DB2009001 應(yīng)歸為S.iniaeⅠ型。

S.iniae作為魚類重要致病菌，宿主十分廣泛，對淡水及海水魚類均有侵染力。國內(nèi)報道的感染S.iniae較為嚴重的養(yǎng)殖品種包括羅非魚[3]、牙鲆[5]、卵形鯧鲹[7]、雜交鱘（Hybrid sturgeon）[19]等。值得注意的是，本研究分離的S.iniaeDB2009001與沈智華等[14]報道的菌株均來源于舟山海域養(yǎng)殖網(wǎng)箱，二者均感染石首魚科品種，經(jīng)過對比，二者的生理生化特性也完全相同，并且具有相似的抗菌譜，但該研究未提供完整菌株的16S rRNA信息，本研究無法對二者的進化關(guān)系作進一步比較分析。同時，分離自美國紅魚的S.iniae對美國紅魚、羅非魚的LD50（1.9×107cfu/尾～4.8×108cfu/尾）均遠高于本研究中DB2009001 對小黃魚的LD50（8.3×104cfu/尾），這可能與不同宿主的抗病力差異有關(guān)，另一方面也可能與感染時的水溫、以及菌株毒力的強弱（攜帶的毒力因子差異）有關(guān)。從美國紅魚分離的菌株暴發(fā)流行病的時間為12 月，海水溫度較低（15 ℃左右），而感染小黃魚的菌株暴發(fā)流行的時間則為9 月，海水溫度較高（23 ℃～26 ℃），不同的為水溫提示兩種菌株可能具有不同的致病機制。本研究對菌株DB2009001 的毒力因子檢測結(jié)果顯示，該菌株同時僅攜帶7 種S.iniae重要毒力基因，這一特征與其對小黃魚的低LD50相吻合。

S.iniae侵染不同宿主可表現(xiàn)出不同的臨床癥狀及病理特征，典型的臨床癥狀包括不規(guī)則泳動、食欲減退、體色發(fā)黑、眼球突出、眼角膜渾濁、鰭條及肛門出血，脾、腎腫大、出血，腹腔積液等。本研究發(fā)病小黃魚表現(xiàn)為停食，體色發(fā)黑，眼球突出、眼周充血，解剖可見腦和肝臟出血，這些癥狀與報道的金鯧（Trachinotus ovatus）病癥最為相似[20]。祝璟琳等對感染S.iniae的羅非魚進行了組織病理學(xué)觀察，結(jié)果顯示主要病變表現(xiàn)為全身多組織、器官水腫，出血、變性、壞死以及炎癥反應(yīng)[21]。本研究對患病小黃魚的腦、肝臟、脾臟、腎臟的切片觀察發(fā)現(xiàn)類似的組織淤血、炎性細胞浸潤等病變，其中，腦組織出現(xiàn)明顯的毛細血管擴張、出血，提示該菌株可通過血液循環(huán)，穿透血—腦屏障，進入中樞神經(jīng)系統(tǒng)，這與Amir 等報道的S.iniae侵染途徑一致[22]。

目前，對S.iniae的防治仍以抗生素為主，恩諾沙星、阿莫西林、紅霉素、呋喃唑酮和土霉素等被廣泛用于控制S.iniae感染引起的疾病[2]。盡管不同來源的S.iniae表現(xiàn)出大致相同的抗菌譜，但抗生素等環(huán)境壓力下也產(chǎn)生出具有不同耐藥特性的菌株。本研究的分離菌DB2009001 對四環(huán)素類、β 內(nèi)酰胺類、喹諾酮類、氟苯尼考等藥物敏感，對多肽類、氨基糖苷類等藥物耐藥。針對本次舟山地區(qū)小黃魚S.iniae暴發(fā)性疾病，養(yǎng)殖戶使用了能穿過血腦屏障的氟苯尼考，使疫情得到了有效的控制。

本研究首次報道了S.iniae能夠感染小黃魚，并對其生化特征，耐藥性等初步研究，為小黃魚鏈球菌病的防治提供了參考依據(jù)。