張自強，王佳佳，謝 輝，張 昕，徐靖怡，常趙陽，劉 寧，劉玉梅

（河南科技大學(xué)動物科技學(xué)院，河南 洛陽 471000）

兔呼吸道感染是兔的一種常見疾病，具有多發(fā)性和反復(fù)發(fā)作的特點[1-2]。自2020 年7 月1 日全面禁止在飼料中添加抗生素以來，各地家兔呼吸系統(tǒng)疾病的發(fā)病率和死亡率呈不同程度的上升，對家兔健康養(yǎng)殖造成了嚴(yán)重危害，因此臨床及時采取有效手段治療該病尤為重要。引起家兔呼吸系統(tǒng)疾病的原因較為復(fù)雜，常因地域、氣溫、食物及飼養(yǎng)管理水平的差異而造成家兔不同類型的呼吸系統(tǒng)疾病，其中細菌性感染最為嚴(yán)重[3]。家兔呼吸系統(tǒng)感染的病原菌主要包括肺炎克雷伯氏菌（Klebsiella pneumoniae，Kpn）、支氣管敗血波氏桿菌（Bordetella bronchiseptica，Bb）、多殺性巴氏桿菌（Pasteurella multocida，Pm）、綠膿假單胞桿菌（Pseudomonas aeruginosa，P.aeruginosa）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，S.aureus）、肺炎鏈球菌（Streptococcus pneumoniae，S.pneumoniae）、蠟樣芽胞桿菌（Bacillus cereous，B.cereous）等，其中以Kpn、Bb、Pm 和S.aureus的感染率較高。隨著廣譜抗菌藥物的濫用，抗菌藥所致病原菌的耐藥情況日益嚴(yán)重，給疫病防控帶來了極大困擾。本研究通過對河南地區(qū)部分規(guī)?；脠黾彝煤粑啦≡姆蛛x鑒定及耐藥性分析，可為及時掌握本地區(qū)病原菌的種類及耐藥性，指導(dǎo)臨床用藥，減少耐藥菌株的產(chǎn)生提供科學(xué)支持。

1 材料與方法

1.1 菌株來源2019 年9 月～2021 年9 月來自河南地區(qū)36 個規(guī)?；脠龅暮粑到y(tǒng)感染病例143 例，其中豫東地區(qū)28 例、豫西地區(qū)26 例、豫中地區(qū)23例、豫南地區(qū)20 例、豫北地區(qū)46 例。無菌采集病兔肺臟、氣管等組織，進行病原菌的分離培養(yǎng)及檢測，并且去除同一病兔分離出的重復(fù)菌株。

1.2 主要試劑藥敏紙片、LB 固體培養(yǎng)基和血清瓊脂培養(yǎng)基（含5%新生胎牛血清）購自北京索萊寶科技有限公司；PremixTaqTM（ExTaqTMVersion 2.0 plus dye）購自TaKaRa 公司；Proteinase K、細菌基因組DNA 小量提取試劑盒、DL2000 DNA Maker 購自北京莊盟國際生物基因科技有限公司；溴化乙錠溶液購自蘇州天可貿(mào)易有限公司。

1.3 病原菌的分離、PCR鑒定及結(jié)果的統(tǒng)計 無菌采集病兔肺臟、氣管等組織，分別接種于LB 固體培養(yǎng)基和血清瓊脂培養(yǎng)基（含5%新生胎牛血清），37 ℃培養(yǎng)24 h～36 h 后，觀察菌落的生長情況。挑取疑似菌落經(jīng)革蘭染色，鏡檢。采用平板劃線法純化分離菌種，取純化后的菌液，提取細菌DNA 后作為模板，根據(jù)以往研究結(jié)果，以表1 中的引物進行7 種致兔呼吸系統(tǒng)感染的主要病原菌的PCR 擴增[4]。PCR產(chǎn)物用2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。根據(jù)檢測結(jié)果采用Excel 2016 分析分離菌的種類及其在不同地區(qū)的感染率等。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences used in this study

1.4 分離菌的藥敏試驗采用K-B 紙片擴散法檢測分離菌對10 類22 種藥物的敏感性，依據(jù)美國臨床檢驗標(biāo)準(zhǔn)委員會（NCCLS）2016 年版判定結(jié)果[11]。

2 結(jié) 果

2.1 病原菌的分離鑒定及統(tǒng)計分析結(jié)果將河南地區(qū)36 個規(guī)?；脠龅?43 例呼吸系統(tǒng)感染病例的肺臟、氣管等組織接種LB 固體培養(yǎng)基和血清瓊脂培養(yǎng)基，進行病原菌的分離。結(jié)果顯示，共檢出262 株病原菌。經(jīng)革蘭染色鏡檢后共檢出G+菌103 株（39.31%），G-菌159 株（60.69%）。PCR 鑒定結(jié)果顯示分離的G+菌以S.aureus、S.pneumoniae、B.cereus等為主，其感染率分別為50.35%（72 株）、10.49%（15株）、5.59%（8株）；G-菌以Kpn、Bb、Pm、P.aeruginosa等為主，其感染率分別為41.96%（60 株）、36%（52 株）、19.58%（28 株）、8.39%（12 株）（表2）。表明G+菌中的S.aureus以及G-菌中Kpn、Bb 和Pm 是造成兔呼吸系統(tǒng)感染的主要致病菌，同時也與P.aeruginosa、S.pneumoniae等病原菌密切相關(guān)。其中兩種及多種病原菌混合感染病兔的感染率高達76.22%（109/143）。在病原菌的二重感染病例中，混合感染率最高的組合是S.aureus和Kpn，共23 例（16.08%）。在病原菌的三重感染病例中，混合感染率最高的組 合 是S.aureus、P.aeruginosa和Kpn 以 及S.aureus、P.aeruginosa和Bb，均為6 例（4.2%）（表3）。表明兔呼吸系統(tǒng)多為混合感染，且多為兔S.aureus常與其他病原菌的混合感染，致感染率較高。

表2 家兔呼吸系統(tǒng)主要病原菌的分離鑒定及統(tǒng)計分析Table 2 Distribution and composition of main pathogenic isolates in rabbit respiratory system

表3 病原菌混合感染率的統(tǒng)計Table 3 Statistics of mixed infection rate of pathogenic bacteria mode

不同地區(qū)致家兔呼吸系統(tǒng)疾病感染病原菌的統(tǒng)計分析結(jié)果顯示，豫東地區(qū)28 例病兔共分離到44 株菌，其中主要為S.aureus13 株（29.55%）、Bb 11株（25.00%）、Kpn 8 株（18.18%）、P.aeruginosa4 株（9.09%）、S.pneumoniae3 株（6.82%）、B.cereus3 株（6.82%）、Pm 2 株（4.55%）。豫西地區(qū)26 例病兔共分離到42 株菌，其中主要為Bb 12 株（28.57%）、S.aureus10 株（23.81%）、Kpn 8 株（19.05%）、Pm 4 株（9.52%）、B.cereus4 株（9.52%）、P.aeruginosa2 株（4.76%）、S.pneumoniae2 株（4.76%）。豫中地區(qū)23 例病兔共分離到42 株菌，其中主要為Kpn 16 株（38.10%）、Bb 11 株（26.19%）、S.aureus5 株（11.90%）、S.pneumoniae5株（11.90%）、P.aeruginosa3株（7.14%）、Pm 1 株（2.38%）、B.cereus1 株（2.38%）。豫南20 例病兔共分離到39 株菌，其中主要為S.aureus19株（48.72%）、Bb 10 株（25.64%）、Kpn 4 株（10.26%）、B.cereus3 株（7.69%）、S.pneumoniae2 株（5.13%）、Pm 1 株（2.56%）。豫北地區(qū)46 例病兔共分離到80 株菌，其中主要為S.aureus25 株（31.25%）、Kpn 24 株（30.00%）、Pm 22 株（25.00%）、Bb 8 株（10.00%）、S.pneumoniae3 株（3.75%）（表4）。表明，不同地區(qū)分離的致兔呼吸系統(tǒng)疾病的主要病原菌有明顯差異。

表4 不同地區(qū)家兔呼吸系統(tǒng)主要病原菌的統(tǒng)計分析Table 4 Statistical analysis of main pathogenic bacteria of rabbit respiratory system in different areas of Henan province

2.2 分離的主要G+菌的藥敏試驗結(jié)果藥敏試驗結(jié)果顯示，分離的主要G+菌中的S.aureus耐丁胺卡那、頭孢哌酮、頭孢氨芐、頭孢唑林、氟苯尼考、多粘菌素B 的菌株占比＜50%，對其余抗菌藥物耐藥的菌株≥50%（未檢測的除外），對多肽類的桿菌肽耐藥性高達80%及以上；分離的S.pneumoniae中耐恩諾沙星、復(fù)方新諾明、桿菌肽的菌株＞50%，對其余抗菌素耐藥的菌株均＜50%（未檢測的除外），其中對頭孢菌素類的頭孢哌酮均敏感（表5）。表明，分離的致兔呼吸道疾病的G+菌耐藥較嚴(yán)重。

表5 分離的主要G+菌耐藥情況的統(tǒng)計Table 5 Statistical analysis of drug resistance rate of the isolated main G+bacteria

2.3 分離的主要G-菌的藥敏試驗結(jié)果藥敏試驗結(jié)果顯示，分離的Kpn 中耐哌拉西林、頭孢哌酮、頭孢氨芐、頭孢唑林、呋喃唑酮、多粘菌素B 的菌株占比均＜50%，對其余抗菌藥物耐藥的菌株＞50%（未檢測的除外），其中對恩諾沙星、復(fù)方新諾明、氨芐西林、桿菌肽耐藥的菌株達100%；分離的Bb中耐紅霉素、麥迪霉素、恩諾沙星、復(fù)方新諾明、氨芐西林、頭孢曲松、頭孢唑林、呋喃唑酮、桿菌肽的菌株均＞50%，對其余抗菌藥物耐藥的菌株＜50%（未檢測的除外），其中對哌拉西林、頭孢哌酮均敏感；分離的Pm 中耐慶大霉素、頭孢哌酮、頭孢氨芐、頭孢唑林、氟苯尼考、呋喃唑酮、多粘菌素B、多西環(huán)素、四環(huán)素的菌株均＜50%，對其余抗菌藥物耐藥的菌株均≥50%（未檢測的除外），其中對麥迪霉素、復(fù)方新諾明、桿菌肽耐藥的菌株達100%；分離的P.aeruginosa中耐阿奇霉素、諾氟沙星、環(huán)丙沙星、頭孢哌酮、頭孢唑林、氟苯尼考、多粘菌素B 的菌株均＜50%，對其余抗菌藥物耐藥的菌株均＞50%，其中對紅霉素、氨芐西林、呋喃唑酮、桿菌肽耐藥的菌株達100%（表6）。表明，分離的致兔呼吸道疾病的G-菌耐藥情況較復(fù)雜，且耐藥較嚴(yán)重。

表6 分離的主要G-菌耐藥情況的統(tǒng)計Table 6 Statistical analysis of drug resistance rate of the isolated main G-bacteria

續(xù)表

3 討 論

目前，我國養(yǎng)兔業(yè)發(fā)展迅速，規(guī)?；脠隹焖僭黾?。相關(guān)研究報道，家兔疾病中呼吸道疾病占據(jù)第二，占家兔總疾病的20%以上[12]。呼吸道疾病是規(guī)?；脠龅某Ｒ姴?，病因多為細菌性感染。當(dāng)家兔生活環(huán)境變化，如氣溫突然升降、飼料更換、飼養(yǎng)場所變動以及長時間處于應(yīng)激狀態(tài)時，家兔自身免疫系統(tǒng)功能下降，對致病菌的抵御能力降低，極易引起以鼻炎、肺炎等為主要癥狀的呼吸系統(tǒng)疾病，嚴(yán)重危害家兔的健康養(yǎng)殖[13-15]。因此，及時對兔呼吸系統(tǒng)病例的病原菌進行檢測分析、確定病原菌的耐藥狀況，對家兔疾病防治及臨床制定合理有效的治療方案尤為重要。

本研究的143 只呼吸系統(tǒng)患病兔主要來源于河南地區(qū)36 個規(guī)?；脠觯卜蛛x出262 株病原菌，其中G-菌159 株，占60.69%，其次是G+菌103 株，占39.31%，另外還分離出少部分真菌。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)兔發(fā)生呼吸系統(tǒng)疾病主要集中在溫度變化較大的秋冬季節(jié)以及初春時節(jié)，且各個地區(qū)均有發(fā)生。表明致兔呼吸系統(tǒng)感染的病原菌以G-菌為主，分析原因可能與兔舍秋冬及初春日夜溫差較大，養(yǎng)殖密度大，通風(fēng)不當(dāng)換氣不足，患病兔自身免疫系統(tǒng)功能低下，對致病菌抵御能力較差有關(guān)[16-17]。本研究結(jié)果顯示，分離的G-菌中Kpn、Bb 和Pm 以及G+菌中的S.aureus是河南地區(qū)家兔呼吸系統(tǒng)感染的最主要致病菌，同時其呼吸系統(tǒng)感染也與P.aeruginosa、S.pneumoniae等病原菌密切相關(guān)。通過對河南不同地區(qū)兔呼吸系統(tǒng)感染病原菌的進一步分析，結(jié)果顯示在不同地區(qū)分離的主要病原菌有差異。豫東、豫南和豫北地區(qū)檢出率最高的均為S.aureus，而豫西和豫中地區(qū)檢出率最高的分別為Bb 和Kpn。豫東、豫西、豫中、豫南地區(qū)檢出率前3 的均為S.aureus、Bb和Kpn，但豫北地區(qū)除了S.aureus和Kpn 外，檢出率前3 的還有Pm。除了飼養(yǎng)環(huán)境、飼養(yǎng)管理不同之外，可能也與家兔的品種和飼養(yǎng)周期有關(guān)，與其他地區(qū)飼養(yǎng)育肥兔不同，豫北地區(qū)檢測的樣品多為飼養(yǎng)周期較長的長毛兔。由于長毛兔比其他兔飼養(yǎng)周期長，呼吸道疾病為其常見病、多發(fā)病，且多數(shù)以慢性感染為主，發(fā)病率較高，但死亡率低，易被養(yǎng)殖戶忽視，本研究的統(tǒng)計結(jié)果也顯示豫北地區(qū)致兔呼吸道疾病病原菌較其他地區(qū)多。

現(xiàn)階段主要以抗生素治療兔的呼吸系統(tǒng)感染，但隨著廣譜抗菌藥物的廣泛應(yīng)用，病原菌對抗菌藥物的耐藥性明顯增加，為臨床呼吸系統(tǒng)感染治療增加了難度[18]。相關(guān)研究表明，G+菌對大環(huán)內(nèi)酯類、磺胺類及四環(huán)素類抗菌藥物耐藥比較強，耐藥菌株高達56.10%～97.56%[19]。本研究結(jié)果顯示，G+菌中S.aureus對頭孢菌素類（頭孢哌酮、頭孢氨芐、頭孢唑林）、酰胺醇類（氟苯尼考）及多肽類中的粘菌素B耐藥比較低，耐藥菌株在0～38.10%；而對其他氨基糖苷類、大環(huán)內(nèi)酯類、喹諾酮類、磺胺類、β-內(nèi)酰胺類、硝基呋喃類、四環(huán)素類及多肽類的桿菌肽耐藥比較強，耐藥菌株高達47.83%～100.00%。結(jié)果與相關(guān)研究報道基本一致[19]，表明頭孢菌素類、酰胺醇類以及部分多肽類抗菌藥物對G+菌的抗菌活性最強，頭孢、氟苯尼考以及多粘菌素B 可作為G+菌感染治療的首選藥物，而其他氨基糖苷類、大環(huán)內(nèi)酯類、喹諾酮類、磺胺類、β-內(nèi)酰胺類、四環(huán)素類及多肽類藥物則需要根據(jù)藥敏結(jié)果選擇用藥。

大量研究表明，G-菌（Kpn、Bb、Pm）對喹諾酮類、β-內(nèi)酰胺類、磺胺類和氨基糖苷類藥物的耐藥性比較強[20-22]。而本研究結(jié)果顯示，G-菌中Kpn、Bb和Pm 對多肽類的多粘菌素B的耐藥性最低，耐藥菌株在6.67%～25.00%，而對同樣為多肽類的桿菌肽耐藥的菌株高達100.00%，同時對大環(huán)內(nèi)酯類、喹諾酮類、磺胺類藥物的耐藥性比較強。多粘菌B 可作為G-菌感染治療的首選，而其他氨基糖苷類、大環(huán)內(nèi)酯類、喹諾酮類、磺胺類、β-內(nèi)酰胺類、頭孢菌素類、酰胺醇類、多肽類、四環(huán)素類藥物則應(yīng)根據(jù)藥敏結(jié)果選擇用藥。

本研究結(jié)果還顯示，兩種及多種病原菌混合感染兔的感染率高達76.22%，混合感染十分嚴(yán)重，分析原因可能是家兔被致病菌感染后會造成其機體免疫力下降，環(huán)境中廣泛分布的病原菌和家兔體內(nèi)存在的條件性致病菌很易感染家兔，導(dǎo)致繼發(fā)性感染，所以及時準(zhǔn)確檢測病原和快速有效用藥控制疾病非常重要，根據(jù)藥敏試驗結(jié)果，選擇高敏藥物，并配合環(huán)境消毒、通風(fēng)干燥，對控制疫病的蔓延有重要意義。

本研究通過對河南地區(qū)規(guī)模化兔場致兔呼吸道疾病病原菌的檢測和耐藥性分析，及時掌握了不同呼吸道疾病的發(fā)病狀況和菌株耐藥情況，為河南地區(qū)兔養(yǎng)殖業(yè)呼吸道疾病的診治和用藥提供了參考。