顏 成，崔鵬飛，邢 鑫，谷文麗，張元成，衡武昌，王叢叢，鄧國華，陳化蘭

（中國農業(yè)科學院哈爾濱獸醫(yī)研究所獸醫(yī)生物技術國家重點實驗室/農業(yè)農村部動物流感重點開放實驗室，黑龍江 哈爾濱 150069）

自1966 年在美國的火雞中首次報道以來[1]，H9亞型禽流感病毒（Avian influenza virus，AIV）已在世界范圍內呈地方性流行，特別是在亞洲、中東以及北非和中非部分地區(qū)的家禽中廣泛流行[2]，并且H9亞型AIV 在自然界的野生鳥類中也廣泛分布。1994年，在我國廣東雞群中首次分離到H9N2 亞型AIV，隨后H9 亞型AIV 在我國多地出現，呈現蔓延趨勢，目前已成為我國雞群中流行的最主要亞型AIV[3-4]。當前，H9 亞型AIV 的HA 基因可分為7 個進化分支，其中G1-like 和BJ94-like 是我國流行的主要H9 亞型AIV[2]。H9 亞型AIV 感染可引起家禽產蛋量下降，當與細菌混合感染時常致家禽較高的致死率，給家禽養(yǎng)殖業(yè)造成了重大經濟損失[5]。H9 亞型AIV 也可以跨越種間屏障感染人類，1998 年郭元吉等首次在廣東省流感患者咽喉樣品中分離到H9 亞型AIV[6]，截止2019 年7 月，全球已有59 例人感染H9N2 亞型AIV病例[7]。此外，血清學數據表明在部分地區(qū)的職業(yè)暴露人群中，H9N2 特異性抗體的血清檢測率超過20%[8-9]。

H9 亞型AIV 有多種NA 亞 型組合，其中H9N2 是最常見的亞型，約有98%的H9 亞型AIV 屬于H9N2亞型。到目前為止，H9N8 亞型AIV 出現的頻率極低，GenBank 中僅查詢到8 條數據。2020 年5 月，本研究在廣西某鴨場中分離到一株H9N8 亞型AIV，為了解該病毒的進化起源，本研究對其進行了分子進化分析，并以BALB/c 小鼠為實驗動物模型評價了其對哺乳動物的感染性，為H9 亞型AIV 的流行病學調查提供數據支持。

1 材料與方法

1.1 病毒株與實驗動物本研究所用H9N8 亞型AIV A/duck/Guangxi/S10590/2020（H9N8）株，簡稱DK/GX/S10590/2020 株，由國家禽流感參考實驗室分離、鑒定和保存；10 日齡SPF 雞胚購自國家禽類實驗動物資源庫；6 周齡BALB/c 雌性小鼠購自北京維通利華實驗動物有限公司。

1.2 主要試劑病毒RNA 提取試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司；M-MLV 反轉錄酶及RNA 酶抑制劑購自美國Promega 公司；EasyTaqDNA 聚合酶購自北京全式金生物技術有限公司；PCR 純化試劑盒購自美國OMEGA 公司；測序試劑盒Big Dye Terminator 3.1 購自美國ABI 公司。

1.3 病毒純化與雞胚半數感染量（EID50）的測定將病毒原液用PBS 10 倍倍比稀釋，取106～109病毒稀釋液接種10 日齡SPF 雞胚，每個稀釋度接種4 枚雞胚，37 ℃孵化48 h 后收取最高稀釋度且血凝價最高的雞胚尿囊液，按照上述方法連續(xù)傳3 代后得到純化病毒，將F3 代病毒液用PBS 10 倍倍比稀釋至1010，105～1010每個稀釋度接種5 枚10 日齡SPF 雞胚，37℃孵化48 h 后檢測各稀釋度血凝陽性的雞胚數目，并根據Reed-Muench 方法計算病毒的EID50。

1.4 病毒全基因組測序與分子進化分析利用RNA提取試劑盒提取F3 代病毒的RNA，并利用12 bp 流感病毒反轉錄通用引物（5'-AGCAAAAGCAGG-3'）將其反轉錄為cDNA。采用文獻中PB2、PB1、PA、HA、NP、NA、M、NS 基因節(jié)段特異性引物分別擴增病毒的這8 個基因節(jié)段序列[10]，PCR 產物純化后利用Big-Dye Terminator 3.1 測序試劑盒測序，利用DNAStar 的Seqman 軟件包拼接序列，并對其進行BLAST 比對分析。對測序結果利用MEGA 7.0 中的鄰近法（bootstrap值設為1000）構建表面基因（HA、NA 基因）的進化樹；利用貝葉斯[BEAST（1.10.4版）]端點定年法估算該病毒8 個基因節(jié)段的最近共同祖先時間（tMRCA），BEAST 中所使用的最佳核苷酸替代模型由IQ-TREE中的ModelFinder 計算得出，所使用的分子鐘和樹先驗（Tree prior）分別為不相關的對數正態(tài)分布寬松分子鐘和恒定大小的溯祖。并分析分離病毒的特殊氨基酸位點。

1.5 病毒對BALB/c 小鼠的感染性試驗將F3 代病毒稀釋至106EID50/50 μL，以50 μL/只劑量感染8 只6周齡的BALB/c 雌性小鼠；同時設立5 只接種PBS 的空白對照組小鼠。感染3 d 后，感染組隨機剖殺3 只小鼠，無菌采集其腦、鼻甲、脾臟、腎臟和肺臟，利用雞胚進行病毒滴定，檢測病毒在小鼠體內的復制情況；同時，感染后每天觀察并記錄感染組和對照組小鼠的臨床表現、體質量變化和死亡情況，直至感染后第14 d。

2 結 果

2.1 病毒純化及EID50測定結果有限稀釋法連續(xù)純化3代后獲得F3代純化病毒，利用Reed-Muench 方法檢測計算得到病毒的EID50為7.28 EID50/0.1 mL。

2.2 病毒的全基因組測序及同源性分析結果利用BigDye Terminator 3.1 測序試劑盒對DK/GX/S10590/2020 株的全基因組測序，將測得的全基因組序列輸入NCBI 數據庫進行BLAST 比對分析，篩選與DK/GX/S10590/2020 各基因節(jié)段核苷酸同源性最高的參考株序列。結果顯示：與分離株8 個基因節(jié)段核苷酸同源性最高的病毒有H1N1、H3N8、H4N8、H6N1、H7N3、H7N7 和H9N2亞型AIV，基因來源呈現明顯的多樣性（表1），提示該病毒可能是由多種LPAIV 在病毒傳播過程中經復雜重配而成。

表1 與DK/GX/S10590/2020株各基因節(jié)段同源性最高的病毒株Table 1 Virus with the highest nucleotide identity to each gene segment of DK/GX/S10590/2020

2.3 病毒表面基因的遺傳演化分析結果對該病毒分離株表面基因進行遺傳演化分析，HA 基因進化樹顯示：DK/GX/S10590/2020 株與我國目前流行的BJ94-like 和G1-like H9N2 AIV 處于不同的兩個分支，而與西伯利亞、韓國、日本和孟加拉國來源的H9N2 AIV HA 基因親緣關系較近，提示其HA 基因可能來源于東亞-澳大利西亞候鳥遷徙線上的外來源H9N2 AIV；NA 基因進化樹顯示，該病毒株的NA 基因與NCBI 數據庫中H9N8 AIV 的NA 基因位于不同的進化分支，而與多株阿拉斯加野鳥源H3N8 AIV 親緣關系較近，提示東亞與北美洲的N8-NA 基因庫發(fā)生了明顯的基因漂移（圖1）。以上結果表明，DK/GX/S10590/2020 株可能是由東亞-澳大利西亞候鳥遷徙線上的野鳥引入廣西鴨群。

圖1 分離株DK/GX/S10590/2020 HA和NA基因的遺傳進化樹Fig.1 Phylogenetic trees of the HA and NA gene segments of DK/GX/S10590/2020

2.4 病毒起源的進化分析結果為了進一步推算DK/GX/S10590/2020 株的產生時間，利用貝葉斯端點定年法對分離病毒的8 個基因節(jié)段進行分析。結果顯示，其NP 基因的最近共同祖先來源于中國的鴨源AIV，其余7 個基因的最近共同祖先均來源于東亞地區(qū)的野鳥源AIV（表2），表明該H9N8 AIV可能由東亞地區(qū)的野鳥源AIV和我國的鴨源AIV重配而成。該病毒的PB2、PB1、PA、NA、M 和NS 基因的tMRCA為2017 年5 月 至2018 年12 月，HA 和NP 基 因 的tMRCA分別估算為2015年12月和2015年6月（表2），表明DK/GX/S10590/2020 株的重配過程主要發(fā)生在2017年～2018 年，可能在2018 年末完成重配。

表2 分離株DK/GX/S10590/2020（H9N8）的tMRCATable 2 Time of most recent common ancestors for DK/GX/S10590/2020(H9N8)

2.5 病毒基因組特殊氨基酸位點分析結果對DK/GX/S10590/2020 株的特殊氨基酸位點分析，結果顯示，HA 蛋白裂解位點氨基酸位點為PAASNR/GL，僅含有一個堿性氨基酸，為明顯的LPAIV 分子特征。本研究中該病毒的HA 蛋白受體結合區(qū)具有155T 和226Q的分子特征；NA 蛋白莖部區(qū)無缺失。該H9N8 分離株的PB2 氨基酸序列中具有增強對小鼠毒力的504V 分子特征[11]。此外，還在該分離株中發(fā)現許多可增強H9亞型AIV對雞或哺乳動物組織嗜性的突變，如PB1蛋白的L13P、PB1-F2 蛋白的L82S、PA 蛋白的K26E 和V160D、NP 蛋白的V105M 和K398Q、以及M1 蛋白的H110Y和A166V[2]。但未發(fā)現該病毒具有藥物抗性的突變（如NA 蛋白的E119A/G 和H274Y/R；M2 蛋白的L26P、V27A、A30T 和S31N），表明該分離株對流感病毒的抑制藥物仍敏感。以上結果表明，DK/GX/S10590/2020 為一株LPAIV，但其存在感染雞和哺乳動物的潛在風險。

2.6 病毒對BALB/c 小鼠的感染性試驗結果以BALB/c 小鼠作為動物模型，評估DK/GX/S10590/2020株對哺乳動物的感染性。結果顯示：僅在2 只小鼠的鼻甲內檢測到了病毒低水平復制，其病毒滴度均為1.25 log10EID50/mL，在小鼠的肺臟、腦、脾臟和腎臟內均未檢測到該病毒復制（圖2）。感染后14 d 觀察期內，感染組小鼠無明顯的臨床癥狀，但相比于對照組，感染組小鼠整個實驗期體質量總體呈波動緩慢增長趨勢，但在感染后第4 d～6 d 小鼠的體質量顯著下降（P＜0.05）（圖3），此結果可能是因為感染后第4 d 該病毒在小鼠體內的復制達到最高水平。以上結果表明，DK/GX/S10590/2020 株對小鼠呈低致病力。

圖2 感染后第3 d小鼠臟器病毒滴定結果Fig.2 Viral titers in the organs of mice at 3 days post inoculation

圖3 小鼠感染病毒14 d內的體質量變化Fig.3 Changes in of body weight of in mice infected with the virus over in 14 days

3 討 論

由于自然地理屏障的存在，AIV 的基因組可以分為兩個獨立進化的譜系，即歐亞譜系和北美譜系。有時這種障礙可以被一些長距離遷徙候鳥（如針尾鴨）所消除[12]。以往研究表明，歐亞譜系和北美譜系的AIV 之間存在部分基因節(jié)段的交換，或通過候鳥的遷徙進行AIV 的擴散傳播[13-14]。阿拉斯加作為東亞-澳大利西亞遷徙路線和北美遷徙路線的主要重疊區(qū)，是AIV 洲際間基因重組最為頻繁的地區(qū)之一[15-16]。本研究中DK/GX/S10590/2020 株的NA 基因與阿拉斯加野鳥源H3N8 AIV 的NA 基因位于同一進化分支，表明二者可能有共同的基因來源。

流感病毒HA 蛋白受體結合區(qū)的特殊氨基酸位點是決定其宿主范圍的關鍵因素。研究表明155T（以H3的HA 編號）能夠顯著增強H9 AIV 對α-2,6 人源唾液酸受體的結合能力[17]，本研究中的DK/GX/S10590/2020 株HA 蛋白具有該分子特征。NA 莖部缺失能夠增強流感病毒對小鼠的毒力，并與流感病毒從野生水鳥跨物種感染家養(yǎng)陸禽后的適應性有關[18]，但本研究中該H9N8 分離株NA 蛋白莖部無缺失。PB2 蛋白中的一些突變（Q591K、E627K、D701N）可顯著增強AIV 對哺乳動物的適應性[19-21]，本研究中的DK/GX/S10590/2020 株未發(fā)現這些氨基酸突變，但其PB2 蛋白存在504V 分子特征，該位點可以增強AIV 對小鼠的毒力[11]。雖然在該病毒株內部蛋白上發(fā)現多個增強對雞或哺乳動物組織嗜性的突變，如PB1 蛋白的L13P、PB1-F2蛋白的L82S、PA蛋白的K26E 和V160D、NP蛋白的V105M 和K398Q、以及M1 蛋白的H110Y 和A166V[2]，但本研究小鼠感染性試驗結果顯示，該病毒僅在小鼠的鼻甲內低水平復制，而不能在小鼠的肺臟復制，說明該病毒株還未完全適應哺乳動物，但不排除該病毒株可以感染家雞的可能性。

候鳥遷徙在AIV 的傳播過程中起著關鍵作用。目前已知全球共有9 條主要的候鳥遷徙路線，其中有3 條途經我國，即中亞遷徙路線、西亞-東亞遷徙路線和東亞-澳大利西亞遷徙路線。本研究的病毒分離自廣西的一個鴨養(yǎng)殖場，恰好位于東亞-澳大利西亞遷徙路線上；貝葉斯進化分析結果表明該病毒可能是由東亞地區(qū)的野鳥源AIV 和我國鴨源AIV 重配而成后，由東亞-澳大利亞遷徙線上的野鳥引入廣西鴨群。在我國家鴨大多數處于開放式飼養(yǎng)狀態(tài)，缺乏有效的生物安全防護措施，與野鳥接觸密切，為AIV 在家鴨與野鳥之間交流重組提供了便利條件。因此，為了有效預防AIV，尤其是防止高致病性AIV由野鳥傳入家禽，應當進一步加強水禽飼養(yǎng)環(huán)節(jié)的生物安全防護措施，同時提高水禽禽流感疫苗的免疫覆蓋率和免疫合格率，阻斷AIV 的侵入，從而減少因為水禽的養(yǎng)殖和流通帶來的AIV 傳播風險。