肖志宇，王素春，趙成龍,4，黃禹豐,3，陳海燕,3，崔成都，孫福亮，王楷宬,4*

（1.中國動物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心，山東 青島 266032；2.延邊大學(xué)，吉林 延吉 133000；3.河南科技大學(xué)動物科技學(xué)院，河南 洛陽 471023；4.青島易邦生物工程有限公司動物基因工程疫苗國家重點實驗室，山東 青島 266114）

禽偏肺病毒（Avian metapneumovirus，aMPV）早期被稱為禽肺病毒，由于可感染火雞導(dǎo)致鼻氣管炎，也被稱作火雞鼻氣管炎病毒。1980 年首次于南非被發(fā)現(xiàn)及報道，隨后aMPV 迅速傳播，在亞洲、非洲、歐洲、南美洲、北美洲等地均有aMPV 的報道[1]。aMPV 屬于副黏病毒科（Paramyxoviridae）、肺病毒亞科（Pneumovirinae）[2]。根據(jù)編碼附屬糖蛋白G 基因的不同，aMPV 分為A、B、C 和D 亞群。aMPV 的基因組為一條不分節(jié)段的單股、負鏈RNA，呈螺旋對稱包含在核蛋白殼中，長度約為13.5 kb[3]。

aMPV 是禽類上呼吸道的一種高度傳染性病毒，可導(dǎo)致雞的腫頭綜合征，以咳嗽、打噴嚏、下頜與面部腫脹、歪頭斜頸、角弓反張為主要臨床癥狀。若aMPV 感染雞同時伴有其他致病細菌、病毒的繼發(fā)感染時，會加重患病雞病情，而且嚴重影響蛋雞的產(chǎn)蛋量，給家禽養(yǎng)殖業(yè)造成嚴重的經(jīng)濟損失[4-6]?；痣u和雞是aMPV 的自然宿主，各日齡雞均易感染。另外，aMPV 還存在于麻雀、鴕鳥、海鷗、燕子和鴿子等鳥類，但這些鳥類對aMPV 不易感，僅僅是攜帶和傳播病毒。C 亞群aMPV 也可以感染小鼠，可能是一種潛在的人畜共患病病原[7]。aMPV 具體的傳播途徑尚不清楚，aMPV 可以通過直接或間接接觸患病的禽類傳播，健康禽類接觸患病禽類的呼吸道黏液即可感染發(fā)病。由于aMPV 主要感染上呼吸道，所以aMPV 也可以通過空氣傳播，尤其是通過空氣中的懸浮顆粒傳播[8-10]。另外aMPV 的傳播還與野禽的遷徙、人員與儀器設(shè)備的流動、感染家禽的運輸、污染的水源和飼養(yǎng)工具等相關(guān)。

近年來，aMPV 在我國流行，并造成嚴重影響。1998 年，沈瑞忠等首次于我國黑龍江地區(qū)分離并報道了該病毒[11]。2009 年，郭龍宗等發(fā)現(xiàn)山東省多地的種雞群感染aMPV 的情況普遍存在[12]。2012 年，贠炳嶺等發(fā)現(xiàn)在黑龍江、吉林、長春、河北等地的種雞群中普遍存在aMPV 感染，多個種雞場的血清aMPV 抗體陽性率達到100%[13]。2016 年，朱艷梅等對河南、河北、江蘇等地區(qū)的種雞群進行了調(diào)查，結(jié)果顯示這些地區(qū)的種雞群也普遍存在aMPV 的感染[14]。2017 年，張丹俊等的研究數(shù)據(jù)表明，安徽省不同地區(qū)不同品系的雞群均存在較嚴重的aMPV 感染，且蛋雞的感染率明顯高于肉用和兼用型雞的感染率[15]。

雖然該病毒在我國流行較廣，但國內(nèi)關(guān)于aMPV流行病學(xué)研究及致病特征的報道較少，因此本研究通過對福建省、四川省、廣東省、江蘇省的8 個地區(qū)采樣，系統(tǒng)分析了aMPV 的流行情況。該研究不僅豐富了aMPV 的流行病學(xué)資料，也為研制其疫苗提供數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品來源及信息2020 年下半年從福建、江蘇、廣東、四川4 省共采集1 920 份禽咽喉/泄殖腔雙拭子樣品（每省480 份），置于含有10%甘油和抗生素的PBS 緩沖液。

樣品宿主包括雞、鴨、鵝、鴿。其中，雞樣品1 373 份，主要品種為白羽肉雞、蛋雞、烏雞、三黃雞等；鴨樣品466 份，主要品種為番鴨、麻鴨等；鵝樣品43 份，主要品種為烏鬃鵝、白鵝等；鴿樣品38 份，主要為肉鴿（表1）。

表1 樣品信息Table 1 Sample information

1.2 主要試劑PrimeScriptTMRT-PCR Kit（Perfect Real Time）和PrimeScriptTMOne Step RT-PCR Kit Ver.2 購自寶生物工程（大連）有限公司；QIAamp Viral RNA Mini Kit 試劑盒購自德國QIAGEN 公司。

1.3 樣品處理及核酸提取拭子樣品用漩渦振蕩器震蕩混勻，室溫10 000 r/min 離心5 min。每個拭子樣品吸取200 μL 加入96 孔加樣槽中。按照QIAtractor 高通量核酸提取程序說明書提取RNA，放置于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 aMPV的多重?zé)晒舛縍T-PCR檢測利用Prime ScriptTMRT-PCR Kit，以提取的基因組RNA 為模板，采用表2 中相應(yīng)引物和探針，利用本實驗室已經(jīng)建立的aMPV 多重?zé)晒舛縍T-PCR 方法檢測[16]。反應(yīng)體系為50 μL：2×One Step RT-PCR Buffer Ⅲ25 μL，5 U/μL TaKaRa ExTaqHS 1 μL，PrimeScript RT Enzyme MixⅡ1 μL，表2 中各亞群上、下游引物以及探針各1 μL，模板RNA 4 μL，ddH2O 7 μL。熒光定量RT-PCR 反應(yīng)程序為：反轉(zhuǎn)錄42 ℃5 min；95 ℃10 s；94 ℃30 s，60 ℃30 s，40 個循環(huán)。

表2 引物和探針Table 2 Primers and probes

多重?zé)晒舛縍T-PCR 結(jié)果判定標準為：陰性對照無Ct 值且無擴增曲線；陽性對照的Ct 值≤36，并出現(xiàn)特異擴增曲線。待檢樣品通道無Ct 值并且無熒光擴增曲線，樣品判為aMPV 陰性；出現(xiàn)ROX 熒光擴增曲線，且Ct 值≤36，沒有HEX 熒光、FAM 熒光和CY5 熒光擴增曲線，則判定為A 亞群aMPV 陽性；出現(xiàn)FAM 熒光擴增曲線，且Ct 值≤36，沒有HEX 熒光、ROX 熒光和CY5 熒光擴增曲線，則判定為B 亞群aMPV 陽性；出現(xiàn)HEX 熒光擴增曲線，且Ct 值≤36，沒有FAM 熒光、ROX 熒光和CY5 熒光擴增曲線，則判定為C 亞群aMPV 陽性；出現(xiàn)CY5 熒光擴增曲線，且Ct 值≤36，沒有HEX 熒光、ROX 熒光和FAM 熒光擴增曲線，則判定為D 亞群aMPV 陽性；同時出現(xiàn)兩種或兩種以上熒光，則為2 個亞群或多個亞群aMPV 混合感染。

1.5 數(shù)據(jù)分析根據(jù)樣品宿主類別、來源、場點類型分析福建、四川、廣東、江蘇4省aMPV的感染情況。

2 結(jié) 果

2.1 aMPV 的檢測結(jié)果為了解aMPV 在我國的流行情況，本研究從福建、江蘇、廣東、四川4 省采集活禽雙拭子樣品1 920 份，利用已建立的aMPV 四重?zé)晒舛縍T-PCR 方法檢測，結(jié)果顯示51 份樣品為aMPV 陽性，其中39 份為B 亞群aMPV，7 份為C亞群aMPV，5 份為B、C 亞群混合感染aMPV。此外，39 份B 亞群aMPV 的感染宿主除1 份為鴿外其余38 份宿主均是雞（38/1 373）；7 份C 亞群aMPV 感染的宿主有3 份是鴨，4 份是雞（4/1 373）；5 份B、C 亞群aMPV 混合感染的宿主為雞（5/1 373）。從宿主感染類型分析，雞的陽性率為3.42%（47/1 373）且最易感染B 亞群aMPV；鴿的陽性率為2.63%（1/38）且易感B亞群aMPV；鴨的陽性率為0.64%（3/466）且均為C 亞群aMPV。結(jié)果表明，我國家禽中存在B 亞群和C 亞群的aMPV 感染，且首次發(fā)現(xiàn)了B、C 亞群混合感染的宿主雞，雞為aMPV 的主要宿主，并呈現(xiàn)對aMPV B 亞群易感。本研究未檢測到鵝的陽性樣品（表3），表明鵝可能并非aMPV 的主要宿主。

表3 臨床拭子樣品中aMPV的檢測結(jié)果Table 3 Detection results of aMPV in clinical swab samples

2.2 不同場點類型和宿主aMPV 的檢測及統(tǒng)計結(jié)果影響感染采集樣品共來自33 個場點，其中，830份采自5 個批發(fā)市場，540 份采自13 個零售市場，440 份采自14 個養(yǎng)殖場，110 份采自1 個屠宰場。結(jié)果顯示，批發(fā)市場有45個陽性樣品，來自4個陽性場點，場點陽性率為80%（4/5）。零售市場有6 個陽性樣品，來自3 個陽性場點，場點陽性率為23%（3/13）。養(yǎng)殖場、屠宰場未檢測到陽性樣品。宿主為雞的陽性樣品共47個，場點陽性率為12.12%（4/33），陽性樣品中包括白羽雞（19/47）、烏雞（10/47）、清遠麻雞（10/47）、草雞（3/47）、三黃雞（3/47）、花鳳雞（1/47）、蘆花雞（1/47）。宿主為鴨的陽性樣品共3 個，場點陽性率為9.09%（3/33），陽性樣品中包括青頭鴨（1/3）、番鴨（1/3）、連城白鴨（1/3）。宿主為鴿的陽性樣品共1 個，場點陽性率為3.03%（1/33），陽性樣品為肉鴿。結(jié)果表明，批發(fā)市場與零售市場多有個體散養(yǎng)戶存在，其可能存在疫病防控意識不強，導(dǎo)致aMPV 感染家禽，而養(yǎng)殖場、屠宰場疫病防控檢疫意識較強，未造成aMPV 流行，應(yīng)加強個體散養(yǎng)戶的疫病防控意識，本研究未檢測到宿主為鵝的陽性樣品。

2.3 不同地區(qū)aMPV 的流行情況統(tǒng)計分析結(jié)果對各省禽群中的aMPV 檢測統(tǒng)計結(jié)果顯示，福建省部分地區(qū)陽性率為0.63%（3/480）；四川省部分地區(qū)陽性率為3.96%（19/480）；廣東省部分地區(qū)陽性率為3.54%（17/480）；江蘇省部分地區(qū)陽性率為2.50%（12/480）。檢測結(jié)果表明，福建、四川、廣東、江蘇4 省部分地區(qū)禽群中均存在aMPV 的感染，應(yīng)立即采取相應(yīng)措施，加強監(jiān)管和控制該病的流行與傳播。

3 討 論

aMPV 在全球廣泛流行，暴發(fā)時會快速傳播，A和B 亞群aMPV 已經(jīng)在中國、日本、以色列、巴西和大部分歐洲國家廣泛傳播[17-18]。而C 亞群aMPV 主要在美國、法國、中國和韓國被報道，D 亞群aMPV 僅僅在法國被報道。

aMPV 感染雞群雖然死亡率低，但經(jīng)常繼發(fā)感染傳染性支氣管炎病毒、新城疫病毒、傳染性喉氣管炎病毒、雞支原體或其他病原體，使病情加重，死亡率顯著提高[19]。aMPV 的流行速度快、傳播范圍廣、造成損失大，而且國內(nèi)多為血清學(xué)的流行病調(diào)查，本研究為病原學(xué)流行病調(diào)查，不僅豐富了aMPV的流行病學(xué)資料，也為aMPV感染的防控奠定了基礎(chǔ)。

本研究采集1 920 份雞、鴨、鵝、鴿的咽喉/泄殖腔雙拭子樣品，利用四重?zé)晒舛縍T-PCR 方法檢測A、B、C、D 亞群的aMPV。結(jié)果顯示，1920 份樣品中共檢出aMPV 陽性樣品51 份，其中，B 亞群39 份，C 亞群7 份，B 亞群和C 亞群混合感染5 份。4個省aMPV 的陽性率為2.67%（51/1 920），各省陽性率為0.63%～3.96%；場點陽性率為21.21%（7/33）。進一步分析數(shù)據(jù)得知所有陽性樣品均采樣于零售市場和批發(fā)市場，而養(yǎng)殖場和屠宰場無陽性樣品。在樣品采集時零售市場樣品主要以家庭散養(yǎng)成年家禽為主，批發(fā)市場樣品來源復(fù)雜，既有家庭散養(yǎng)家禽也有養(yǎng)殖場飼養(yǎng)的家禽，還有家庭農(nóng)場飼養(yǎng)的家禽，養(yǎng)殖場主要以采集規(guī)?；B(yǎng)殖場和養(yǎng)殖專業(yè)合作社的成年家禽為主，屠宰場樣品均來自規(guī)?；B(yǎng)殖場。結(jié)合aMPV可在禽之間直接接觸傳播，也可通過間接接觸不同媒介而發(fā)生水平傳播，同時也能夠通過空氣傳播的特性，推測有可能是因為現(xiàn)階段集約化、規(guī)模化的家禽養(yǎng)殖場在飼養(yǎng)管理上較為科學(xué)，從而降低了aMPV 的感染。有文獻報道，飼養(yǎng)管理不當(dāng)是aMPV 感染禽的重要發(fā)病因素，調(diào)整飼養(yǎng)密度、控制飼養(yǎng)環(huán)境的通風(fēng)及適宜溫度、控制飼養(yǎng)環(huán)境的衛(wèi)生，做好定期消毒工作可以有效降低該病的發(fā)病率[20]。在零售市場和批發(fā)市場存在大量散養(yǎng)禽類，可能由于其的飼養(yǎng)管理相對落后而出現(xiàn)較多的陽性樣品。

陳秀琴等報道的福建省規(guī)?；u場aMPV 感染情況的血清學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示，部分地區(qū)的養(yǎng)殖場aMPV抗體陽性率高達100%[20]。張丹俊等對安徽省9 個雞場aMPV 感染的血清學(xué)調(diào)查研究結(jié)果顯示，所有被檢雞場均有aMPV 的感染[15]。張麗華等對廣西地區(qū)規(guī)模化雞場aMPV 感染的血清學(xué)調(diào)查研究結(jié)果顯示，不同日齡不同品系的雞群均存在較嚴重的aMPV 感染[21]。朱艷梅等對aMPV 病原學(xué)的調(diào)查顯示，江蘇、遼寧、河南、山東、河北等地有腫頭癥狀雞群中aMPV 的陽性檢出率高達50.7%[14]。從中隨機抽取9個樣品進行基因序列分析，結(jié)果顯示，9 個樣品均為B 亞群aMPV。該研究結(jié)果aMPV 的陽性率比本研究的陽性率高是由于本研究采樣時并未針對腫頭癥狀禽群。對于aMPV的流行病學(xué)調(diào)查大多為血清學(xué)調(diào)查，本研究采用病原學(xué)方法檢測且采樣時并未針對腫頭癥狀禽群而是健康禽群，這說明健康禽群aMPV 陽性率遠低于腫頭癥狀禽群，這也是導(dǎo)致本研究結(jié)果與以上研究結(jié)果不一致的原因之一。而且有研究表明在aMPV 單一感染中，火雞大約在感染的14 d 內(nèi)即可恢復(fù)正常。當(dāng)飼養(yǎng)管理條件不佳或發(fā)生繼發(fā)性細菌感染時均可增加發(fā)病率和死亡率。本研究樣品大多采自成年商品家禽，可能樣品個體有一過性aMPV 感染，并快速清除了體內(nèi)抗原，但抗體仍然在體內(nèi)持續(xù)存在，這是導(dǎo)致本研究與血清學(xué)調(diào)查結(jié)果差異顯著的主要原因。

aMPV 檢測結(jié)果顯示四川省感染aMPV 的禽類較多。本研究表明，我國雞群中主要感染B 亞群aMPV，雞群仍然是感染aMPV 的主要宿主，且在雞群中存在B 亞群與C 亞群的混合感染。鴨群中存在C 亞群aMPV 感染，鴿群中存在B 亞群感染。2014 年有研究人員發(fā)現(xiàn)番鴨中存在aMPV 感染[22]，2012 年有研究人員發(fā)現(xiàn)鴿群中存在aMPV 感染[23]。aMPV 的感染使雞群處于免疫抑制狀態(tài)，易造成雞群免疫失敗同時增加了其他病原感染風(fēng)險。因此，需要加強aMPV 的流行情況監(jiān)測。

本研究調(diào)查結(jié)果不僅豐富了我國aMPV流行病學(xué)資料，同時也為福建、四川、廣東、江蘇4 省部分地區(qū)aMPV感染的防控提供技術(shù)支持，為開展aMPV病原學(xué)、檢測技術(shù)以及疫苗的研發(fā)等相關(guān)研究提供科學(xué)依據(jù)。