王晨燕，羅忠寶，黃寶欽，江 斌，張世忠，邵國青,3，侯 博*

（1.福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所福建省畜禽疫病疾病防治工程技術(shù)研究中心，福建 福州 350013；2.福建圣農(nóng)發(fā)展股份有限公司，福建 南平 353499；3.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院獸醫(yī)研究所，江蘇 南京 210014）

滑液囊支原體（Mycoplasma synovia，MS）是感染雞和火雞的一種致病性病原體，全年均可感染，廣泛存在于世界范圍內(nèi)的各雞群，主要引起傳染性滑膜炎和腱鞘炎以及亞臨床的呼吸道癥狀。MS 具有水平傳播和垂直傳播的能力，臨床MS 感染主要表現(xiàn)為上呼吸道亞臨床癥狀或無癥狀，產(chǎn)蛋雞出現(xiàn)產(chǎn)蛋量和雞胚孵化率下降[1]，以及商品肉雞飼料報酬率和胴體品質(zhì)等級均降低[2]。此外，MS 感染還引起雞胚蛋殼頂端異常（Eggshell abonormalities，EAA），且感染MS 的雞群易誘發(fā)感染新城疫病毒、傳染性支氣管炎病毒、大腸桿菌等，給家禽業(yè)帶來了極大的經(jīng)濟損失[3-4]。MS只有一個血清型，但不同MS分離株的致病性不同[5]，同一MS分離株不同感染途徑的致病力也不同[6]，從病變氣囊分離的菌株較易引起氣囊炎，從滑膜分離的菌株較易引起滑膜炎[7]。目前主要通過對培養(yǎng)物或組織樣品的可變脂蛋白血凝素A（Variable lipoprotein hemagglutinin，vlhA）基因測序并進行遺傳進化分析研究MS[8-9]。臨床多采用抗生素治療MS 感染，但經(jīng)過長期抗生素的使用也不能徹底根治MS 感染，抗生素治療僅能減輕感染和降低MS的傳播速度[10]。

我國雞群MS 感染率最近幾年持續(xù)上升，目前已廣泛存在于全國各地雞群中，包括蛋雞、白羽肉雞和黃雞。通過血清學(xué)調(diào)查（ELISA 法）發(fā)現(xiàn)2010 年～2015 年我國16 個省9 773 個肉雞群中存在MS 感染[11]。Xue 等發(fā)現(xiàn)2010 年～2015 年中國21 個省份未免疫雞群血清MS 抗體總陽性率為41.19%，且MS 可感染任何日齡雞群[12]。為避免血清采樣對產(chǎn)蛋雞群的應(yīng)激，Gole 等對澳大利亞19 個商業(yè)蛋雞群的雞胚卵黃抗體進行抗體檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)MS 抗體陽性率為69%，產(chǎn)蛋雞群存在較為嚴重的MS 感染[13]。

為了解福建省商品蛋雞和肉雞群中MS 流行情況，本研究采用ELISA 法對蛋雞群進行血清抗體檢測，利用實驗室建立的TaqMan qPCR 方法對肉雞群的上顎裂拭子進行MS 檢測；同時為了解MS 在蛋雞群中的感染規(guī)律，選取3 個非免疫蛋雞群定期跟蹤檢測MS 抗體的同時利用TaqMan qPCR 方法對上顎裂拭子進行MS 病原檢測；同時對不同年份和地區(qū)的MS 分離株進行vlhA基因系統(tǒng)進化樹分析，以了解和掌握2018 年～2020 年福建地區(qū)MS 感染情況和規(guī)律，為科學(xué)防控MS 感染奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要實驗材料MS-H 株商品化疫苗購自澳大利亞生物資源有限公司；MS ELISA 抗體檢測試劑盒購自BioChek 公司；GoTaqGreen Master Mix（M7123）購自普洛麥格（北京）生物有限公司；2×T5 Fast qPCR Mix（Probe）購自北京擎科生物科技有限公司；引物和探針由北京擎科生物科技有限公司合成；細菌DNA 提取試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司。

1.2 樣品采集1 668 份蛋雞血清樣品來自2018 年～2020 年福建4 個地市不同規(guī)?；疢S 非免疫蛋雞養(yǎng)殖場，其中福州834 份，漳州552 份，莆田153 份，南平129 份。2 777 份肉雞上顎裂拭子樣品來自福建不同規(guī)?；子鹑怆u養(yǎng)殖場，其中2018 年、2019 年和2020 年分別采樣981 份、793 份和1 003 份。選取不同地方的A、B 和C 3 個MS 非免疫蛋雞雞群（每個雞群規(guī)模約為5 萬羽），從雛雞進廠（1 周齡～2 周齡）至產(chǎn)蛋前（12 周齡～18 周齡）每月分別采集血清和上顎裂拭子樣品至少40 份，并一一對應(yīng)。

1.3 蛋雞群中MS 抗體檢測及MS 感染流行規(guī)律分析采用MS 抗體檢測試劑盒，對采集的血清樣品進行檢測。檢測結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)：S/P 值≥0.500 或效價范圍≥594，判為陽性，反之判為陰性。根據(jù)檢測結(jié)果分析蛋雞群MS 感染流行規(guī)律。

1.4 蛋雞群及肉雞群中MS 的TaqMan qPCR 檢測及MS感染流行規(guī)律分析取上顎裂拭子樣品2 000 r/min離心5 min；取上清液1 mL（或MS 純培養(yǎng)物）置于1.5 mL 離心管中，4 ℃12 000 r/min，離心10 min，棄上清液，采用細菌DNA 提取試劑盒提取沉淀中MS 基因組DNA 作為模板進行qPCR 擴增。

利用本實驗室建立的針對MSobg基因的TaqMan qPCR 方法，對上顎裂拭子樣品進行MS 的檢測。檢測總體積20 μL，反應(yīng)體系為：2×T5 Fast qPCR Mix 10 μL，引物MS-F（5'-TAAAGTTCCGCTTGGAACGC-3'） 或MS-R（5'-GCAATTCTAGGAGCGGTGTT-3'）（10 μmol/L）各0.7 μL，探針MS-P（5'-FAM-TTATTA TTTCCTCTTCCGCC-MGB-3'）（10 μmol/L）0.6 μL，dd H2O 4 μL，DNA 模板4 μL；反應(yīng)條件：95 ℃2 min；95 ℃10 s、60 ℃35 s（收集FAM 熒光信號），40 個循環(huán)。每次試驗以疫苗株MS H 株為陽性對照，以無菌水作為陰性對照。檢測結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)為：當(dāng)陽性對照Cq 值＜25，陰性對照無Cq 值時，則陰陽性對照成立；當(dāng)樣品Cq 值≤35，判定為“+”；35＜Cq 值＜38，判定為弱陽性或可疑；Cq 值≥38，判定為“-”；當(dāng)樣品判定為弱陽性或可疑時，重復(fù)檢測一次仍為可疑或弱陽性，則判為陽性。根據(jù)檢測結(jié)果分析蛋雞和肉雞群MS 感染流行規(guī)律。

1.5 MS vlhA 基因的進化樹分析對1.4 中不同來源MS陽性樣品中獲得的18株分離菌株（表1）進行vlhA基因PCR 擴增，引物序列如下：vlhA-F：5'-GGCCAT TGCTCCTRCTGTTAT-3'/vlhA-R：5'-CCCGTCTCAGT ATAGTGTACG-3'?？傮w積25 μL，反應(yīng)體系：GoTaqGreen Master Mix 12.5 μL，上下游引物（10 μmol/L）各1 μL，dd H2O 8.5 μL，DNA 模板2 μL；反應(yīng)程序為：95 ℃5 min；95 ℃30 s、56 ℃30 s、72 ℃90 s，共35 個循環(huán)；72 ℃10 min；以MS H 株為陽性對照。將PCR 產(chǎn)物經(jīng)克隆后挑取單個菌落在LB 培養(yǎng)基培養(yǎng)后提取質(zhì)粒由福州博尚生物公司測序，并利用MEGA7 軟件采用鄰接法（Neighbor-Joining，NJ）法構(gòu)建vlhA基因的系統(tǒng)進化樹。

表1 MS病原陽性分離株來源背景Table 1 Source and background of MS isolated strains from positive samples

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析利用SPSS19.0 軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。采用χ2檢驗及其事后兩兩比較不同年份、不同日齡雞群的MS 抗體和MS 病原檢測結(jié)果是否存在顯著性差異，當(dāng)P＜0.05 表示差異顯著。

2 結(jié) 果

2.1 蛋雞群中MS 抗體檢測結(jié)果及MS 感染流行規(guī)律分析采用ELISA 抗體檢測試劑盒對1 668 份福建未免疫蛋雞群血清樣品進行檢測，結(jié)果顯示蛋雞血清中MS 抗體總陽性率為64.09%（1 069/1 668），呈逐年下降趨勢，2018 年為79.92%，2019 年和2020 年分別為77.21%和38.58%，經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析顯示2018 年與2019 年MS 抗體陽性率無顯著差異（P＞0.05）；2018 年MS抗體陽性率與2020年存在顯著差異（P＜0.05），2019年MS 抗體陽性率與2020 年存在顯著差異（P＜0.05），2018 年MS 抗體陽性率與2019 年無顯著差異（P＞0.05）（圖1）。不同月齡蛋雞MS 抗體陽性率隨月齡增加呈上升趨勢：其中1 月齡～6 月齡蛋雞血清MS 抗體陽性率各月齡分別為4.40%、17.40%、43.26%、80.00%、76.31%和76.44%，7 月齡～15 月齡蛋雞血清MS 平均抗體陽性率為92.17%（圖2）。結(jié)果表明2018 年～2019年福建地區(qū)蛋雞群存在嚴重的MS 感染，且隨著月齡增加，感染率顯著上升，提示在雞群中存在著嚴重的MS 水平傳播現(xiàn)象。

圖1 不同年份蛋雞血清MS抗體檢測結(jié)果及SPSS分析Fig.1 SPSS analysis of MS antibody positive rate in layers at different years

圖2 不同月齡蛋雞血清MS抗體檢測結(jié)果及SPSS分析Fig.2 Detection results and SPSS analysis of MS antibody in serum of laying hens of different ages

2.2 肉雞群中MS TaqMan qPCR 檢測結(jié)果及MS 感染流行規(guī)律分析采用TaqMan qPCR 對不同肉雞群的2 777 份上顎裂拭子樣品檢測，結(jié)果顯示肉雞群中MS 總陽性率為49.62%（1 378/2 777），其中2018 年、2019 年和2020 年分別為43.83%、51.58%和53.73%，經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析結(jié)果顯示2019 年與2020 年MS 陽性率無顯著差異（P＞0.05），但2018 年MS 陽性率與2019年存在顯著差異（P＜0.05），2018 年MS 陽性率與2020 年存在顯著差異（圖3），表明MS陽性率逐年升高。隨著肉雞日齡增加，0～7 d、8 d～14 d、15 d～21 d、22 d～28 d、29 d～35 d 和36 d～42 d 的MS 檢測陽性率分別為0、24.00%、35.29%、68.49%、72.53%和88.91%（圖4），結(jié)果表明MS 在肉雞群中的陽性率隨雞群日齡增加而增加，在雞群中存在著嚴重的MS水平傳播。

圖3 不同年份肉雞MS病原檢測結(jié)果及SPSS分析Fig.3 Detection results and SPSS analysis of MS pathogen positive rate in broilers at different years

圖4 不同日齡肉雞MS病原檢測結(jié)果及SPSS分析Fig.4 Detection results and SPSS analysis of MS pathogens in broilers of different ages

2.3 蛋雞群MS 抗體和MS 檢測結(jié)果的比較與分析對不同來源、不同品種的3 個非免疫蛋雞群定期進行MS 抗體和MS 檢測，結(jié)果顯示雞群A 在1 周齡和5 周齡、10周齡、18周齡時MS陽性率分別為100.00%、100.00%、97.5%、80.00%，而同期的MS 抗體陽性率分別為65.00%、66.70%、77.50%、95.00%（圖5A）；雞群B 中1 周齡和5 周齡的MS 抗體和病原陽性率均為0，第9 周齡開始MS 抗體陽性率為7.50%，而MS病原陽性率為52.50%，第13 周齡MS 抗體陽性率32.50%，MS 病原陽性率為77.50%（圖5B）；雞群C 中2 周齡～16 周齡的MS 抗體和MS 病原陽性檢出率均為0（圖略）。結(jié)果表明BioChek MS 抗體檢測試劑盒與TaqMan qPCR病原檢測方法在雞群MS檢測中結(jié)果差異較大，并且不同雞群MS 感染情況不同，在1 周齡～2 周齡時MS 和MS 抗體陽性率的不同可能是由于部分雞群存在垂直傳播現(xiàn)象和母源抗體，而B 雞群在后期MS 陽性檢出率增加可能是雞群通過水平傳播感染MS 后又進一步在雞群內(nèi)部發(fā)生了嚴重的水平傳播。

圖5 非免疫蛋雞群血清MS抗體和上顎裂拭子MS病原檢測陽性率的比較Fig.5 Comparison of positive rates of MS antibody in serum and MS pathogen in oropharyngeal swabs from non-immunized laying hens

2.4 MS vlhA 基因的進化樹分析對表1 不同來源的陽性樣品中分離獲得的18 株MS 菌株通過PCR 擴增vlhA基因并測序，分析其同源性并構(gòu)建其系統(tǒng)進化樹，結(jié)果顯示18 株福建MS 分離株vlhA基因序列同源性為80.32%～97.14%，進化樹顯示分離株來源廣泛，且分屬于不同的進化樹分支，與國外MS 菌株的親緣關(guān)系較近（圖6）。該結(jié)果表明福建地區(qū)感染的MS 來源復(fù)雜，且MS 分離株具有不同的遺傳背景，可能是由于引種或雞群流動所致。

圖6 MS vlhA基因系統(tǒng)進化樹Fig.6 Using MEGA7 software to construct the phylogenetic tree of MS vlhA gene by NJ method

3 討 論

臨床通常采用ELISA、PCR、HI 等多種方法檢測雞群中的MS[14]。本研究采用ELISA 方法對福建非免疫蛋雞群開展MS 感染調(diào)查，結(jié)果顯示，2018 年～2020 年蛋雞MS 抗體總陽性率為64.09%，且不同日齡蛋雞群MS 抗體均有陽性，表明MS 能感染各年齡段蛋雞，并在雞群存在嚴重的水平傳播，與其他研究結(jié)果一致[12]；在蛋雞群中MS 抗體陽性率在2 月齡～4 月齡出現(xiàn)顯著升高，有報道56 日齡SPF 雞攻毒試驗中，經(jīng)腳墊注射或氣管注射感染MS，雞群感染后10 d 開始產(chǎn)生抗體，而經(jīng)點眼感染在感染后20 d抗體開始轉(zhuǎn)陽[6]，以上結(jié)果表明MS 感染的發(fā)生遠遠早于抗體檢測陽性的時間，抗體檢測具有嚴重的滯后性。此外，ELISA 檢測的非免疫蛋雞群來源均不同，已有研究表明MS 水平傳播的潛伏期通常為11 d～21 d[15]，經(jīng)種蛋垂直傳播時雛雞出殼后潛伏期最長為6 d[16]，本研究1 月齡的蛋雞群抗體陽性率為4.4%，推測存在垂直傳播或有母源抗體。通過建立的TaqMan qPCR 法對肉雞上顎裂拭子檢測發(fā)現(xiàn)22 日齡～28 日齡肉雞MS 陽性率已超過50%，且隨著日齡增加，陽性率顯著升高，至出欄前達到88.91%，表明MS 同樣在肉雞群中出現(xiàn)了嚴重的水平傳播，且潛伏期至少需要21 d～28 d。因此，本研究表明福建地區(qū)2018 年～2020 年在非免疫雞群中存在嚴重的MS 感染，應(yīng)在MS 感染前即至少提早4 周采取有效的控制和預(yù)防策略阻止MS 感染。

雞群感染不同MS 菌株或不同劑量的MS 后的血清學(xué)反應(yīng)過程大致相同，低劑量感染組雞群MS 抗體產(chǎn)生時間較高劑量感染組延遲7 d[17]。本研究對3 個非免疫蛋雞群MS 和MS 抗體同時檢測結(jié)果提示，臨床采用ELISA 方法檢測出的MS 抗體陽性率可能低于雞群實際MS 感染率。在非免疫蛋雞群A 中1 周齡雛雞MS 陽性率為100%，MS 垂直傳播較為嚴重，MS 抗體水平隨時間呈上升趨勢，采用抗生素治療后10 周齡雞MS 陽性率有所下降但效果并不理想；在非免疫蛋雞群B 中，僅需4 周MS 的陽性率即超過50%，而建立的MSTaqMan qPCR 法的檢測限為102CCU50，推測實際雞群可能同時存在MS 水平傳播和垂直傳播，由于不同雞場管理方式和生物安全措施不同，MS 感染規(guī)律存在差異。產(chǎn)蛋雞開產(chǎn)后若存在MS 感染可對產(chǎn)蛋性能和蛋品質(zhì)造成一定影響[13]，因此很有必要利用TaqMan qPCR 法在雞群早期定期監(jiān)測MS，特別是在蛋/肉雞引種后和蛋雞開產(chǎn)前，了解不同雞群MS垂直傳播以及感染規(guī)律，并提前采用支原體敏感藥物或其他方法防治MS 的感染，可能會降低MS 臨床感染率。

臨床上不僅存在呼吸道嗜性和關(guān)節(jié)嗜性的MS 菌株，還存在輸卵管嗜性的菌株，MS 菌株之間的差異與其致病性和病程有關(guān)，而了解MS 菌株的分子特征有助于對其的流行病學(xué)研究[5]。vlhA基因是近幾年發(fā)現(xiàn)的針對MS 分子研究的靶基因，針對該基因的PCR檢測方法和根據(jù)該基因進行的MS 基因分型已經(jīng)十分成熟[5,18-19]。本研究通過對vlhA基因序列分析，發(fā)現(xiàn)18 株MS 福建分離株vlhA基因序列分屬于不同的進化樹分支，這可能是由于雞場引種的來源不同，李凡等發(fā)現(xiàn)川西地區(qū)MSvlhA基因的變異較大[20]，Sun 等發(fā)現(xiàn)中國本土地方品種雞群MS 主要分離株的基因型為K 型，為中國特有MS 基因型[11]。盡管MS 分型是依據(jù)vlhA基因，但MS 菌株的毒力仍然存在高度變異性，表現(xiàn)出呼吸道癥狀的雞群分離出的MS 菌株基因型可能存在不同[9]，因此臨床有必要對MS 分離株開展相關(guān)致病性試驗，以了解其致病特征。因此，本研究結(jié)果提示福建地區(qū)感染的MS 來源復(fù)雜，與國內(nèi)地方品種雞群MS 分離株的來源不同，且具有不同的遺傳背景，很有可能是通過引種或雞群流動所致其來源背景復(fù)雜。

因此，本研究結(jié)果表明不同日齡的非免疫雞群均存在廣泛的MS 感染和嚴重的水平傳播；通過對3個非免疫蛋雞群的MS 抗體和MS 持續(xù)跟蹤檢測表明不同雞群MS 感染的時間存在差異，其或許與雞苗來源和垂直傳播或生產(chǎn)管理相關(guān)，而且ELISA 法檢測結(jié)果相較qPCR 在早期感染檢測中存在滯后性；此外由于不同雞場生產(chǎn)管理方式和采取生物安全措施不同，MS 感染潛伏期也存在差異。通過vlhA基因測序發(fā)現(xiàn)不同MS 分離株屬于不同的進化分支，有著不同的遺傳背景，與國外MS 菌株的親緣關(guān)系較近，提示在以后引種等過程中需要加強MS 檢測。