鐘金鵬，楊 莉，王輝波，陳紅健，李金偉，文明洪，呂云波*

(三峽大學(xué)人民醫(yī)院 宜昌市第一人民醫(yī)院 1.心內(nèi)科； 2.神經(jīng)內(nèi)科， 湖北 宜昌 443000)

丹參酮IIA(tanshinone IIA，TSA)是中藥丹參的重要成分之一，其在心肌缺血再灌注(ischemia-reperfusion，I/R)損傷中能減小心肌梗死面積、改善心功能[1-2]。這可能與其抗氧化、抗炎及抗凋亡等有關(guān)，但具體機(jī)制仍不十分清楚。有報(bào)道高遷移率族蛋白B1 (high-mobility group box 1，HMGB1)作為一種重要的核蛋白，參與了心肌I/R損傷過(guò)程[3]。TSA對(duì)心肌I/R損傷的影響可能與HMGB1的下調(diào)表達(dá)有關(guān)[2]。也有報(bào)道外源性HMGB1對(duì)心肌I/R損傷的影響，但結(jié)論不一致[4-5]。本研究通過(guò)構(gòu)建心肌I/R損傷的動(dòng)物模型，應(yīng)用TSA和HMGB1進(jìn)行干預(yù)，探討其對(duì)心肌I/R損傷的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物：SPF級(jí)SD大鼠40只，雄性，體質(zhì)量220～260 g，6～8周齡，12 h光照與黑暗交替、濕度60%、溫度25 ℃，獨(dú)籠常規(guī)喂養(yǎng)(三峽大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，合格證號(hào)42010200005760)。

1.1.2 試劑：丹參酮IIA(滁州仕諾達(dá)生物科技有限公司)；重組HMGB1(上海經(jīng)科化學(xué)科技有限公司)；2%戊巴比妥鈉(武漢卡布達(dá)公司)；肌酸激酶同工酶(CK-MB)檢測(cè)試劑盒(上海將來(lái)實(shí)業(yè)股份有限公司)；2，3，5—氯化三苯基四氮唑染液(上海吉至生化科技有限公司)；RT-qPCR試劑盒(北京索萊寶科技有限公司)；HGMB1、NOD樣受體蛋白3(NOD-like receptor protein 3，NLRP3)、凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白(apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD，ASC)、胱冬肽酶-1(caspase-1)和核因子-κB(NF-κB)兔抗鼠一抗及二抗(艾美捷科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 大鼠的分組與處理：將大鼠隨機(jī)分假手術(shù)(sham)組、I/R組、TSA組(I/R+靜脈注射TSA 10 mg/kg)、TSA+HMGB1組(I/R+靜脈注射TSA 10 mg/kg+腹腔注射重組HMGB1 100 μg/kg)。按參考文獻(xiàn)[1]建模。假手術(shù)組僅開胸后縫合。TSA組和TSA+HMGB1組均于再灌注前3 min內(nèi)的給藥。

1.2.2 ELISA測(cè)定CK-MB：再灌注24 h采血，按試劑盒說(shuō)明書檢測(cè)血清CK-MB活性水平。

1.2.3 HE染色觀察心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)：取相同部位心肌，固定于4%多聚甲醛，經(jīng)脫水、包埋、切片、HE染色后在顯微鏡下觀察心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)變化。

1.2.4 TCC法測(cè)定心肌梗死面積：按文獻(xiàn)[1]方法應(yīng)用TCC法對(duì)心臟標(biāo)本進(jìn)行染色，梗死心肌呈蒼白色，正常心肌染成紅色，Image-Pro Plus軟件分析圖像，計(jì)算心肌梗死面積百分比。

1.2.5 RT-qPCR測(cè)定心肌中白介素-6(IL-6)、白介素-1β(IL-1β)和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)的轉(zhuǎn)錄水平：使用Trizol液從心肌樣品中分離提取總RNA，按試劑盒說(shuō)明書合成cDNA，然后在Applied Biosystems 7500 real-time PCR系統(tǒng)平臺(tái)上按照制造商流程進(jìn)行分析。Il-6的引物為：正鏈5′-GATGCTACC AAACTGGATATAATC-3′，負(fù)鏈 5′-GGTCCTTAGCCA CTCCTTCTGTG-3′；Il-1β的引物為：正鏈5′-CCTTG TCGAGAATGGGCAGT-3′，負(fù)鏈5′-CAGGGAGGGA AACACACGTT-3′；Tnfα的引物為：正鏈5′-CCATT CCTGAGTTCTGCAAAG-3′，負(fù)鏈5′-GCAAATATAAA TAGAGGGGGGC-3′。表達(dá)倍數(shù)改變通過(guò)2-ΔΔCt方法進(jìn)行定量，以sham組為參考。

1.2.6 Western blot檢測(cè)心肌HGMB1、NLRP3、ASC、caspase-1和NF-κB的蛋白表達(dá)：選取相同梗死部位等量心肌，搗碎裂解，抽提蛋白質(zhì)；加熱變性蛋白，冷卻后，加到SDS-PAGE膠加樣孔內(nèi)，通電電泳。選用PVDF膜進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，然后染色、漂洗、封閉。經(jīng)過(guò)相應(yīng)一抗及二抗孵育后，予以定影及顯影。使用凝膠圖象處理系統(tǒng)對(duì)目標(biāo)條帶予以定量分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 CK-MB的變化

I/R組血清中CK-MB水平明顯高于sham組(P<0.01)；TSA組較I/R組顯著下降(P<0.01)；而TSA+HMGB1組的CK-MB較TSA組顯著上升(P<0.01)(圖1)。

*P<0.01 compared with sham group; #P<0.01 compared with I/R group; △P<0.01 compared with TSA group圖1 心肌I/R損傷對(duì)血清中CK-MB水平的影響Fig 1 Level of CK-MB in serum after myocardial I/R

2.2 心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)的變化

光鏡下見sham組心肌細(xì)胞排列整齊，細(xì)胞結(jié)構(gòu)完成；I/R組心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)紊亂，肌漿均質(zhì)紅染，胞核破碎，間質(zhì)可見炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；TSA組心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)較I/R組有明顯改善，可見部分完整心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)；TSA+HMGB1組見細(xì)胞腫脹，間質(zhì)存在水腫(圖2)。

圖2 HMGB1減弱TSA改善I/R誘導(dǎo)的心肌結(jié)構(gòu)改變Fig 2 HMGB1 attenuated remissions to I/R-induced myocardial structural alterations by TSA(×400, bar= 50 μm)

2.3 各組大鼠心梗面積比較

假手術(shù)(sham)組未發(fā)現(xiàn)明顯心肌梗死；I/R組的心肌梗死面積最大；與I/R組相比，TSA組的心肌梗死面積明顯減少(P<0.01)；TSA+HMGB1組心肌梗死面積較TSA組明顯增加(P<0.01)(圖3，表1)。

圖3 TSA減少I/R導(dǎo)致的心肌梗死面積而HMGB1增加心梗面積Fig 3 TSA decreased the myocardial infarct area due to I/R while HMGB1 reversed

表1 各組大鼠心肌梗死面積比較Table 1 Comparison of myocardial infarct area of rats in each

2.4 比較心肌I/R損傷后炎性反應(yīng)指標(biāo)轉(zhuǎn)錄及蛋白表達(dá)水平

I/R組心肌中IL-6、IL-1β和TNF-α的mRNA轉(zhuǎn)錄水平明顯高于sham組(均P<0.01)；TSA組的IL-6、IL-1β和TNF-α的轉(zhuǎn)錄水平較I/R組顯著下降(P<0.01，P<0.01，P<0.05)；TSA+HMGB1組IL-6、IL-1β及TNF-α的轉(zhuǎn)錄水平較TSA組又顯著上升(均P<0.01)(圖4A～C)。

*P<0.01 compared with sham group; #P<0.05, ##P<0.01 compared with I/R group; △P<0.01 compared with TSA group

I/R組心肌HMGB1、NLRP3和caspase-1的表達(dá)水平明顯高于sham組(P<0.05，P<0.01，P<0.05)；TSA組的HMGB1、NLRP3、caspase-1和NF-κB的表達(dá)水平較I/R組顯著降低(均P<0.01)；而TSA+HMGB1組HMGB1、NLRP3、caspase-1和NF-κB的表達(dá)較TSA組顯著增加(P<0.05，P<0.01，P<0.01，P<0.01)(圖5)。

*P<0.05, **P<0.01 compared with sham group; #P<0.01 compared with I/R group; △P<0.05, △△P<0.01 compared with TSA group

3 討論

本結(jié)果提示TSA可以緩解心肌I/R損傷，而外源性HMGB1能逆轉(zhuǎn)這種作用，該過(guò)程可能與其影響炎性因子的表達(dá)有關(guān)。

TSA對(duì)抗I/R損傷廣泛存在于多個(gè)器官，其潛在機(jī)制可能都與HMGB1密切相關(guān)。在大腦中動(dòng)脈閉塞的動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)中，予以TSA治療，其HMGB1水平低，腦細(xì)胞凋亡程度輕，腦梗面積小[6]。在肝移植中，予以TSA預(yù)處理可以下調(diào)肝枯否細(xì)胞中HMGB1-TLR-4/NF-κB通路的表達(dá)，減輕肝I/R損傷[7]。而在心肌中，TSA通過(guò)減少HMGB1表達(dá)和抑制炎性反應(yīng)來(lái)減輕心肌I/R損傷，且這種效應(yīng)與TSA之間存在劑量依賴性[2]，心肌I/R的2 h內(nèi)予以TSA治療是減輕心肌I/R損傷的最佳時(shí)間窗[1]。

HMGB1在心肌I/R損傷中具有重要地位。在I/R動(dòng)物模型的心肌[8]及心肌梗死患者的血[9]中均觀察到HMGB1的上調(diào)表達(dá)。缺血損傷后的心臟組織釋放HMGB1通過(guò)脾晚期糖基化終產(chǎn)物(receptors of advanced glycation end products,RAGE)途徑激活白細(xì)胞，并促使白細(xì)胞遷移到損傷的心肌組織，導(dǎo)致再灌注時(shí)梗死的加重[10]。依賴于HMGB1/NF-κB通路的NLRP3炎性小體的激活，可以促進(jìn)IL-1β、IL-18等炎性因子的釋放，并加重了組織細(xì)胞的損傷[11]。下調(diào)HMGB1-TLR4(Toll like receptor 4)/NF-κB信號(hào)途徑可以減輕心肌I/R損傷[12]。氧化應(yīng)激和亞硝化應(yīng)激在I/R中控制HMGB1的表達(dá)和釋放，四磺基苯基鐵卟啉[5,10,15,20-tetrakis-(4-sulfonatophenyl)phosphyrinato-iron(Ⅲ),FeTPPS]是一種選擇性過(guò)氧化物清除劑，能顯著降低I/R誘導(dǎo)的心肌HMGB1表達(dá)和減輕損傷[13]。槲皮素、雷公藤紅素等草藥，在I/R中也具有抑制HMGB1上調(diào)表達(dá)和保護(hù)心肌的作用[3]。上述研究說(shuō)明抑制HMGB1表達(dá)及相關(guān)通路的激活有助于緩解I/R損傷。

至于外源性HMGB1對(duì)心肌I/R損傷的影響如何，既往的研究結(jié)論不一致。用重組HMGB1(10 μg/只，腹腔注射)預(yù)處理，加重了心肌損傷，增加了心梗面積[8]，HMGB1的作用依賴于RAGE/MAPKs/NF-κB和TLR2的激活，因?yàn)镽age-/-和Tlr2-/-小鼠即便使用HMGB1也能免受I/R損傷[3]。而另有學(xué)者同樣用重組HMGB1進(jìn)行干預(yù)處理，則發(fā)現(xiàn)外源性HMGB1可以抑制炎性反應(yīng)，減輕氧化應(yīng)激，減輕心肌的I/R損傷[14]。以上結(jié)果的不一致可能與給藥的時(shí)機(jī)、途徑和劑量相關(guān)，但最終與HMGB1的氧化還原狀態(tài)有關(guān)[3]?；贖MGB1結(jié)構(gòu)中半胱氨酸的氧化還原狀態(tài)，HMGB1有3種形式：完全還原型HMGB1(fully reduced HMGB1，fr-HMGB1)、二硫化HMGB1(disulfide HMGB1，ds-HMGB1)和氧化型HMGB1(oxidized HMGB1，ox-HMGB1)。fr-HMGB1和ds-HMGB1具有對(duì)立的作用，fr-HMGB1發(fā)揮趨化作用，能使巨噬細(xì)胞向再生表型形成，ds-HMGB1能刺激免疫細(xì)胞產(chǎn)生促炎細(xì)胞因子/趨化因子，而ox-HMGB1在炎性反應(yīng)晚期出現(xiàn)，可能與再生修復(fù)相關(guān)，可影響中性粒細(xì)胞的激活狀態(tài)[3]。心臟損傷產(chǎn)生活性氧(reactive oxygen species，ROS)的濃度水平調(diào)控fr-HMGB1向ds-HMGB1和ox-HMGB1轉(zhuǎn)化程度，不同狀態(tài)的心肌，三者的比例不一樣，產(chǎn)生的作用也不一樣，這能解釋各種心肌損傷實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭惺褂猛庠葱訦MGB1卻觀察到了不同的結(jié)果[3]。

總之，HMGB1在TSA對(duì)心肌I/R損傷的影響中具有重要作用，可能成為針對(duì)I/R損傷治療的潛在靶點(diǎn)[15]，但仍需要更多的臨床和基礎(chǔ)研究來(lái)進(jìn)一步闡明其復(fù)雜機(jī)制。