鄭 研，李 嵐，高秋英，牛 奔，張維華

(陜西省人民醫(yī)院 血液內(nèi)科，陜西 西安 710068)

慢性髓系白血病(簡(jiǎn)稱慢粒)(chronic myeloid leuke-mia，CML)是一種以費(fèi)城染色體和斷裂點(diǎn)簇集區(qū)-艾貝爾遜白血病病毒(breakpoint cluster region-abelson leukemia virus，BCR-ABL)融合基因?yàn)樘卣鞯墓撬柙錾约膊?。BCR-ABL具有高酪氨酸激酶活性，可激活如絲裂原活化蛋白激酶、Janus激酶/信號(hào)傳導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活子和磷脂酰肌醇3-激酶等多種通路的信號(hào)活性。這些通路的激活可增加B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2(B-cell lymphoma/lewkmia-2，Bcl-2)蛋白的表達(dá)，最終促進(jìn)CML細(xì)胞惡性增殖[1-2]。雖然伊馬替尼(imatinib，IM)、尼羅替尼和達(dá)沙替尼等酪氨酸激酶抑制劑(tyrosine kinase inhibitors，TKIs)能明顯改善CML患者的預(yù)后并延長(zhǎng)預(yù)期壽命，但依然約有20%的患者TKIs耐藥[3]。因此，逆轉(zhuǎn)TKIs耐藥性對(duì)CML的治療具有重要意義。

近年來(lái)，微小RNAs(microRNAs,miRNAs)被廣泛認(rèn)為是調(diào)節(jié)包括CML在內(nèi)的多種癌進(jìn)展以及化學(xué)耐藥的關(guān)鍵參與者[4]。但miRNA種類繁多，其在CML的分子機(jī)制仍未得到很好的闡明。業(yè)已發(fā)現(xiàn)，miR-140是胃癌、骨肉瘤和結(jié)腸癌中的抑癌基因[5-7]。盡管miR-140在多種類型的癌中具有強(qiáng)烈的抗腫瘤作用，但其在CML中調(diào)節(jié)化學(xué)耐藥的潛在機(jī)制仍未完全明確。因此，本研究以IM敏感CML細(xì)胞KBM5和IM耐藥CML細(xì)胞KBM5R為材料，旨在研究miR-140對(duì)KBM5R的IM敏感性的影響以及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞：人CML細(xì)胞系KBM5(上海傳秋生物科技有限公司)。

1.1.2 試劑和試劑盒：胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基和Lipofectamine 2000(Invitrogen公司)；TaqMan miRNA分離試劑盒、TaqMan microRNA測(cè)定試劑盒和TaqMan Universal PCR Master Mix(Applied Biosystems公司)；miR-140 mimic和陰性對(duì)照(miR-NC)(由上海吉瑪公司合成)；快速點(diǎn)突變?cè)噭┖?Agilent公司)；Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑及蛋白質(zhì)提取和定量試劑盒(陜西脈元生物科技有限公司)；抗cleaved caspase-3和Bcl-2抗體(CST公司)；CCK-8法細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒和JC-1染色試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)；抗 β-actin抗體和辣根過(guò)氧化酶標(biāo)記的IgG二抗(北京百奧萊博科技有限公司)；伊馬替尼(IM，純度≥99%)(上海阿拉丁生化科技股份有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞的培養(yǎng)與IM耐藥細(xì)胞株KBM5R構(gòu)建：將KBM5細(xì)胞接種在含有10%胎牛血清、1%青霉素和1%鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中，置于在37 ℃、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。按照文獻(xiàn)[3]方法，將KBM5細(xì)胞通過(guò)暴露在濃度遞增的IM中，獲得IM耐藥的KBM5R細(xì)胞株。

1.2.2 細(xì)胞的轉(zhuǎn)染：在轉(zhuǎn)染細(xì)胞前，先將KBM5R細(xì)胞接種在無(wú)血清、青霉素和鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中12 h，然后根據(jù)轉(zhuǎn)染試劑的說(shuō)明書(shū)步驟，用Lipofectamine 2000試劑分別將60 nmol/L的miR-140 mimic或miR-NC轉(zhuǎn)入細(xì)胞。轉(zhuǎn)染后48 h，收集細(xì)胞，用RT-qPCR檢測(cè)miR-140 mimic的轉(zhuǎn)染效率后，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 RT-qPCR檢測(cè)miR-140相對(duì)表達(dá)量：用TaqMan miRNA分離試劑盒從KBM5和KBM5R細(xì)胞以及已轉(zhuǎn)染miR-140 mimic或miR-NC的KBM5R細(xì)胞中提取miRNAs。用TaqMan microRNA測(cè)定試劑盒進(jìn)行miRNA定量的測(cè)定。用TaqMan Universal PCR Master Mix反應(yīng)試劑盒和各引物在ABI 7500實(shí)時(shí)定量PCR(qPCR)系統(tǒng)進(jìn)行分析。反應(yīng)條件為95 ℃ 10 min，然后進(jìn)行40個(gè)循環(huán)(95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min)。用2-△△Ct法計(jì)算miR-140相對(duì)于內(nèi)部對(duì)照U6的表達(dá)量。引物的序列如下：miR-140 (正向)：5′-GAGTGTCAGTGGTTTTACCCT-3′，miR-140 (反向)：5′-GCAGGGTCCGAGGTATTC-3′；U6(正向)：5′-CTCGCTTCGGCAGCACATATACT-3′，U6(反向)：5′-ACGCTTCACGAATTTGCGTGTC-3′。

1.2.4 CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活力：將已轉(zhuǎn)染miR-140 mimic或miR-NC的KBM5R細(xì)胞以3×106個(gè)細(xì)胞/mL接種到6孔培養(yǎng)板中，分別用0、25、50、75和100 nmol/L的IM處理24 h。每孔加入10 μL CCK-8試劑，并在37 ℃溫育4 h后，用酶標(biāo)儀在波長(zhǎng)450 nm處檢測(cè)吸光度(A)值。

1.2.5 Annexin V-FITC/PI染色流式細(xì)胞測(cè)量術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡：用100 nmol/L的IM將已轉(zhuǎn)染miR-140 mimic或miR-NC的KBM5R細(xì)胞處理24 h后，PBS洗滌細(xì)胞2次，用無(wú)EDTA的胰蛋白酶消化，收集細(xì)胞。 按照試劑盒說(shuō)明書(shū)步驟，在室溫避光下進(jìn)行annexin V-FITC和 PI染色。用流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞凋亡。

1.2.6 JC-1染色評(píng)估線粒體膜電位：用100 nmol/L的IM將已轉(zhuǎn)染miR-140 mimic或miR-NC的KBM5R細(xì)胞處理24 h后，在37 ℃避光下進(jìn)行JC-1染色。用熒光顯微鏡拍照，并用Image J軟件分析紅色熒光和綠色熒光的熒光強(qiáng)度。

1.2.7 熒光素酶活性分析驗(yàn)證miR-140與Bcl-2的靶向關(guān)系： miRanda在線軟件(http://www.microrna. org/microrna/home.do)預(yù)測(cè)Bcl-2的3′UTR中存在miR-140結(jié)合位點(diǎn)。用點(diǎn)突變?cè)噭┖袑㈩A(yù)測(cè)Bcl-2基因3′UTR與miR-140結(jié)合的位點(diǎn)的基因序列進(jìn)行點(diǎn)突變，并用PCR將Bcl-2基因的3′UTR以及已點(diǎn)突變的3′UTR的基因序列擴(kuò)增并分別插入熒光載體中，構(gòu)建野生型(WT)Bcl-2 3′UTR和突變型(MUT)Bcl-2 3′UTR熒光載體質(zhì)粒。用Lipofectamine 2000將miR-140 mimic或miR-NC以及WT-Bcl-2 3′UTR或MUT-Bcl-2 3′UTR質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染48 h后，通過(guò)雙熒光素酶報(bào)告分析系統(tǒng)分析熒光素酶活性。

1.2.8 Western blot檢測(cè)Bcl-2和cleaved caspase-3的表達(dá)：分別取KBM5和KBM5R細(xì)胞、已轉(zhuǎn)染miR-140 mimic或miR-NC的KBM5R細(xì)胞以及100 nmol/L IM處理24 h的已轉(zhuǎn)染miR-140 mimic或miR-NC的KBM5R細(xì)胞，提取細(xì)胞的蛋白質(zhì)，并定量蛋白的濃度。按照常規(guī)程序，用Western blot檢測(cè)Bcl-2、cleaved caspase-3相對(duì)與內(nèi)參β-actin的相對(duì)表達(dá)水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 miR-140在KBM5和KBM5R細(xì)胞中的表達(dá)

KBM5R細(xì)胞中miR-140的表達(dá)水平為0.25±0.13明顯低于KBM5細(xì)胞的0.99±0.04(P<0.01)。

2.2 過(guò)表達(dá)miR-140對(duì)KBM5R細(xì)胞伊馬替尼敏感性的影響

與miR-NC組比較，miR-140 mimic轉(zhuǎn)染組中miR-140的表達(dá)水平明顯增加(P<0.01)；在25～100 nmol/L的IM存在的條件下，與miR-NC組比較，miR-140 mimic轉(zhuǎn)染組的細(xì)胞活力明顯降低(P<0.01或P<0.001)；在100 nmol/L的IM條件下，與miR-NC組比較，miR-140 mimic轉(zhuǎn)染組的細(xì)胞凋亡明顯增加(P<0.001)(圖1)。

A.after transfected into KBM5R cells with miR-NC or miR-140 mimic, the expression level of miR-140 was detected by RT-qPCR; B.KBM5R cells transfected with miR-NC or miR-140 mimic were treated with 25-100 nmol/L IM for 24 hours； Cell viability was detected by CCK-8 assay; C-D.KBM5R cells transfected with miR-NC or miR-140 mimic were treated with 100 nmol/L IM for 24 hours; Cell apoptosis was detected by flow cytometry; *P<0.01, **P<0.001 compared with miR-NC group

2.3 過(guò)表達(dá)miR-140對(duì)KBM5R細(xì)胞的線粒體膜電位和cleaved caspase-3表達(dá)的影響

在100 nmol/L的IM條件下，與miR-NC組比較，miR-140 mimic轉(zhuǎn)染組線粒體膜電位明顯降低[表現(xiàn)為綠色熒光強(qiáng)度/紅色熒光強(qiáng)度明顯增加(P<0.001)]，cleaved caspase-3表達(dá)水平明顯增加(P<0.001)(圖2)。

A,B.KBM5R cells transfected with miR-NC or miR-140 mimic were treated with 100 nmol/L IM for 24 hours; Mitochondrial membrane potential was detected by JC-1 staining (scale bar=10 μm); C.cleaved caspase-3 expression was detected by Western blot; *P<0.001 compared with miR-NC group

2.4 Bcl-2是miR-140的靶標(biāo)

與KBM5細(xì)胞相比，KBM5R細(xì)胞中Bcl-2表達(dá)水平明顯增加(P<0.001)(圖3A)；與miR-NC組比較，miR-140 mimic轉(zhuǎn)染組Bcl-2表達(dá)水平明顯降低(P<0.001)(圖3B)；Bcl-2是miR-140的靶基因(圖3C)。

A.expression of Bcl-2 in KBM5 and KBM5R cells was detected by Western blot; B.expression of Bcl-2 in KBM5R cells transfected with miR-NC or miR-140 mimic was detected by Western blot; C.Bcl-2 and miR-140 targeted binding sites predicted by miRanda software; D.targeting relationship between Bcl-2 and miR-140 was verified by fluorescence activity analysis; *P<0.001 compared with miR-NC group

3 討論

盡管已經(jīng)進(jìn)行了許多研究試圖克服對(duì)抗癌藥的耐藥性，但化療耐藥仍然是目前治療CML患者的主要障礙。CML最常見(jiàn)的耐藥機(jī)制是ABL激酶結(jié)構(gòu)域(kinase domain，KD)點(diǎn)突變，其在耐藥CML患者中約占50%，尤其是獲得性耐藥患者[8]。TKIs的主要治療靶點(diǎn)即為ABL KD，而其突變嚴(yán)重阻礙TKIs與ABL激酶的結(jié)合，并最終影響CML的療效[9]。因此，必須發(fā)現(xiàn)除ABL KD之外的其他目標(biāo)，以優(yōu)化患者對(duì)TKIs的反應(yīng)。

關(guān)于miRNA參與調(diào)控腫瘤化療敏感性的作用的研究逐漸受到研究人員的關(guān)注。此前的研究已經(jīng)證實(shí)miR-140在多種腫瘤中發(fā)揮抑制腫瘤的作用[5-7]。最近研究[10]表明，miR-140可促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性。本研究使用IM耐藥CML細(xì)胞系KBM5R和正常CML細(xì)胞系KBM5探索了miR-140與IM耐藥之間的關(guān)系，并通過(guò)將miR-140 mimic轉(zhuǎn)染到KBM5R細(xì)胞中來(lái)研究過(guò)表達(dá)miR-140對(duì)IM敏感性的影響。結(jié)果顯示，miR-140在KBM5R中表達(dá)顯著下調(diào)，過(guò)表達(dá)miR-140能抑制KBM5R的增殖活性并促進(jìn)了細(xì)胞凋亡，降低線粒體膜電位和增加cleaved caspase-3表達(dá)。這些發(fā)現(xiàn)表明，miR-140表達(dá)降低可能是CML的IM耐藥的機(jī)制之一，而上調(diào)miR-140能增強(qiáng)KBM5R細(xì)胞對(duì)IM的敏感性。

MicroRNA(miRNA)是通過(guò)與靶mRNA的3′非翻譯區(qū)(3′-UTR)的堿基以互補(bǔ)配對(duì)結(jié)合方式負(fù)調(diào)控基因表達(dá)來(lái)發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)。因此，鑒定miR-140靶基因?qū)τ诶斫馄湓贑ML的IM耐藥中的作用非常重要。本研究發(fā)現(xiàn)，miR-140 在KBM5R中能夠直接靶向Bcl-2的3′-UTR并負(fù)調(diào)節(jié)Bcl-2蛋白表達(dá)。Bcl-2具有促進(jìn)細(xì)胞存活的作用，同樣抑制Bcl-2表達(dá)能抑制細(xì)胞活性和促進(jìn)細(xì)胞凋亡。最近的研究強(qiáng)調(diào)了Bcl-2在維持骨髓白血病干細(xì)胞干性和存活中的重要作用[11]。也有報(bào)道證明，Bcl-2抑制劑ABT-737和ABT-263可明顯增強(qiáng)TKIs誘導(dǎo)的原發(fā)性CML細(xì)胞死亡[12-13]。因此，這些結(jié)果證實(shí)miR-140通過(guò)靶向Bcl-2增強(qiáng)KBM5R的敏感性。

總之，本研究表明miR-140表達(dá)下調(diào)可能是導(dǎo)致CML的IM耐藥的關(guān)鍵因素，上調(diào)miR-140能通過(guò)Bcl-2增強(qiáng)KBM5R對(duì)藥物的敏感性。