李美崎，鄧 俊，王宋平

(西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科， 四川 瀘州 646000)

百草枯(paraquat,PQ)是一種非選擇性除草劑，對(duì)人體具有極強(qiáng)的毒性，進(jìn)入人體后，可引起多器官損傷，尤其是其可導(dǎo)致肺纖維化，病死率極高[1]。研究報(bào)道上皮細(xì)胞間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesen-chymal transition，EMT)的異常激活在肺纖維化過(guò)程中起重要作用，促進(jìn)膠原纖維的分泌和細(xì)胞外基質(zhì)的沉積，最終導(dǎo)致肺纖維化[2]?？鄥A(matrine)是一種天然的生物堿，提取于傳統(tǒng)中草藥苦參，具有多種生物活性，對(duì)呼吸系統(tǒng)具有平喘、抗急性肺損傷、抗纖維化作用等[3]。雖然有研究報(bào)道稱(chēng)，苦參堿能夠發(fā)揮抗纖維化作用，但苦參堿對(duì)百草枯所致肺纖維化是否也具有保護(hù)作用及其可能的作用機(jī)制尚不清楚，還有待進(jìn)一步研究。因此，本研究通過(guò)腹腔注射百草枯以誘導(dǎo)小鼠肺纖維化模型，探討苦參堿對(duì)百草枯誘導(dǎo)的模型小鼠肺纖維化的保護(hù)作用及其可能的作用機(jī)制，為其在臨床中運(yùn)用提供相關(guān)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：SPF級(jí)雌性BALB/C小鼠24只，6周齡，體質(zhì)量17～19 g[湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司,許可證號(hào)：SCXK(湘)2019-0004]，在溫度為23 ℃，濕度為40%～65%，12 h晝夜交替的封閉室內(nèi)條件下適應(yīng)性喂養(yǎng)2周，可自由進(jìn)食及飲水。

1.1.2 主要試劑：百草枯(北京百靈威科技有限公司)；苦參堿(上海麥克林生化科技有限公司，純度：98%)；羥脯氨酸(hydroxyproline,HYP)試劑盒(南京建成科技有限公司)；BSA(牛血清白蛋白)(Roche生物科技公司)；BCA蛋白質(zhì)濃度測(cè)定試劑盒、一抗稀釋液、二抗稀釋液(ASPEN科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 小鼠的分組及處理：將小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組(control)、百草枯(PQ)組和苦參堿(matrine)組，每組8只。一次性腹腔注射百草枯(18 mg/kg)以誘導(dǎo)肺纖維化并建立模型。建立模型24 h后，matrine組每天予以苦參堿(100 mg/kg)灌胃進(jìn)行干預(yù)治療，持續(xù)27 d。

1.2.2 HE染色觀察肺組織病理改變：將整個(gè)右肺組織用0.9%氯化鈉溶液充分沖洗，4%多聚甲醛室溫固定24 h以上，經(jīng)75%無(wú)水乙醇梯度脫水，石蠟包埋，室溫冷卻后制成4 μm厚度切片，進(jìn)行HE染色，在光鏡下觀察并拍照分析。

1.2.3 Masson染色及Ashcroft評(píng)分觀察肺組織膠原沉積：將肺組織進(jìn)行固定、脫水、石蠟包埋、切片，進(jìn)行Masson染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察肺組織膠原沉積情況，并拍照分析。參照文獻(xiàn)[4]，采用Ashcroft評(píng)分以評(píng)估肺組織纖維化程度，評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)為：0級(jí)，正常肺組織；1級(jí)，肺泡或細(xì)支氣管壁微小纖維增厚；2～3級(jí)，肺泡壁中度增厚，肺組織結(jié)構(gòu)無(wú)明顯損害；4～5級(jí)，纖維化加重，肺結(jié)構(gòu)明顯受損，形成纖維帶或小纖維團(tuán)塊；6～7級(jí)，肺組織結(jié)構(gòu)嚴(yán)重破壞，纖維面積大，可伴有蜂窩肺形成；8級(jí)，滿視野纖維組織，整個(gè)肺組織全部閉塞壞死。

1.2.4 羥脯氨酸含量的檢測(cè)：稱(chēng)取30 mg小鼠左肺肺組織，碾碎置于試管中，加入1 mL水解液并混勻，沸水浴充分水解20 min，NaOH調(diào)pH值至6.0～6.8左右，加入雙蒸水至10 mL，加入適量活性炭，混勻離心，取1 mL上清于波長(zhǎng)550 nm處，1 cm光徑，測(cè)定各管吸光度值，并計(jì)算肺組織羥脯氨酸含量。

1.2.5 Western blot檢測(cè)膠原蛋白含量：提取肺組織總蛋白，使用二喹啉甲酸(bicinchoninic acid,BCA)蛋白濃度測(cè)定試劑盒進(jìn)行蛋白定量，電泳分離，將分離的蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯膜(polyvinylidene fluoride，PVDF)上，封閉液室溫封閉1 h,加入一抗稀釋液(collagen Ⅰ、collagen Ⅲ，1∶500)4 ℃孵育過(guò)夜，通過(guò)TBST緩沖液清洗PVDF膜3次，加入山羊抗兔二抗(1∶10 000)室溫孵育30 min，采用化學(xué)發(fā)光劑(ECL)顯影，并分析目標(biāo)帶吸光度值。

1.2.6 免疫熒光檢測(cè)EMT相關(guān)蛋白表達(dá)：取包埋好的石蠟切片，放入5%牛血清白蛋白(BSA)中封閉20 min。封閉后分別加入一抗(鼠抗 anti-α-SMA，1∶500，鼠抗 anti-E-cardherin，1∶1 000，鼠抗 anti-vimentin,1∶200)4 ℃孵育過(guò)夜,充分洗滌后，加入相應(yīng)種屬比例的二抗(1∶50)，37 ℃孵育50 min,再用PBS洗滌3次，最后DAPI避光復(fù)染細(xì)胞核5 min，封片后在熒光顯微鏡下觀察。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 一般情況

對(duì)照組小鼠精神狀態(tài)良好，進(jìn)食、飲水正常，體質(zhì)量穩(wěn)定增加；PQ組小鼠精神萎靡，呼吸急促，活動(dòng)減少，易抓捕，進(jìn)食、飲水減少，體質(zhì)量下降；matrine組小鼠較模型組小鼠癥狀有所改善。

2.2 HE染色

對(duì)照組小鼠肺組織結(jié)構(gòu)正常，未見(jiàn)明顯形態(tài)學(xué)改變；PQ組小鼠肺組織結(jié)構(gòu)明顯破壞，部分肺泡塌陷，大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；而matrine組小鼠肺組織炎性細(xì)胞浸潤(rùn)及肺組織結(jié)構(gòu)破壞程度較模型組小鼠有所減輕(圖1)。

圖1 各組小鼠肺組織結(jié)構(gòu)對(duì)比(HE染色)Fig 1 Comparison of lung tissue of mice in each group(HE staining,×400)

2.3 Masson染色

對(duì)照組小鼠未見(jiàn)明顯膠原沉積現(xiàn)象；PQ組小鼠肺泡形態(tài)改變，可見(jiàn)藍(lán)色膠原纖維沉積，而matrine組小鼠肺組織也可見(jiàn)膠原纖維沉積，但較PQ組得到改善(圖2)。

圖2 各組小鼠肺組織對(duì)比(Masson染色)Fig 2 Comparison of lung tissue of mice in each group(Masson staining,×400)

2.4 Ashcroft評(píng)分

與對(duì)照組比較，PQ組小鼠Ashcroft評(píng)分明顯升高(P<0.001)，與PQ組比較，經(jīng)matrine治療后，Ashcroft評(píng)分有所下降(P<0.001)(表1)。

表1 各組小鼠肺組織Ashcroft評(píng)分比較

2.5 羥脯氨酸含量的比較

與對(duì)照組比較，PQ組肺組織羥脯氨酸含量增高(P<0.001)，與PQ組小鼠比較，matrine治療后可降低肺組織羥脯氨酸的含量(P<0.001)(圖3)。

*P<0.05 compared with control group; #P<0.05 compared with PQ group圖3 各組小鼠羥脯氨酸含量對(duì)比Fig 3 Comparison of hydroxyproline content in lung tissue of each

2.6 肺組織纖維膠原蛋白相關(guān)蛋白表達(dá)的比較

與對(duì)照組小鼠肺組織中collagenⅠ、collagen Ⅲ蛋白表達(dá)比較，PQ組肺組織中collagenⅠ、collagen Ⅲ蛋白表達(dá)升高(P<0.001)；而matrine組小鼠肺組織中collagenⅠ、collagenⅢ蛋白表達(dá)較PQ組有所降低(P<0.001)(圖4)。

*P<0.05 compared with control group; #P<0.05 compared with PQ group圖4 Western blot檢測(cè)各組小鼠肺組織collagenⅠ、collagen Ⅲ蛋白表達(dá)

2.7 肺組織EMT相關(guān)蛋白表達(dá)的比較

與對(duì)照組比較，PQ造模后小鼠肺組織中上皮性鈣黏附蛋白(E-cardherin)含量降低(P<0.001)，而α-平滑肌蛋白(α-SAM)和波形蛋白(vimentin)含量升高(P<0.001)，matrine組小鼠與PQ組相比，E-cardherin蛋白含量升高(P<0.001)，而α-SAM和vimentin蛋白含量降低(P<0.05，P<0.001)(圖5)。

Blue represented the nucleus and red was the target protein：E-cardherin, α-SMA and vimentin proteins(×400); *P<0.05 compared with control group; #P<0.05 compared with PQ group

3 討論

百草枯(PQ)是一種速效、非選擇性的除草劑，因其具有價(jià)格低廉、低污染等特點(diǎn)，而廣泛應(yīng)用于多數(shù)發(fā)展中國(guó)家[5]。其可通過(guò)呼吸道、消化道、皮膚等途徑進(jìn)入人體，對(duì)人體具有極大的毒性，高劑量的PQ可導(dǎo)致包括心、肺、腎、肝和腦在內(nèi)的多個(gè)器官衰竭[6]。有研究報(bào)道，當(dāng)PQ進(jìn)入人體后，肺由于其強(qiáng)大的多胺攝取系統(tǒng)而成為主要的蓄積點(diǎn)，其肺濃度比血漿濃度高6～10倍，因此，肺是PQ病理作用的一個(gè)特定靶點(diǎn)[7]。PQ進(jìn)入人體后，在肺泡上皮細(xì)胞中積累，導(dǎo)致肺組織損傷，早期可表現(xiàn)為肺泡充血、水腫、肺泡壁結(jié)構(gòu)破壞以及各種炎性細(xì)胞的浸潤(rùn)和滲出，進(jìn)一步發(fā)展為成纖維細(xì)胞增生和過(guò)度膠原沉積，最后進(jìn)展為肺纖維化[8]。百草枯中毒所致的肺纖維化目前尚無(wú)有效治療方法，臨床上主要使用糖皮質(zhì)激素、 免疫抑制劑、 抗氧化治療等， 但治療效果不佳，病死率極高[9]。因此開(kāi)發(fā)有效的藥物治療肺纖維化是必要的。

苦參堿是中草藥苦參中含量最高的生物堿，具有廣泛的生物作用，據(jù)報(bào)道，苦參堿對(duì)人類(lèi)上皮細(xì)胞相關(guān)疾病具有潛在的治療功效[10]，已有相關(guān)研究報(bào)道，苦參堿能夠通過(guò)抑制JAK-STAT信號(hào)傳導(dǎo)途徑發(fā)揮抗博來(lái)霉素所誘導(dǎo)的肺纖維化作用[11]。而博來(lái)霉素和百草枯所誘導(dǎo)的肺纖維化在表型上相似，但兩者基因調(diào)控方式及數(shù)量是不同的[12]。那么，苦參堿是否可以減輕百草枯所誘導(dǎo)的肺纖維化，還有待進(jìn)一步研究。

肺纖維化的主要特征是正常肺組織結(jié)構(gòu)的破壞、成纖維細(xì)胞的活化及細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)的沉積[13]。在肺纖維化中，細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分為I型膠原蛋白和Ⅲ型膠原蛋白，羥脯氨酸是一種非蛋白原性、非必需的氨基酸，是膠原蛋白的主要成分，對(duì)膠原蛋白的合成和穩(wěn)定起著關(guān)鍵作用，因此，羥脯氨酸是反映膠原沉積程度的重要標(biāo)志物[14]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組比較，模型組的羥脯氨酸、膠原蛋白Ⅰ及膠原蛋白Ⅲ含量明顯升高，而予以苦參堿干預(yù)后，上述指標(biāo)含量有所下降，病理學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)肺纖維化程度有所減輕。說(shuō)明，苦參堿可降低百草枯誘導(dǎo)的肺纖維化小鼠肺組織膠原蛋白的合成與積累。

研究表明，EMT是纖維細(xì)胞最重要的來(lái)源之一，Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞通過(guò)EMT獲得成纖維細(xì)胞表型后，產(chǎn)生大量的細(xì)胞外基質(zhì)，促進(jìn)肺纖維化的發(fā)展[15]。EMT的典型特征是極性喪失、細(xì)胞骨架重組、上皮形態(tài)和標(biāo)志物(包括E-cadherin和occludens-1)的喪失，以及間充質(zhì)形態(tài)和標(biāo)志物(如α-SMA、vimentin)的獲得[16]。本研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)苦參堿治療后，小鼠纖維化肺組織中E-cadherin蛋白的表達(dá)有所增加，而α-SMA和vimentin蛋白的表達(dá)有所降低，抑制EMT作用，從而減少細(xì)胞外基質(zhì)的沉積。

綜上所述，苦參堿可通過(guò)抑制EMT作用，從而抑制膠原蛋白的合成和積累，減輕百草枯誘導(dǎo)的肺纖維化作用。本研究為臨床應(yīng)用苦參堿治療百草枯中毒所致肺纖維化提供了新的參考依據(jù)。